本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及用于DNA技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種改進(jìn)的離心柱法外周血游離DNA提取試劑及其提取方法。

背景技術(shù)：

眾所周知，遺傳物質(zhì)核酸大多位于細(xì)胞中，但不管是健康的人群還是患病人群，都有小部分DNA位于細(xì)胞外，稱為游離核酸(cell-free DNA)。外周血中也存在游離DNA,稱為外周血循環(huán)DNA(Circulating DNA in plasma)。

1987年的一篇論文中，研究人員對(duì)37例惡性腫瘤患者血漿進(jìn)行了研究，其中10例標(biāo)本中都分離出了游離DNA。初步鑒定的血漿游離DNA為雙鏈，大小范圍分布約為40bp-220bp。在隨后的研究中，他們通過一種自己開發(fā)的體外DNA合成試驗(yàn)(In vitro DNA Synthesis Test)，對(duì)癌癥患者血漿中的DNA的特性有了基本的判斷，這種測(cè)試的基本原理是當(dāng)測(cè)試反應(yīng)中加入致癌劑時(shí)，腫瘤源性的DNA鏈穩(wěn)定性會(huì)下降。到了90年代，研究人員在腫瘤患者血漿游離循環(huán)DNA上相繼檢測(cè)到了K-ras等基因的突變。

由于外周血游離核酸在外周血中含量稀少，上文中所述的研究人員采用的還是傳統(tǒng)的酚氯仿抽提技術(shù)，所需要的外周血的量也比較大(需要采集50ml外周血)，試驗(yàn)難度可想而知。因此，如何提高提取外周血中的游離核酸的效率，成為了市面上提取試劑盒遇到的一大難題。隨著科技的不斷進(jìn)步，市面上也陸續(xù)涌現(xiàn)了一些針對(duì)外周血游離核酸的提取試劑盒，可以較有效的提高核酸提取率，但都價(jià)格昂貴，成本較傳統(tǒng)的離心柱法而言，高出50-200倍，成本問題成為了很多實(shí)驗(yàn)室在處理外周血游離核酸時(shí)的制約因素，因此改進(jìn)傳統(tǒng)離心柱法，提高核酸提取效率已成為當(dāng)務(wù)之急。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的就是針對(duì)以上現(xiàn)狀，解決限制傳統(tǒng)離心柱法在提取外周血游離核酸的瓶頸問題，提供一種改進(jìn)的離心柱法外周血游離DNA提取試劑及其提取方法，所用試劑成分簡(jiǎn)單，操作方便，成本低廉，不需特殊設(shè)備，并能顯著降低成本和提高核酸提取率。

為實(shí)現(xiàn)前述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括：

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種改進(jìn)的離心柱法外周血游離DNA提取試劑，其包含0.2ug/uL～5ug/uL酵母tRNA，其余部分包含超純水；并且所述DNA提取試劑的pH值為7.3～8.2。

在一些優(yōu)選實(shí)施方案之中，所述改進(jìn)的離心柱法外周血游離DNA提取試劑的pH值為7.5，溶劑為超純水，溶質(zhì)為如下終濃度物質(zhì)：酵母tRNA 1ug/uL。

本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種試劑盒，其包含前述改進(jìn)的離心柱法外周血游離DNA提取試劑。

本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種改進(jìn)的離心柱法外周血游離DNA提取方法，其包括：

將待處理外周血與蛋白酶K混合，再加入第一緩沖液和所述改進(jìn)的離心柱法外周血游離DNA提取試劑或試劑盒，混合均勻形成消化液，然后向所述消化液中加入無水乙醇，形成消化混合液，將所述消化混合液離心得到游離DNA。

