本發(fā)明屬于藥物制劑
技術(shù)領(lǐng)域：
：，具體涉及一種靶向酸性環(huán)境的pH敏感性多肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：細(xì)胞穿膜肽(cell-penetratingpeptides，CPPs)，是一類(lèi)由不超過(guò)30個(gè)氨基酸殘基組成的小分子多肽，具有很強(qiáng)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力和生物相容性，根據(jù)氨基酸組成的不同，可分為陽(yáng)離子CPPs和兩親性CPPs。盡管CPPs能夠有效介導(dǎo)外源性生物大分子的入胞作用，但由于缺乏特異性限制了CPPs的體內(nèi)應(yīng)用?；陉?yáng)離子CPPs的電荷特性，近年來(lái)通過(guò)“先屏蔽再激活”的策略構(gòu)建的環(huán)境敏感性細(xì)胞穿膜肽已經(jīng)成為新的研究熱點(diǎn)，尤其是針對(duì)生理或病理?xiàng)l件下人體中所存在的酸性微環(huán)境。人體中，酸性微環(huán)境的部位主要包括腫瘤、炎癥或感染部位、細(xì)胞內(nèi)涵體或溶酶體等。其中，由于腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖分化能力，腫瘤部位氧供不足，使得腫瘤組織細(xì)胞外微環(huán)境含有較多乳酸，其細(xì)胞外的pH值(6.5～6.8)普遍低于正常組織和血液的pH值(7.2～7.4)。因此，近年來(lái)，針對(duì)腫瘤微環(huán)境的以上特點(diǎn)，利用腫瘤組織這一特殊的微環(huán)境構(gòu)建pH敏感型藥物傳遞系統(tǒng)成為中外學(xué)者們的研究熱點(diǎn)。參考文獻(xiàn)：1.VijayA.Sethuraman，YouHanBae.TATpeptide-basedmicellesystemforpotentialactivetargetingofanti-canceragentstoacidicsolidtumors.JournalofControlledRelease118(2007)216-224.2.A.M.Hamilton，S.Aidoudi-Ahmed，S.Sharma，V.R.Kotamraju，P.J.Foster，K.N.Sugahara，E.Ruoslahti，B.K.Rutt.Nanoparticlescoatedwiththetumor-penetratingpeptideiRGDreduceexperimentalbreastcancermetastasisinthebrain.J.Mol.Med.，93(2015).991-1001.3.S.W.Chung，B.S.Lee，J.U.Choi，S.W.Kim，I.-S.Kim，S.Y.Kim，Y.Byun.OptimizationofastablelinkerinvolvedDEVDpeptide-doxorubicinconjugatethatisactivateduponradiation-inducedcaspase-3-mediatedapoptosis.J.Med.Chem.，58(2015).6435-6447.4.SoonSikKwon，SunYoungKim，BongJuKong.CellpenetratingpeptideconjugatedliposomesastransdermaldeliverysystemofPolygonumaviculareL.extract.InternationalJournalofPharmaceutics483(2015)26-37.5.XiaoyingChen，JennicaZaro，andWei-ChiangShen.FusionProteinLinkers：Property，DesignandFunctionality.AdvDrugDelivRev.2013Oct15；65(10)：1357-1369.技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：解決的技術(shù)問(wèn)題：本發(fā)明的目的是提供一種靶向于酸性微環(huán)境的pH敏感性多肽及其應(yīng)用，該多肽表現(xiàn)出易于與腫瘤細(xì)胞親和的靶向性，對(duì)腫瘤靶向治療具有重要意義。