本發(fā)明涉及一種密閉式慢病毒載體培養(yǎng)裝置和培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

哺乳動物蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因表達可能將正常的體細胞轉(zhuǎn)化為腫瘤發(fā)生的狀態(tài)，例如p53和Rb路徑的失活會導致顯負性p53蛋白(p53DD)的表達，一個激活細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)/細胞周期蛋白復合體(cyclinD1/CDK4^R24C)與原癌基因的激活,Ras,和hTERT通路通過致癌的表達形式的原癌基因(c-Myc^T58A),H-Ras(H-Ras^G12V)和hTERT,可以驅(qū)動不同的人類細胞轉(zhuǎn)化致瘤的狀態(tài)。研究報道稱使用上述的致癌基因組合可以使正常細胞發(fā)生致癌細胞轉(zhuǎn)化，這表明正常的肝細胞可能用于基因工程以幫助研究發(fā)現(xiàn)在人體癌癥的正常轉(zhuǎn)化過程，當它回到宿主肝細胞中時可以形成腫瘤。

慢性病毒載體可以轉(zhuǎn)導不可復制細胞同時需要編碼腫瘤細胞，細胞培養(yǎng)實驗需要在生物安全等級為3級的密閉實驗室中進行。然而目前的生物醫(yī)學試驗所使用的培養(yǎng)裝置仍然不能很好的保護試驗人員。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決目前技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提出了一種密閉式慢病毒載體培養(yǎng)裝置和培養(yǎng)方法，該發(fā)明為密閉系統(tǒng)，不會產(chǎn)生慢病毒氣溶膠，由于不會直接與慢病毒培養(yǎng)液接觸，可有效保護試驗人員。

為了實現(xiàn)上述技術(shù)目的，達到上述技術(shù)效果，發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種密閉式慢病毒載體培養(yǎng)裝置和培養(yǎng)方法，培養(yǎng)裝置由盒體、閥門、連接管、Q-syte分隔膜密閉式無針接頭、Luer-Lock注射器、過濾器和密閉栓組成；

所述的盒體由上盒片和下盒片緊密貼合組成，上盒片和下盒片固定于剛性框架下，上盒片和下盒片中心部位向盒體外側(cè)凹入形成矩形容積腔，在盒體的左右兩側(cè)各有一個變截面圓柱狀通道，通道內(nèi)固定有變截面圓柱狀的母槽連接管；

所述的Luer-Lock注射器的接頭為螺旋接頭。

2、一種密閉式慢病毒載體培養(yǎng)裝置和培養(yǎng)方法，慢性病毒載體培養(yǎng)方法包含以下步驟：

步驟一、試劑的制備：

(1)轉(zhuǎn)導質(zhì)粒的制備：首先使用PCR對hTERT+p53^DD、cyclinD1+CDK4^R24C和c-myc^T58A+HRas^G12V進行增強處理，在CMVV5-LUC受體質(zhì)粒上的XmaI和KpnI部位之間克隆三個插入序列，并對插入序列進行熒光素酶標記基因操作，得到熒光素標記的pLenti-hTERT+53^DD、pLenti-cyclinD1+CDK4^R24C和pLenti-c-myc^T58A+HRas^G12V質(zhì)粒，使用熒光素酶pLenti-CMVV5作為控制熒光素酶報告基因的控制質(zhì)粒；

(2)293T細胞和Huh7.5.1細胞的細胞培養(yǎng)基(CM)制備：向細胞培養(yǎng)基中添加體積比為10％的滅活胎牛血清，體積比為1％的非必需氨基酸，10ug/mL的慶大霉素；使用0.22um的過濾器過濾后在4℃的環(huán)境中保存最多兩個月；

(3)原代肝細胞(PPH)培養(yǎng)基(WM)制備：向500mL的William’s E培養(yǎng)基添加10mL的質(zhì)量體積比為7.5％的牛血清蛋白，5mL的ITS-G，10^-7M的地塞米松溶液，體積比為1％的非必需氨基酸，體積比為1％的青霉素和鏈霉素的混合溶液，體積比為1％的穩(wěn)定性谷氨酸；使用0.22um的過濾器過濾后保存在-80℃的環(huán)境中；

(4)原代肝細胞(PPH)離析：將肝切成小塊組織立即置于含冰塊的生理鹽水中，在切割表面上插入可視裝置，然后在pH為7.4和37℃的環(huán)境中使用500mL的緩沖液對肝組織進行灌洗，緩沖液中包含8.3g/L的NaCl、0.5g/L的KCl、2.4g/L的HEPES，0.19g/L的EGTA；使用包含100g的IV型膠原酶、3.9g/L的NaCl、0.5g/L的KCl、2.4g/L的HEPES和0.7g/L的CaCl₂·H₂O的400mL緩沖液在37℃的環(huán)境中進行第二次灌洗；使用IV型的膠原酶循環(huán)灌注，然后移除大塊的肝組織，輕輕搖動存儲在冰水中的包含有2.4g/L的HEPESD的HBSS緩沖液即可得到靶細胞；將含有靶細胞的懸浮液通過尼龍網(wǎng)過濾后在4℃的環(huán)境中沖洗三次；使用Trypan試劑排斥實驗驗證得到的肝細胞的可用性；立即使用合格的細胞或者凍結(jié)在-80℃的添加有10％的胎牛血清溶液中以代用；