其中，所述第一緩沖液為AL緩沖液，德國(guó)Qiagen。

在一些實(shí)施方案之中，所述待處理外周血與蛋白酶K的體積比為5：1～20：1；所述蛋白酶K的酶活濃度范圍為5mg/mL～30mg/mL。

在一些較為優(yōu)選的實(shí)施方案之中，所述待處理外周血與蛋白酶K的體積比為10：1，所述蛋白酶K的酶活濃度范圍為20mg/mL。

在一些實(shí)施方案之中，所述第一緩沖液與待處理外周血的體積比為0.5：1～2：1；

所述待處理外周血與所述改進(jìn)的離心柱法外周血游離DNA提取試劑的體積比為200：1～5000：1；

所述待處理外周血與無水乙醇的體積比為3：1～10：1。

在一些較為優(yōu)選的實(shí)施方案之中，所述第一緩沖液與待處理外周血的體積比為1：1；

所述待處理外周血與所述改進(jìn)的離心柱法外周血游離DNA提取試劑的體積比為1000：1；

所述待處理外周血與無水乙醇的體積比為2.5：1。

在一些實(shí)施方案之中，所述消化液的溫度為50℃～65℃，消化時(shí)間為0.2h～20h。更為優(yōu)選的，所述消化液的溫度為56℃，消化時(shí)間為6h。

在一些實(shí)施方案之中，所述提取方法還包括：將所述消化混合液分批加入離心柱中離心，先向離心柱中加入第二緩沖液，清洗離心柱，再向離心柱中加入第三緩沖液，清洗離心柱。

其中，所述第二緩沖液為AW1緩沖液，德國(guó)Qiagen；所述第三緩沖液為AW2緩沖液，德國(guó)Qiagen。

進(jìn)一步的，所述提取方法還包括：清洗離心柱后，將空的離心柱放置入離心機(jī)中離心2min，并室溫晾干，然后向離心柱中加入第四緩沖液，洗脫得到的游離DNA。

其中，所述第四緩沖液為AE緩沖液，德國(guó)Qiagen。

在一些實(shí)施方案之中，所述第二緩沖液與所述待處理外周血的體積比為0.5：1～2：1；

所述第三緩沖液與所述待處理外周血的體積比為0.5：1～2：1；

所述待處理外周血與第四緩沖液的體積比為10：1～200：1；

洗脫溫度為20℃～70℃。

更為優(yōu)選的，所述第二緩沖液與所述待處理外周血的體積比為0.7：1；

所述第三緩沖液與所述待處理外周血的體積比為0.7：1；

所述待處理外周血與第四緩沖液的體積比為31.25：1；

洗脫溫度為55℃。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括：

(1)本發(fā)明提供的一種改進(jìn)的離心柱法外周血游離核酸提取試劑，只需使用市面現(xiàn)有全血提取核酸試劑盒中的試劑，材料來源簡(jiǎn)單，操作難度低，無需專門技術(shù)培訓(xùn)及特殊儀器設(shè)備；

(2)本發(fā)明提供的一種改進(jìn)的離心柱法外周血游離核酸提取方法，在現(xiàn)有普通離心柱法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良，在提取過程中加入上述提取試劑提高提取效率，將現(xiàn)有普通離心柱法的提取得率提高了3-10倍；

(3)本發(fā)明提供的一種改進(jìn)的離心柱法外周血游離核酸提取試劑及試劑盒，較市面上已有的產(chǎn)品試劑盒而言，可實(shí)現(xiàn)替代價(jià)格昂貴的針對(duì)性提取外周血游離DNA離心柱法試劑盒，可將成本降低50％以上，大大改善科研人員在提取外周血游離核酸中所遭遇的問題，具有實(shí)用性高，推廣性好的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1是本發(fā)明提供的改進(jìn)的離心柱法外周血游離DNA的提取試劑盒與現(xiàn)有試劑盒的成本消耗對(duì)比示意圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1-4及對(duì)照組試驗(yàn)中對(duì)游離DNA提取量的對(duì)比示意圖。

具體實(shí)施方式

下文將對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作更為詳盡的解釋說明。但是，應(yīng)當(dāng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