技術(shù)方案：一種pH敏感性多肽，包括凈電荷可逆變化的肽鏈HX、柔性肽鏈Y和細(xì)胞穿膜肽CPP三部分，其結(jié)構(gòu)為HX-Y-CPP或CPP-Y-HX。進(jìn)一步地，所述凈電荷可逆變化的肽鏈HX由組氨酸H與谷氨酸E或天冬氨酸D的一種或兩種組成。進(jìn)一步地，所述柔性肽鏈Y是由單一氨基酸或混合氨基酸組成。進(jìn)一步地，所述細(xì)胞穿膜肽CPP為含有正電性氨基酸的肽鏈。上述pH敏感性多肽在納米靶向遞藥系統(tǒng)中的應(yīng)用。一種納米靶向脂質(zhì)體遞藥系統(tǒng)，包括脂質(zhì)載體材料和pH敏感性多肽修飾的兩親性嵌段共聚物。進(jìn)一步地，所述脂質(zhì)載體和pH敏感性多肽修飾的兩親性嵌段共聚物的摩爾比例為99∶1-9∶1，優(yōu)選為19∶1。進(jìn)一步地，所述脂質(zhì)載體材料選自中性脂質(zhì)載體材料、陽(yáng)離子脂質(zhì)載體材料或陰離子脂質(zhì)載體材料。進(jìn)一步地，所述pH敏感性多肽修飾的兩親性嵌段共聚物是將pH敏感性多肽與兩親性嵌段共聚物的親水段進(jìn)行共價(jià)連接。上述納米靶向脂質(zhì)體遞藥系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟：步驟1，采用共價(jià)連接合成pH敏感性多肽修飾的兩親性嵌段共聚物；步驟2，制備包含脂質(zhì)載體材料和pH敏感性多肽修飾的兩親性嵌段共聚物的脂質(zhì)體。有益效果：pH敏感性多肽修飾的脂質(zhì)體可有效實(shí)現(xiàn)多肽攜帶載體進(jìn)入細(xì)胞的穿透細(xì)胞膜的能力。并通過(guò)pH敏感性多肽的電荷可逆的轉(zhuǎn)變，減少在非靶部位的吸收攝取，增加多種藥物的主動(dòng)靶向效果。附圖說(shuō)明圖1為pH敏感性多肽的作用機(jī)制圖；圖2為實(shí)施例1中HE-CPP修飾的脂質(zhì)體在不同pH的PBS緩沖液里的Zeta電荷變化；圖3為檢測(cè)例1中空白脂質(zhì)體、CPP修飾的脂質(zhì)體和HE-CPP修飾的的脂質(zhì)體對(duì)Hela細(xì)胞增值的抑制效果；圖4為檢測(cè)例2中CPP修飾的脂質(zhì)體和HE-CPP修飾的的脂質(zhì)體在2h和6h時(shí)不同pH條件下的細(xì)胞攝取。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。細(xì)胞穿膜肽(cell-penetratingpeptides，CPPs)，也稱為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(proteintransductiondomains，PTDs)或膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(membranetransductionpeptides，MTPs)，是一類(lèi)由不多于30個(gè)氨基酸殘基組成的小分子多肽，自從1988的HIVTAT發(fā)現(xiàn)以來(lái)，通過(guò)蛋白結(jié)構(gòu)分析衍生，或通過(guò)構(gòu)效關(guān)系研究合成不斷地發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞穿膜肽，具有很強(qiáng)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力，而且能夠攜帶比其分子質(zhì)量大100倍的外源性大分子(蛋白質(zhì)或者載體等)進(jìn)入細(xì)胞，是一系列具有高效介導(dǎo)入胞能力的短肽。以其理化性質(zhì)為基礎(chǔ)，細(xì)胞穿膜肽可以簡(jiǎn)單的劃分為三類(lèi)：陽(yáng)離子細(xì)胞穿膜肽、疏水性細(xì)胞穿膜肽和兩親性細(xì)胞穿膜肽。其中，陽(yáng)離子細(xì)胞穿膜肽中的氨基酸殘基主要由精氨酸和賴氨酸組成。兩親性細(xì)胞穿膜肽則主要由賴氨酸組成，序列中還分布有親水或疏水性的其它氨基酸殘基，其空間構(gòu)象主要為α-螺旋結(jié)構(gòu)。