步驟二、在密閉式慢病毒載體培養(yǎng)裝置中得到慢病毒上清液：

(1)培養(yǎng)裝置和293T細胞的準備工作：將閥門分別連接培養(yǎng)裝置的兩側(cè)，在閥門上連接兩端為公槽的連接管，左側(cè)的連接管上連接0.22um的過濾器，右側(cè)的連接管連接Luer-Lock注射器；50mL的試管中含有12mL的CM培養(yǎng)基，將293T細胞數(shù)量倍增至3.0～7.5×10⁶，使用Luer-Lock注射器吸入2mL空氣后吸入10mL的細胞懸浮液；

(2)慢病毒上清液制備過程：向培養(yǎng)裝置中第一次注入10mL的293T細胞懸浮液，然后將培養(yǎng)裝置置于37℃和濃度為5％的CO₂的條件下孵化6-8小時；使用注射器將培養(yǎng)裝置里的細胞懸浮液抽出，然后再次向培養(yǎng)裝置中注入10mL的細胞懸浮液，將培養(yǎng)裝置置于37℃和濃度為5％的CO₂的條件下孵化24小時；向培養(yǎng)裝置后注入10mL的CM培養(yǎng)基后使用注射器抽出懸浮液，再次注入10mL的CM培養(yǎng)基，在37℃和濃度為5％的CO₂的條件下孵化1小時；向1.5mL的Eppendorf試管中加入500uL的無菌水、8.1ug的HIV-gap-pol質(zhì)粒、8.1ug的pbabe-hTERT+p53^DD、pbabe-cyclinD1+CDK4^R24C或者pbabe-cmycT58A+HRas^G12V質(zhì)粒、2.7ug的pMD2 VSV-G-Env質(zhì)粒和62uL的CaCl₂ 2M；向5mL的試管中添加500uL的HBS 2x并輕微旋轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)在室溫條件下孵化20分鐘，然后添加9mL的CM培養(yǎng)基；將含有2mL氣體和10mL的轉(zhuǎn)染混合物注入培養(yǎng)裝置中，然后注入CM培養(yǎng)基，在37℃和CO₂濃度5％的環(huán)境中孵化24小時；使用注射器注入10mL的CM培養(yǎng)基然后抽出，然后再注入10mL的CM培養(yǎng)基，將培養(yǎng)裝置置于在37℃和CO₂濃度5％的環(huán)境中孵化24小時；將培養(yǎng)裝置左側(cè)0.22um的過濾器更換為0.45um的過濾器，同時過濾器連接第二個培養(yǎng)裝置，在第二個培養(yǎng)裝置的右側(cè)連接0.22um的過濾器，第一個培養(yǎng)裝置連接注射器，使用充滿空氣的注射器將第一個培養(yǎng)裝置的細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到第二個培養(yǎng)裝置中，將第二個培養(yǎng)裝置上的所有連接管拆下，即可得到慢病毒上清液，將得到的上清液培養(yǎng)置于-80℃的條件下直接凍結(jié)；

步驟三、在密閉式慢病毒載體培養(yǎng)裝置中對原代肝細胞(PPH)轉(zhuǎn)染：

將PPH懸浮液注入培養(yǎng)裝置中，置于37℃和濃度5％的CO₂環(huán)境中孵化4小時，然后將培養(yǎng)裝置正反面調(diào)換，調(diào)換后置于37℃和濃度5％的CO₂環(huán)境中孵化4小時；將步驟二得到的慢病毒載體置于37℃的水中解凍，將含有肝細胞懸浮液的培養(yǎng)裝置與慢病毒上清液的培養(yǎng)裝置連接一起；使用注射器抽入空氣后連接到慢病毒培養(yǎng)裝置上，將慢病毒上清液轉(zhuǎn)移到PPH細胞懸浮液中，將裝置置于37℃和CO₂濃度5％的環(huán)境中48小時；將孵化得到的轉(zhuǎn)染慢病毒的PPH細胞懸浮液中注入添加有10％胎牛血清的低溫貯藏介質(zhì)，將得到的轉(zhuǎn)導PPH細胞懸浮液培養(yǎng)裝置置于-80℃低溫下凍結(jié)。