在對(duì)實(shí)例描述前，有必要提供一些備注說明：

采用不同廠家、不同批次的試劑會(huì)造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異，屬于正?，F(xiàn)象。在進(jìn)行小規(guī)模實(shí)驗(yàn)時(shí)，為保證平行實(shí)驗(yàn)間的重復(fù)性，建議配置試劑后，充分混勻并分裝，以保證每次實(shí)驗(yàn)試劑的均一性。

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種改進(jìn)的離心柱法外周血游離DNA提取試劑，其包含0.2ug/uL～5ug/uL酵母tRNA，其余部分包含超純水；并且所述DNA提取試劑的pH值為7.3～8.2。

在一些優(yōu)選實(shí)施方案之中，所述改進(jìn)的離心柱法外周血游離DNA提取試劑的pH值為7.5，溶劑為超純水，溶質(zhì)為如下終濃度物質(zhì)：酵母tRNA 1ug/uL。

本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種試劑盒，其包含前述改進(jìn)的離心柱法外周血游離DNA提取試劑。

本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種改進(jìn)的離心柱法外周血游離DNA提取方法，其包括：

將待處理外周血與蛋白酶K混合，再加入第一緩沖液和所述改進(jìn)的離心柱法外周血游離DNA提取試劑或試劑盒，混合均勻形成消化液，然后向所述消化液中加入無水乙醇，形成消化混合液，將所述消化混合液離心得到游離DNA。

其中，所述第一緩沖液為AL緩沖液，德國(guó)Qiagen。

在一些實(shí)施方案之中，所述待處理外周血與蛋白酶K的體積比為5：1～20：1，優(yōu)選為10：1。

在一些實(shí)施方案之中，所述蛋白酶K的酶活濃度范圍為5mg/mL～30mg/mL，優(yōu)選為20mg/mL。

在一些實(shí)施方案之中，所述第一緩沖液與待處理外周血的體積比為0.5：1～2：1，優(yōu)選為1：1；

所述待處理外周血與所述改進(jìn)的離心柱法外周血游離DNA提取試劑的體積比為200：1～5000：1，優(yōu)選為1000：1；

所述待處理外周血與無水乙醇的體積比為3：1～10：1，優(yōu)選為2.5：1。

在一些實(shí)施方案之中，所述消化液的溫度為50℃～65℃，消化時(shí)間為0.2h～20h。更為優(yōu)選的，所述消化液的溫度為56℃，消化時(shí)間為6h。

在一些實(shí)施方案之中，所述提取方法還包括：將所述消化混合液分批加入離心柱中離心，先向離心柱中加入第二緩沖液，清洗離心柱，再向離心柱中加入第三緩沖液，清洗離心柱。

其中，所述第二緩沖液為AW1緩沖液，德國(guó)Qiagen，所述第三緩沖液為AW2緩沖液，德國(guó)Qiagen。

進(jìn)一步的，所述提取方法還包括：清洗離心柱后，將空的離心柱放置入離心機(jī)中離心2min，并室溫晾干，然后向離心柱中加入第四緩沖液，洗脫得到的游離DNA。