優(yōu)選的，所述的上下盒片面積為25cm²，上下盒片為透氣和透明的材料制成。

本發(fā)明的有益效果是：提出了一種密閉式慢病毒載體培養(yǎng)裝置和培養(yǎng)方法，該發(fā)明所用的裝置可隔絕試驗內(nèi)部與外部的環(huán)境，不會產(chǎn)生慢病毒氣溶膠，在密閉的培養(yǎng)環(huán)境中操作可避免與慢病毒培養(yǎng)液直接接觸，可有效防止試驗人員感染；同時提出的培養(yǎng)方法得到的慢病毒載體與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法得到的載體有相同的轉(zhuǎn)導效率和轉(zhuǎn)染效果。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術(shù)方案，下面將對實施例描述所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是密閉式慢病毒載體培養(yǎng)裝置結(jié)構(gòu)圖；

圖2是所述的培養(yǎng)裝置的部件連接示意圖；

圖3是所述的兩個培養(yǎng)裝置的連接示意圖；

圖4是3天后使用OCS系統(tǒng)和CCS系統(tǒng)進行培養(yǎng)后致癌基因編碼LVs轉(zhuǎn)導效率對比圖，圖中縱坐標為生物熒光酶活性，橫坐標為不同的編碼的致癌基因；

圖5是使用OCS系統(tǒng)和CCS系統(tǒng)轉(zhuǎn)導PPH效果對比圖，圖中縱坐標為生物熒光酶活性；

圖6是缺失表達能力的質(zhì)粒和正常的質(zhì)粒感染PPH效果對比圖；

圖7是注入慢病毒載體的小鼠在第0天、第2天和第6天的熒光素酶活性檢測圖。

附圖中，各標號所代表的部件列表如下：

1-盒體，11-盒片，12-容積腔，13-母槽連接管，2-閥門，3-連接管，4-Q-syte接頭，5-Luer-Lock注射器，6-過濾器，61-0.22um過濾器，62-0.45um過濾器。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

請參閱圖1-3所示，培養(yǎng)裝置由盒體(1)、閥門(2)、連接管(3)、Q-syte分隔膜密閉式無針接頭(4)、Luer-Lock注射器(5)、過濾器(6)和密閉栓(7)組成；盒體(1)由上盒片和下盒片緊密貼合組成，上盒片和下盒片固定于剛性框架下，上盒片和下盒片中心部位向盒體(1)外側(cè)凹入形成矩形容積腔(12)，在盒體(1)的左右兩側(cè)各有一個變截面圓柱狀通道，通道內(nèi)固定有變截面圓柱狀的母槽連接管(13)；Luer-Lock注射器(5)的接頭為螺旋接頭。

試驗步驟

1、材料

1.1試劑

1.2 裝置

1.2.1 生物安全柜

1.2.2 37℃和5％CO2的孵化器

1.2.3 水浴

1.2.4 倒置顯微鏡

1.2.5 -80℃冷凍器

1.3 細胞

1.3.1 293T細胞

1.3.2 原代肝細胞

1.3.3 Huh7.5.1細胞

2、方法建立及注意事項

2.1一般方法

CCS系統(tǒng)由25cm²的盒片和連接裝置組成，培養(yǎng)裝置是一個緊密的細胞培養(yǎng)盒體，盒體由兩個培養(yǎng)面組成，培養(yǎng)面固定在一個剛性框架上通過標準Luer-Lock連接口連接形成一個無菌的細胞培養(yǎng)腔體，培養(yǎng)表面是平的、透明的并具有透氣性能。CCS系統(tǒng)用來培養(yǎng)293T細胞(LVs制品)和PPH(用于轉(zhuǎn)導實驗)，該系統(tǒng)與使用OCS系統(tǒng)在10cm²的Petri盤體上培養(yǎng)細胞類似。在OCS系統(tǒng)中慢性病毒(LVs)和PPH培養(yǎng)上層清液中存在的VSV-G-pseudotyped粒子可以使用Huh7.5.1細胞檢測出來。只有在CCS系統(tǒng)中培養(yǎng)實施步驟才可以細化。

2.2在CCS中管理液體轉(zhuǎn)移

由于培養(yǎng)系統(tǒng)是封閉的，通過使用注射器推拉相同體積的液體或氣體把所有的液體(細胞懸浮、培養(yǎng)介質(zhì)、LVs等)從一個腔體(注射器，培養(yǎng)裝置)傳輸?shù)搅硗庖粋€腔體中。此外，在操作之前還需要檢查所有的閥門是打開的，避免培養(yǎng)裝置內(nèi)部的氣壓過高，檢查連接末端的插頭為0.22um的過濾器或者Q-syte注射部位。

為了注入液體，使用20mL的注射器吸入2mL氣體然后吸入10mL液體制成一個空氣存儲注射器，這可以避免液體(尤其是細胞懸浮液) 留在試管中。通過傾斜培養(yǎng)裝置另一面注射和推吸試管中的泡沫可以將泡沫擠出培養(yǎng)裝置。注射超過10mL的液體將會導致多余的液體殘留在試管中。

3.試劑制備

3.1轉(zhuǎn)導質(zhì)粒的制備

首先使用PCR對hTERT+p53^DD、cyclinD1+CDK4^R24C和c-myc^T58A+HRas^G12V進行增強處理，在CMVV5-LUC受體質(zhì)粒上的XmaI和KpnI部位之間克隆三個插入序列，并對插入序列進行熒光素酶標記基因操作，得到熒光素標記的pLenti-hTERT+53^DD、pLenti-cyclinD1+CDK4^R24C和pLenti-c-myc^T58A+HRas^G12V質(zhì)粒，使用熒光素酶pLenti-CMVV5作為控制熒光素酶報告基因的控制質(zhì)粒；

3.2 293T細胞和Huh7.5.1細胞的細胞培養(yǎng)基(CM)制備

向細胞培養(yǎng)基中添加體積比為10％的滅活胎牛血清，體積比為1％的非必需氨基酸，10ug/mL的慶大霉素；使用0.22um的過濾器(61)過濾后在4℃的環(huán)境中保存最多兩個月；

3.3原代肝細胞(PPH)培養(yǎng)基(WM)制備

向500mL的William’s E培養(yǎng)基添加10mL的質(zhì)量體積比為7.5％的牛血清蛋白，5mL的ITS-G，10^-7M的地塞米松溶液，體積比為1％的非必需氨基酸，體積比為1％的青霉素和鏈霉素的混合溶液，體積比為1％的穩(wěn)定性谷氨酸；使用0.22um的過濾器過濾后保存在-80℃的環(huán)境中。

3.4原代肝細胞(PPH)離析

將肝切成小塊組織立即置于含冰塊的生理鹽水中，在切割表面上插入可視裝置，然后在pH為7.4和37℃的環(huán)境中使用500mL的緩沖液對肝組織進行灌洗，緩沖液中包含8.3g/L的NaCl、0.5g/L的KCl、2.4g/L的HEPES，0.19g/L的EGTA；使用包含100g的IV型膠原酶、3.9g/L的NaCl、0.5g/L的KCl、2.4g/L的HEPES和0.7g/L的CaCl₂·H₂O的400mL緩沖液在37℃的環(huán)境中進行第二次灌洗；使用IV型的膠原酶循環(huán)灌注，然后移除大塊的肝組織，輕輕搖動存儲在冰水中的包含有2.4g/L的HEPESD的HBSS緩沖液即可得到靶細胞；將含有靶細胞的懸浮液通過尼龍網(wǎng)過濾后在4℃的環(huán)境中沖洗三次；使用Trypan試劑排斥實驗驗證得到的肝細胞的可用性；立即使用合格的細胞或者凍結(jié)在-80℃的添加有10％的胎牛血清溶液中以代用；

4.在封閉的培養(yǎng)系統(tǒng)中制作慢性病毒上清的步驟

第0天

4.1培養(yǎng)裝置的準備工作

4.1.1培養(yǎng)裝置上閥門(2)的位置連接兩端為公槽的連接管(3)到培養(yǎng)裝置的閥門(2)上，連接0.22um的過濾器(61)的母槽端到連接管(3)上，打開所有的閥門(2)；

4.1.2移除25cm²的培養(yǎng)裝置的蓋帽，給其母槽端連接一個閥門(2)，給閥門(2)連接一個兩端為公槽的連接管(3)，給連接管連接一個Q-syte注射器(5)。

4.2 293T細胞的準備

4.2.1在一個50mL的試管中，重新懸浮在12mL的培養(yǎng)基中的3.0到7.5×10⁶的293T細胞；

4.2.2給Luer-Lock注射器(5)適配一個針頭，吸入2mL空氣然后吸入10mL的細胞懸浮液；

4.3培養(yǎng)裝置中第一次注射293T細胞；

4.3.1使用Betadin在高壓無菌中凈化Q-syte注射部位(4)；

4.3.2給Q-syte注射部位(4)連接上Luer-Lock注射器(5)；

4.3.3打開右邊的所有閥門(2)；

4.3.4稍微傾斜培養(yǎng)裝置的左邊，然后注射10mL細胞懸浮液；

4.3.5當細胞懸浮液接近左邊的閥門(2)時，關(guān)閉閥門然后使用貯存有空氣的Luer-Lock注射器(5)精確對應培養(yǎng)裝置中細胞液的體積，這樣細胞懸浮液可以全部進入培養(yǎng)裝置(1)中；