其中，所述第四緩沖液為AE緩沖液，德國(guó)Qiagen。

在一些實(shí)施方案之中，所述第二緩沖液與所述待處理外周血的體積比為0.5：1～2：1；

所述第三緩沖液與所述待處理外周血的體積比為0.5：1～2：1；

所述待處理外周血與第四緩沖液的體積比為10：1～200：1；

洗脫溫度為20℃～70℃。

更為優(yōu)選的，所述第二緩沖液與所述待處理外周血的體積比為0.7：1；

所述第三緩沖液與所述待處理外周血的體積比為0.7：1；

所述待處理外周血與第四緩沖液的體積比為31.25：1；

洗脫溫度為55℃。

在一些較為具體的實(shí)施方案之中，所述提取方法具體包括以下步驟：

(1)將1mL血漿從-80℃中取出，置于冰水混合物中融化；

(2)在15mL離心管底部加入蛋白酶K；

(3)將1mL血漿加入15mL離心管中，并加入第一緩沖液和前述提取試劑；

(4)充分混勻后放置水浴鍋中消化；

(5)向消化液中添加無水乙醇；

(6)將消化混合液分批加入離心柱中離心；

(7)向離心柱中加入第二緩沖液，清洗離心柱；

(8)向離心柱中加入第三緩沖液，清洗離心柱。

(9)空離離心柱，并室溫晾干；

(10)向離心柱中加入第四緩沖液，洗脫DNA。

其它未提及的步驟，均按照QiaAmp Blood Mini Kit操作手冊(cè)進(jìn)行(Qiagen)。

以下結(jié)合附圖和若干實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的解釋說明。

實(shí)施例1

1.試劑準(zhǔn)備：

蛋白酶K(天根)，QIAamp Mini spin column(Qiagen)，緩沖液AL(Qiagen)，緩沖液AW1(Qiagen)，無水乙醇(國(guó)藥)，緩沖液AW2(Qiagen)，緩沖液AE(Qiagen)，Qubit dsDNA HS Assay(Life Technologies)。

試劑I：pH為7.5，溶劑為超純水，溶質(zhì)包含以下終濃度物質(zhì)，酵母tRNA(Perkin Elmer)1ug/uL。

2.實(shí)驗(yàn)操作過程：

(1)將融化后的血漿樣本放置在預(yù)冷至4℃的離心機(jī)Sigma(3K-15)中，以16000×g的轉(zhuǎn)速,4℃離心10min。

(2)吸取100ul蛋白酶K至15ml離心管底部。

(3)用移液器小心吸取離心后血漿樣本上清液1mL至加有蛋白酶K的15ml離心管中。

(4)吸取1mL緩沖液AL溶液和1uL試劑I，加入樣本中，立即渦旋振蕩混勻15秒。

(5)將混合液放入56℃水浴鍋孵育4h。

(6)從水浴鍋中取出15ml離心管，短暫離心5秒，使離心管蓋和管壁上的液體聚集至管底。

(7)加入1mL無水乙醇到樣本中，渦旋振蕩混勻15秒后短暫離心。

(8)小心吸取以上混合物700ul到QIAamp Mini spin column中，蓋上蓋子，使用離心機(jī)Thermo(Micro CL17)，6000×g常溫離心1min，丟棄收集管中的廢液，重復(fù)加入樣本直至全部離心完畢。

(9)小心將QIAamp Mini spin column轉(zhuǎn)移至新的收集管中，加入700ul緩沖液AW1，蓋上蓋子，使用離心機(jī)Thermo(Micro CL17)，6000×g常溫離心1min。

(10)小心將QIAamp Mini spin column轉(zhuǎn)移至新的收集管中，加入700ul緩沖液AW2，蓋上蓋子，使用離心機(jī)Thermo(Micro CL17)，14000×g常溫離心2min。

(11)將QIAamp Mini spin column轉(zhuǎn)移至新的收集管中，管蓋反向，全速離心4min。

(12)將QIAamp Mini spin column轉(zhuǎn)移至新的收集管中，打開蓋子，至于55℃下晾干10min。

(13)將QIAamp Mini spin column轉(zhuǎn)移至干凈的1.5ml Eppendorf離心管中，向膜中央加入32ul預(yù)熱過的緩沖液AE，蓋上蓋子，55℃孵育5min。

(14)使用離心機(jī)Thermo(Micro CL17)，6000×g常溫離心2min。

(15)丟棄掉QIAamp Mini spin column，小心蓋好蓋子，在EP管上做好標(biāo)記。

(16)使用Qubit dsDNA HS Assay對(duì)提取的DNA進(jìn)行定量操作。

3.檢測(cè)結(jié)果：

最后測(cè)得終產(chǎn)物濃度為：0.32ng/ul。

實(shí)施例2

1.試劑準(zhǔn)備：

蛋白酶K(天根)，QIAamp Mini spin column(Qiagen)，緩沖液AL(Qiagen)，緩沖液AW1(Qiagen)，無水乙醇(國(guó)藥)，緩沖液AW2(Qiagen)，緩沖液AE(Qiagen)，Qubit dsDNA HS Assay(Life Technologies)。