4.3.6檢查充滿于培養(yǎng)裝置(1)中的細胞懸浮液是否在進入或在左邊和右邊的連接管(3)中有殘留；

4.3.7關(guān)閉閥門(2)；

4.3.8斷開并丟棄Luer-Lock注射器(5)；

4.3.9使用Betadin凈化Q-syte注射部位(4)；

4.3.10將培養(yǎng)裝置(1)平放在孵化器中，在37℃和CO2濃度5％的環(huán)境中孵化6-8小時；

4.3.11識別平躺面；

4.4在培養(yǎng)裝置中第二次注射293T細胞；

4.4.1使用Betadin凈化Q-syte注射部位(4)；

4.4.2連接一個空的Luer-Lock注射器(5)；

4.4.3打開左右閥門(2)；

4.4.4吸入上層清液以移除可能沒有吸附的過多的細胞；

4.4.5斷開Luer-Lock注射器(5)；

4.4.6重復4.2和4.3；

4.4.7在37℃和CO2濃度5％的環(huán)境中孵化24小時，返回到培養(yǎng)裝置中，將上下面互調(diào)。

第一天

4.5沖洗293T細胞；

4.5.1使用Betadin凈化Q-syte注射部位(4)；

4.5.2連接一個空的Luer-Lock注射器(5)；

4.5.3打開左右閥門(2)；

4.5.4吸入上層清液以移除細胞；

4.5.5斷開并丟棄Luer-Lock注射器(5)；

4.5.6使用新的Luer-Lock注射器(5)，注射并移除10mL培養(yǎng)基以沖洗培養(yǎng)裝置(1)，然后丟棄Luer-Lock注射器(5)；

4.5.7使用新的注射器(5)注入10mL培養(yǎng)基；

4.5.8關(guān)閉閥門(2)；

4.5.9斷開和丟棄注射器(5)；

4.5.10使用Betadin凈化Q-syte注射部位(4)；

4.5.11在37℃和CO2濃度5％的環(huán)境中孵化1小時。

4.6轉(zhuǎn)染混合物

4.6.1在1.5mL的Eppendorf試管中添加500uL的無菌水、8.1ug的HIV-gap-pol質(zhì)粒，8.1ug的pbabe-hTERT+p53^DD,pbabe-cyclinD1+CDK4^R24C或者pbabe-cmycT58A+HRas^G12V質(zhì)粒、2.7ug pMD2VSV-G-Env質(zhì)粒、62uL的CaCl2 2M；

4.6.2在一個5mL的圓底聚丙烯試管中添加500uL的HBS 2x，在輕微旋轉(zhuǎn)后使試管中的物質(zhì)沉入管體，然后在室溫條件下孵化20分鐘，旋轉(zhuǎn)后添加9mL培養(yǎng)基。

4.7轉(zhuǎn)染293T細胞

4.7.1使用Betadin凈化Q-syte注射部位(4)；

4.7.2連接一個空的Luer-Lock注射器(5)；

4.7.3打開左右閥門(2)；

4.7.4吸入上層清液；

4.7.5斷開并丟棄Luer-Lock注射器(5)；

4.7.6將含有2mL氣體和10mL的轉(zhuǎn)染混合物(培養(yǎng)基中包含轉(zhuǎn)染試劑盒質(zhì)粒)的Luer-Lock注射器(5)連接到Q-syte注射部位(4)；

4.7.7注射培養(yǎng)基；

4.7.8關(guān)閉閥門(2)；

4.7.9斷開并丟棄Luer-Lock注射器(5)；

4.7.10使用Betadin凈化Q-syte注射部位(4)；

4.7.11在37℃和CO2濃度5％的環(huán)境中孵化一夜；

第二天

4.8第一批慢性病毒載體制品

4.8.1使用Betadin凈化Q-syte注射部位(4)；

4.8.2連接一個新的注射器(5)；

4.8.3打開左右閥門(2)；

4.8.4吸入上清液；

4.8.5斷開并丟棄Luer-Lock注射器(5)；

4.8.6使用心得Luer-Lock注射器(5)，注射并移除10mL培養(yǎng)基以沖洗培養(yǎng)裝置(1)，然后丟棄Luer-Lock注射器(5)；

4.8.7使用新的注射器注入10mL培養(yǎng)基；

4.8.8關(guān)閉閥門(2)；

4.8.9斷開并丟棄Luer-Lock注射器(5)；

4.8.10使用Betadin凈化Q-syte注射部位(4)；

4.8.11在37℃和CO2濃度5％的環(huán)境中孵化一夜。

第三天

4.9收獲第一批慢性病毒載體

4.9.1使用Betadin凈化Q-syte注射部位(4)；

4.9.2連接充滿空氣的注射器(5)；

4.9.3在左邊移除0.22um過濾器(61)；

4.9.4連接0.45um的過濾器(62)的母槽端到連接管(3)的公槽端；

4.9.5連接過濾器的公槽端到公母槽連接管(3)的母槽端；

4.9.6連接第二個連接管的的公槽端到25cm²的培養(yǎng)裝置(1)(稱為培養(yǎng)二號)的母槽端；

4.9.7在二號培養(yǎng)裝置(1)，連接一個公槽連接管到閥門上；

4.9.8連接0.22um的過濾器(61)到連接管上；

4.9.9打開所有閥門(2)；

4.9.10將一號培養(yǎng)裝置上面反轉(zhuǎn)到下面；

4.9.11使用注射器將空氣推入一號培養(yǎng)裝置中，以移除慢性病毒上清液從一號培養(yǎng)裝置到二號中；

4.10慢性病毒的低溫貯藏；

4.10.1關(guān)閉所有閥門(2)；

4.10.2將二號培養(yǎng)裝置上的所有連接管丟棄(3)；

4.10.3關(guān)閉二號培養(yǎng)裝置上的插管；

4.10.4在-80℃下將二號培養(yǎng)裝置直接凍結(jié)；

4.11慢性病毒第二批產(chǎn)品；

4.11.1更換0.45um過濾器(62)并連接到一號培養(yǎng)裝置；

4.11.2使用Betadin凈化一號培養(yǎng)裝置的Q-syte注射部位(4)；

4.11.3將含有2mL氣體和10mL的培養(yǎng)基的注射器連接到Q-syte注射部位；

4.11.4打開左右閥門(2)；

4.11.5注入培養(yǎng)基；

4.11.6關(guān)閉閥門，插入0.45um的過濾器(62)；

4.11.7丟棄注射器(5)；

4.11.8在37℃和CO2濃度5％的環(huán)境中孵化24小時。

第四天

4.12收獲第二批慢性病毒載體

4.12.1重復4.9和4.10步驟激活三號培養(yǎng)裝置中的慢性病毒；

4.12.2丟棄一號培養(yǎng)裝置；

5.一個密閉培養(yǎng)系統(tǒng)中原代肝細胞的慢性病毒轉(zhuǎn)導步驟

第0天

5.1在培養(yǎng)裝置中注入PPH

5.1.1在25cm2的培養(yǎng)裝置里注入10×10⁶PPH重新懸??；

5.1.2將培養(yǎng)裝置平放在37℃和CO2濃度5％的環(huán)境中孵化4小時；

5.1.3將培養(yǎng)裝置反轉(zhuǎn)過來使過剩的細胞吸附在第二面上；

5.1.4將培養(yǎng)裝置平放在37℃和CO2濃度5％的環(huán)境中孵化4小時

5.2PPH轉(zhuǎn)導慢性病毒；

5.2.1將包含收獲慢性病毒載體(二號和三號培養(yǎng)裝置，見4.9到4.12)的培養(yǎng)裝置放置在37℃的水中解凍；

5.2.2使用注射器將上清液從四號培養(yǎng)裝置中移除，步驟如4.5.1-4.5.4

5.2.3斷開并丟棄注射器(5)；

5.2.4丟棄四號培養(yǎng)裝置0.22um過濾器(61)；

5.2.5將四號培養(yǎng)裝置的公槽連接管連接到二號或三號培養(yǎng)裝置上；

5.2.6連接一個閥門到二號或者三號培養(yǎng)裝置上的母槽端；

5.2.7連接一個公母槽連接管到閥門上；

5.2.8連接一個Q-syte注射部位(4)到連接管(3)上；

5.2.9使用Betadin凈化二號或者三號和四號裝置的兩個Q-syte注射部位(4)；

5.2.10連接充滿空氣的注射器到二號或三號培養(yǎng)裝置的Q-syte注射部位(4)；

5.2.11連接一個空的注射器到四號培養(yǎng)裝置的Q-syte的注射部位(4)；

5.2.12打開所有閥門(2)；

5.2.13將空氣從注射器(連接到二號或三號培養(yǎng)裝置)推出，同時使用空的注射器吸入空氣。以轉(zhuǎn)移慢性病毒從二號或三號培養(yǎng)裝置到四號培養(yǎng)裝置中；

5.2.14關(guān)閉所有閥門(2)；

5.2.15斷開并丟棄注射器(5)和二號培養(yǎng)裝置；

5.2.16四號培養(yǎng)裝置插上插管；

5.2.17平放四號培養(yǎng)裝置在孵化器中，孵化器置于37℃和CO2濃度5％的環(huán)境中孵化24小時。

第一天

5.3沖洗PPH

5.3.1將四號培養(yǎng)裝置中的慢性病毒上清液丟棄到五號培養(yǎng)裝置中，見步驟4.9(四號培養(yǎng)裝置代替一號，五號培養(yǎng)裝置代替二號)