試劑I：pH為7.5，溶劑為超純水，溶質(zhì)包含以下終濃度物質(zhì)，酵母tRNA(Perkin Elmer)1ug/uL。

2.實(shí)驗(yàn)操作過程：

(1)將融化后的血漿樣本放置在預(yù)冷至4℃的離心機(jī)Sigma(3K-15)中，以16000×g的轉(zhuǎn)速,4℃離心10min。

(2)吸取100ul蛋白酶K至15ml離心管底部。

(3)用移液器小心吸取離心后血漿樣本上清液1mL至加有蛋白酶K的15ml離心管中。

(4)吸取1mL緩沖液AL溶液和1uL試劑I，加入樣本中，立即渦旋振蕩混勻15秒。

(5)將混合液放入56℃水浴鍋孵育4h。

(6)從水浴鍋中取出15ml離心管，短暫離心5秒，使離心管蓋和管壁上的液體聚集至管底。

(7)加入1mL無水乙醇到樣本中，渦旋振蕩混勻15秒后短暫離心。

(8)小心吸取以上混合物700ul到QIAamp Mini spin column中，蓋上蓋子，使用離心機(jī)Thermo(Micro CL17)，6000×g常溫離心1min，丟棄收集管中的廢液，重復(fù)加入樣本直至全部離心完畢。

(9)小心將QIAamp Mini spin column轉(zhuǎn)移至新的收集管中，加入700ul緩沖液AW1，蓋上蓋子，使用離心機(jī)Thermo(Micro CL17)，6000×g常溫離心1min。

(10)小心將QIAamp Mini spin column轉(zhuǎn)移至新的收集管中，加入700ul緩沖液AW2，蓋上蓋子，使用離心機(jī)Thermo(Micro CL17)，14000×g常溫離心2min。

(11)將QIAamp Mini spin column轉(zhuǎn)移至新的收集管中，管蓋反向，全速離心4min。

(12)將QIAamp Mini spin column轉(zhuǎn)移至新的收集管中，打開蓋子，至于55℃下晾干10min。

(13)將QIAamp Mini spin column轉(zhuǎn)移至干凈的1.5ml Eppendorf離心管中，向膜中央加入32ul預(yù)熱過的緩沖液AE，蓋上蓋子，55℃孵育5min。

(14)使用離心機(jī)Thermo(Micro CL17)，6000×g常溫離心2min。

(15)丟棄掉QIAamp Mini spin column，小心蓋好蓋子，在EP管上做好標(biāo)記。

(16)使用Qubit dsDNA HS Assay對(duì)提取的DNA進(jìn)行定量操作。

3.檢測(cè)結(jié)果：

最后測(cè)得終產(chǎn)物濃度為：0.29ng/ul。

實(shí)施例3

1.試劑準(zhǔn)備：

蛋白酶K(天根)，QIAamp Mini spin column(Qiagen)，緩沖液AL(Qiagen)，緩沖液AW1(Qiagen)，無水乙醇(國(guó)藥)，緩沖液AW2(Qiagen)，緩沖液AE(Qiagen)，Qubit dsDNA HS Assay(Life Technologies)。