5.3.2關(guān)閉閥門(2)；

5.3.3丟棄五號培養(yǎng)裝置和0.45um的過濾器(62)并將其更換為0.22um的過濾器(61)；

5.3.4連接保護10mL的WM培養(yǎng)基注射到四號培養(yǎng)裝置上；

5.3.5打開閥門(2)；

5.3.6注入10mL的WM培養(yǎng)基；

5.3.7關(guān)閉閥門(2)；

5.3.8斷開并丟棄注射器(5)；

5.3.9丟棄0.22um過濾器(61)并更換為0.45um過濾器(62)；

5.3.10丟棄六號培養(yǎng)裝置中的WM，如步驟4.9；

5.3.11丟棄培養(yǎng)和0.45um的過濾器(62)并更換為0.22um的過濾器(61)；

5.3.12連接包含10mL的WM的注射器；

5.3.14注入10mL的WM；

5.3.15關(guān)閉閥門(2)；

5.3.16斷開并丟棄注射器(5)；

5.3.17平放四號培養(yǎng)裝置在孵化器中，孵化器設置37℃和CO2濃度5％的環(huán)境中48小時；

第三天

5.4 PPH激活

5.4.1將四號培養(yǎng)裝置中的培養(yǎng)上清液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)七號培養(yǎng)裝置中，如步驟4.9(四號培養(yǎng)裝置代替培養(yǎng)一號、七號培養(yǎng)裝置代替二號)；

5.4.2連接包含10mL的trpsin-EDTA的注射器；

5.4.3注入trypsin然后在倒置顯微鏡下監(jiān)視細胞分離。保持注射器連接在培養(yǎng)裝置上；

5.4.4吸入注射器中的細胞；

5.4.5斷開注射器(5)；

5.4.6轉(zhuǎn)移50mL試管中的細胞并沖洗細胞以便以后使用；

5.4.7重復5.4.2到5.4.6以激活在培養(yǎng)中的細胞。

5.5在CCS中低溫貯藏PPH

5.5.1將四號培養(yǎng)裝置中的培養(yǎng)上清液轉(zhuǎn)移到七號培養(yǎng)裝置中，如步驟4.9(四號培養(yǎng)裝置代替培養(yǎng)一號、七號培養(yǎng)裝置代替二號)；

5.5.2連接包含10mL的低溫貯藏介質(zhì)的注射器；

5.5.3注入低溫貯藏介質(zhì)(低溫介質(zhì)中添加有10％的FCS)；

5.5.4斷開注射器(5)；

5.5.5在-80℃低溫下凍結(jié)四號培養(yǎng)裝置；

5.5.6使用前將細胞置于37℃的水中解凍；

5.5.7激活細胞如步驟5.4。

6動物試驗

動物試驗要獲得當?shù)貍惱砦瘑T會(Comite′Re′gional d’Ethique en Matie`re d’Expe′rimentation Animale de Strasbourg；approval No.AL/01/18/08/12)的批準，然后在生物安全等級為3級的實驗室中進行。

6.1注入轉(zhuǎn)導的PPH

在50uL的WM中數(shù)量為1×10⁶的轉(zhuǎn)導PPH懸浮液通過皮下注射到NMRI-Foxn1nu/Foxn1nu小鼠的背部，注射前使用吸入異氟烷((Isoflo；Axience,Pantin,France)對小鼠全身麻醉

6.2生物熒光顯影

轉(zhuǎn)導PPH的熒光素酶活性在移植后指定的時間測定，測定時使用生物熒光顯影技術(shù)，該技術(shù)在給小鼠腹腔內(nèi)注射100uL的d-熒光素(20mg/mL；Caliper Lifesciences)后使用IVIS50的相機(caliper Lifesciences,Roissy,France)拍照。在20分鐘內(nèi)重復如前所述的1分鐘內(nèi)獲得物，從熒光素注射的時間開始到整個熒光發(fā)射時間直到觀察到信號開始降低。腫瘤細胞生物發(fā)光，可以使用動態(tài)顯影軟件3.1分析，可以表達為光子每秒每平方厘米每球面度(p/s/cm²/sr)在熒光素注射后導致生物發(fā)光到達最大值后使用時間點。通過計算標明的天數(shù)到移植后期的生物熒光比值來得到相關(guān)腫瘤細胞的生長。

7.質(zhì)量控制

7.1轉(zhuǎn)導效率

為了評估LVs的轉(zhuǎn)導效率，50000個轉(zhuǎn)導PPH在5.4.6步驟中激活，每個LV轉(zhuǎn)導體被電鍍在96式孔板上，然后在1250轉(zhuǎn)速上離心5分鐘。上層清液被移除，增加50uL的Glo Lysis(Promega,Madison,WI)。三分鐘后加入25uL的BrightGlo熒光素(Promega)然后將25uL的混合物轉(zhuǎn)移到一個不透明板測試熒光素酶的表達活性，檢測時使用Mithras LB940 luminometer(Berthold,Thoiry,France)。相同數(shù)量的標準化PPH作為陰性對照組進行相似評價。