試劑I：pH為7.5，溶劑為超純水，溶質(zhì)包含以下終濃度物質(zhì)，酵母tRNA(Perkin Elmer)1ug/uL。

2.實(shí)驗(yàn)操作過程：

(1)將融化后的血漿樣本放置在預(yù)冷至4℃的離心機(jī)Sigma(3K-15)中，以16000×g的轉(zhuǎn)速,4℃離心10min。

(2)吸取100ul蛋白酶K至15ml離心管底部。

(3)用移液器小心吸取離心后血漿樣本上清液1mL至加有蛋白酶K的15ml離心管中。

(4)吸取1mL緩沖液AL溶液和1uL試劑I，加入樣本中，立即渦旋振蕩混勻15秒。

(5)將混合液放入56℃水浴鍋孵育4h。

(6)從水浴鍋中取出15ml離心管，短暫離心5秒，使離心管蓋和管壁上的液體聚集至管底。

(7)加入1mL無水乙醇到樣本中，渦旋振蕩混勻15秒后短暫離心。

(8)小心吸取以上混合物700ul到QIAamp Mini spin column中，蓋上蓋子，使用離心機(jī)Thermo(Micro CL17)，6000×g常溫離心1min，丟棄收集管中的廢液，重復(fù)加入樣本直至全部離心完畢。

(9)小心將QIAamp Mini spin column轉(zhuǎn)移至新的收集管中，加入700ul緩沖液AW1，蓋上蓋子，使用離心機(jī)Thermo(Micro CL17)，6000×g常溫離心1min。

(10)小心將QIAamp Mini spin column轉(zhuǎn)移至新的收集管中，加入700ul緩沖液AW2，蓋上蓋子，使用離心機(jī)Thermo(Micro CL17)，14000×g常溫離心2min。

(11)將QIAamp Mini spin column轉(zhuǎn)移至新的收集管中，管蓋反向，全速離心4min。

(12)將QIAamp Mini spin column轉(zhuǎn)移至新的收集管中，打開蓋子，至于55℃下晾干10min。

(13)將QIAamp Mini spin column轉(zhuǎn)移至干凈的1.5ml Eppendorf離心管中，向膜中央加入32ul預(yù)熱過的緩沖液AE，蓋上蓋子，55℃孵育5min。

(14)使用離心機(jī)Thermo(Micro CL17)，6000×g常溫離心2min。

(15)丟棄掉QIAamp Mini spin column，小心蓋好蓋子，在EP管上做好標(biāo)記。

(16)使用Qubit dsDNA HS Assay對(duì)提取的DNA進(jìn)行定量操作。

3.檢測(cè)結(jié)果：

最后測(cè)得終產(chǎn)物濃度為：0.37ng/ul。

實(shí)施例4

1.試劑準(zhǔn)備：

蛋白酶K(天根)，QIAamp Mini spin column(Qiagen)，緩沖液AL(Qiagen)，緩沖液AW1(Qiagen)，無水乙醇(國(guó)藥)，緩沖液AW2(Qiagen)，緩沖液AE(Qiagen)，Qubit dsDNA HS Assay(Life Technologies)。

試劑I：pH為7.5，溶劑為超純水，溶質(zhì)包含以下終濃度物質(zhì)，酵母tRNA(Perkin Elmer)1ug/uL。

2.實(shí)驗(yàn)操作過程：

(1)將融化后的血漿樣本放置在預(yù)冷至4℃的離心機(jī)Sigma(3K-15)中，以16000×g的轉(zhuǎn)速,4℃離心10min。

(2)吸取100ul蛋白酶K至15ml離心管底部。

(3)用移液器小心吸取離心后血漿樣本上清液1mL至加有蛋白酶K的15ml離心管中。

(4)吸取1mL緩沖液AL溶液和1uL試劑I，加入樣本中，立即渦旋振蕩混勻15秒。

(5)將混合液放入56℃水浴鍋孵育4h。

(6)從水浴鍋中取出15ml離心管，短暫離心5秒，使離心管蓋和管壁上的液體聚集至管底。

(7)加入1mL無水乙醇到樣本中，渦旋振蕩混勻15秒后短暫離心。

(8)小心吸取以上混合物700ul到QIAamp Mini spin column中，蓋上蓋子，使用離心機(jī)Thermo(Micro CL17)，6000×g常溫離心1min，丟棄收集管中的廢液，重復(fù)加入樣本直至全部離心完畢。

(9)小心將QIAamp Mini spin column轉(zhuǎn)移至新的收集管中，加入700ul緩沖液AW1，蓋上蓋子，使用離心機(jī)Thermo(Micro CL17)，6000×g常溫離心1min。