7.2 Huh7.5.2細胞的轉(zhuǎn)導

為了評價LV轉(zhuǎn)導后在PPH培養(yǎng)的上清液中LV產(chǎn)品的功效或者LVs重組體的復制能力，1×10⁴的Huh7.5.1細胞被置于平底的96式碟子中，然后培養(yǎng)一夜。在PPH轉(zhuǎn)導后，將CM以吸入的方式移除然后使用50uL的LV(覆蓋來自步驟5.4.1的培養(yǎng)7號)或者三天內(nèi)收獲的培養(yǎng)上清液一式三份代替(覆蓋來自步驟4.9或者4.2得到的培養(yǎng)2號或者3號)。在37℃和CO2濃度5％的條件下孵化6個小時后，添加100uL/well的CM，然后繼續(xù)培養(yǎng)3天。然后移除上清液，添加50uL的lysis熒光素酶。相同數(shù)量的標準化PPH作為陰性對照組進行相似評價。

檢測修復

8.封閉培養(yǎng)系統(tǒng)中得到LV產(chǎn)量

首先我們要評價CCS系統(tǒng)中熒光素酶編碼控制LVs或者致癌基因編碼的效率是否與常規(guī)的OCS系統(tǒng)更高。培養(yǎng)并使用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CCS系統(tǒng)中的293T細胞，或者在OCS系統(tǒng)中的PtriP培養(yǎng)皿。培養(yǎng)的上清液作為用以轉(zhuǎn)導Huh7.5.1細胞，在OCS系統(tǒng)中操作進行以確保轉(zhuǎn)導效率。轉(zhuǎn)導Huh7.5.1細胞的熒光酶活性可以使用三天后的生物熒光活性進行量化?？梢杂^察到從一個LV到另外一個的生物熒光活性水平有差別，這也反映了質(zhì)粒結(jié)構(gòu)對于LVs產(chǎn)品轉(zhuǎn)導有不同的效率，對比CCS與OCS系統(tǒng)，轉(zhuǎn)導效率對于每個獨立的帶菌體是相似的。結(jié)論表明使用CCS系統(tǒng)并不妨礙293T細胞轉(zhuǎn)染產(chǎn)生LVs，該結(jié)論可從圖4中分析得出。

9.在密閉系統(tǒng)中轉(zhuǎn)導原代細胞

然后我們評價在CCS中轉(zhuǎn)染原代細胞的可能性。對比CCS與OCS,使用控制LV或者每個致癌基因編碼的LV轉(zhuǎn)染獨立地轉(zhuǎn)染PPH。24小時后的初次轉(zhuǎn)導，沖洗PPH然后在熒光素酶活性量化前再培養(yǎng)48小時?？紤]到在CCS和OCS中轉(zhuǎn)染，熒光素酶活性類似，這表明兩個培養(yǎng)系統(tǒng)相同的轉(zhuǎn)導效率，該結(jié)論可由圖5分析得到。

在CCS中轉(zhuǎn)導的PPH得到的組合體LV粒子制品復制能力的缺乏通過在第三天收獲的PPH轉(zhuǎn)導體中的Huh7.5.1細胞來評價。熒光素酶的活性在三天后量化后得到的結(jié)果與在沒有轉(zhuǎn)導PPH上清液中培養(yǎng)的Huh7.5.1細胞得到額結(jié)果類似，表明在CCS中通過PPH轉(zhuǎn)導可以得到?jīng)]有復制能力的組合體LV粒子，該結(jié)論可由圖6分析得到。

10.在密閉培養(yǎng)系統(tǒng)中低溫貯藏轉(zhuǎn)導細胞

然后我們評價直接在CCS系統(tǒng)中低溫貯藏轉(zhuǎn)導細胞的可能性。在兩個CCS系統(tǒng)中使用控制LV得到兩個轉(zhuǎn)導PPH個體。三天后，上清液移除并被低溫貯藏基質(zhì)取代。使用前將CCS裝置直接冷凍并置于-80℃中一個月。為了證明它們的存活性，解凍的細胞立即通過皮下注射到免疫缺陷的NMRI nude小鼠體內(nèi)，分別在5小時、48小時和6天檢測生物熒光素活性。如圖7所示，解凍的細胞熒光素酶活性可以在轉(zhuǎn)移后第6天偵測到，該結(jié)果表明直接在CCS系統(tǒng)中凍結(jié)細胞的可行性。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“示例”、“具體示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料過著特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。

以上公開的本發(fā)明優(yōu)選實施例只是用于幫助闡述本發(fā)明。優(yōu)選實施例并沒有詳盡敘述所有的細節(jié)，也不限制該發(fā)明僅為所述的具體實施方式。顯然，根據(jù)本說明書的內(nèi)容，可作很多的修改和變化。本說明書選取并具體描述這些實施例，是為了更好地解釋本發(fā)明的原理和實際應用，從而使所屬技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員能很好地理解和利用本發(fā)明。本發(fā)明僅受權(quán)利要求書及其全部范圍和等效物的限制。