(10)小心將QIAamp Mini spin column轉(zhuǎn)移至新的收集管中，加入700ul緩沖液AW2，蓋上蓋子，使用離心機(jī)Thermo(Micro CL17)，14000×g常溫離心2min。

(11)將QIAamp Mini spin column轉(zhuǎn)移至新的收集管中，管蓋反向，全速離心4min。

(12)將QIAamp Mini spin column轉(zhuǎn)移至新的收集管中，打開蓋子，至于55℃下晾干10min。

(13)將QIAamp Mini spin column轉(zhuǎn)移至干凈的1.5ml Eppendorf離心管中，向膜中央加入32ul預(yù)熱過的緩沖液AE，蓋上蓋子，55℃孵育5min。

(14)使用離心機(jī)Thermo(Micro CL17)，6000×g常溫離心2min。

(15)丟棄掉QIAamp Mini spin column，小心蓋好蓋子，在EP管上做好標(biāo)記。

(16)使用Qubit dsDNA HS Assay對(duì)提取的DNA進(jìn)行定量操作。

3.檢測(cè)結(jié)果：

最后測(cè)得終產(chǎn)物濃度為：0.41ng/ul。

對(duì)照組實(shí)施例

1.試劑準(zhǔn)備：

蛋白酶K(天根)，緩沖液ACL(Qiagen)，緩沖液ACB(Qiagen)，Circulating Column(Qiagen)，緩沖液ACW1(Qiagen)，緩沖液ACW2(Qiagen)，無水乙醇(國(guó)藥)，緩沖液AVE(Qiagen)。

2.實(shí)驗(yàn)操作過程：

(1)向每管中加入100ul蛋白酶K，再向其中加入0.8ml緩沖液ACL，渦旋振蕩30s，56℃水浴鍋孵育30min后取出，加入1.8ml緩沖液ACB，渦旋振蕩30s，置于冰上5min。

(2)使用抽濾設(shè)備，將以上混合溶液加入至Circulating column中，抽干后，分別用600ul緩沖液ACW1，緩沖液750ul ACW2，緩沖液750ul 100％乙醇洗柱，抽干后取下。

(3)置于新的收集管中，最大轉(zhuǎn)速離心5min，取出，棄收集管。

(4)將Circulating column置于新的收集管中，56℃烘箱10min，緩沖液AVE同時(shí)預(yù)熱。

(5)取出，將Circulating column置于新收集管中，向膜中央緩緩加入30ul洗脫液AVE。

(6)蓋上蓋子，56℃孵育5min后，最大轉(zhuǎn)速離心2min。

(7)使用Qubit dsDNA HS Assay對(duì)提取的DNA進(jìn)行定量操作。

3.檢測(cè)結(jié)果：

最后測(cè)得終產(chǎn)物濃度為：0.35ng/ul。

圖1是本發(fā)明提供的基于離心柱法的外周血游離DNA的提取試劑盒與現(xiàn)有試劑盒的成本消耗對(duì)比示意圖。其中，現(xiàn)有試劑盒中試劑盒A為：MagMAX Cell-Free DNA Isolation Kit(Thermo)，試劑盒B為：NextPrep-Mag^TM cfDNA Isolation Kit(Bioo Scientific)，試劑盒C為：QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Qiagen)。

從圖1和圖2可以看出，本發(fā)明使用的改進(jìn)的離心柱法外周血游離核酸高質(zhì)量提取方法，與對(duì)照組的提取方法相比，所用試劑成分簡(jiǎn)單，操作方便，成本低廉，不需特殊設(shè)備，并能顯著降低成本和提高核酸提取率，在同等血漿量的情況下提取外周血游離核酸的得率已達(dá)到市面高價(jià)試劑盒的要求。

綜上所述，本發(fā)明可有效提高外周血游離核酸的提取得率，有效的降低成本，大大改善科研人員在提取外周血游離核酸中所遭遇的問題。

應(yīng)當(dāng)理解，上述實(shí)施例僅為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。