然而，細(xì)胞穿膜肽的應(yīng)用受到較大的局限性，一方面，細(xì)胞穿膜肽較強(qiáng)的正電性導(dǎo)致其在血液循環(huán)中極易與血漿蛋白或調(diào)理素結(jié)合后被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬；另一方面，細(xì)胞穿膜肽作為一種非特異性的“功能分子”，能夠非選擇性地介導(dǎo)穿透進(jìn)入所有細(xì)胞，這樣的特點(diǎn)限制了細(xì)胞穿膜肽在全身系統(tǒng)給藥中的應(yīng)用。本發(fā)明基于對(duì)肽鏈長(zhǎng)度、氨基酸組成及序列、氨基酸側(cè)鏈pKa、重組多肽等電點(diǎn)、不同pH條件下重組多肽凈電荷、多肽序列與其二級(jí)結(jié)構(gòu)的相關(guān)性等多種因素的考慮，構(gòu)建了一種pH敏感性多肽。包括凈電荷可逆變化的肽鏈HX、柔性肽鏈Y和細(xì)胞穿膜肽CPP三部分，其結(jié)構(gòu)為HX-Y-CPP，其中，1)凈電荷可逆變化的肽鏈HX是由組氨酸H與谷氨酸E或天冬氨酸D的一種或兩種組成，優(yōu)選谷氨酸E；HX序列可以為組氨酸和負(fù)電性氨基酸的任意組合和排列，優(yōu)選組氨酸和負(fù)電性氨基酸等比例的重復(fù)序列，即(HX)a；HX序列中含有負(fù)電性氨基酸的數(shù)量應(yīng)不少于細(xì)胞穿膜肽中正電性氨基酸的數(shù)量，且不大于細(xì)胞穿膜肽中正電性氨基酸的數(shù)量的3倍；2)柔性肽鏈Y由單一氨基酸或混合氨基酸組成；3)細(xì)胞穿膜肽CPP為含有正電性氨基酸的多肽鏈段。如圖1所示，HX-Y-CPP中，HX為凈電荷可逆變化的肽鏈，X為帶負(fù)電的氨基酸，H在正常生理pH條件下不帶電，在酸性pH條件下帶正電；CPP為含有正電性氨基酸殘基的多肽鏈段；Y為柔性連接將HX與CPP相連，使HX和CPP能夠通過(guò)靜電作用相互吸附。在正常生理pH條件下，即pH＝7.4時(shí)，CPP所帶正電被HX所帶負(fù)電荷吸附而呈“發(fā)卡結(jié)構(gòu)”，HX-Y-CPP凈電荷為零或負(fù)，表現(xiàn)為非激活狀態(tài)；在酸性條件下，即pH≤6.5時(shí)，H被質(zhì)子化干擾HX與CPP靜電結(jié)合的穩(wěn)定性，且HX-Y-CPP凈電荷變?yōu)檎蛄?，?dǎo)致HX與CPP分離使CPP發(fā)揮穿膜作用。而在腫瘤部位被特異性激活而未被腫瘤細(xì)胞及時(shí)攝取，重新進(jìn)入血液循環(huán)后依然表現(xiàn)為非激活狀態(tài)，此為可逆活化，有效保證了藥物遞送系統(tǒng)的特異性和安全性。作為上述的這些細(xì)胞穿膜肽CPP，只要能夠發(fā)揮其介導(dǎo)載體實(shí)現(xiàn)高效跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力的目的即可，沒(méi)有特別限定，可以舉出：核轉(zhuǎn)錄激活子Tat蛋白，Tat-(47-57)(YGRKKRRQRRR)，HIV-1Rev-(34-50)(TRQARRNRRRRWRERQR)，果蠅觸角控制基因蛋白，Antp(43-58)(RQIKIYFQNRRMKWKK)，F(xiàn)HV外殼蛋白(35-49)(RRRRNRTRRNRRRVR)，小分子寡聚精氨酸[(R)n]，小分子寡聚賴氨酸[(K)n]，MAP(KLALKLALKALKAALKLA)及其類(lèi)似物，transportan等。作為上述的柔性肽鏈Y，只要能夠發(fā)揮其橋接HX與CPP且不影響HX與CPP相互作用的目的即可，沒(méi)有特別限定，可以舉出：(GGGGS)n、KESGSVSSEQLAQFRSLD、EGKSSGSGSESKST、(G)n、GSAGSAAGSGEF等。本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供了一種包含pH敏感性多肽的納米靶向遞藥系統(tǒng)，可以為脂質(zhì)體、膠束、固體脂質(zhì)納米粒、聚合物納米粒、多肽-藥物偶聯(lián)納米載體等。VijayA.Sethuraman等制備TAT修飾的PEG-PLA膠束載體，并通過(guò)PSD(甲基丙烯?；前范籽踵奏?-b-PEG中的PSD在中性環(huán)境下的負(fù)電荷與TAT電荷中和，但在酸性環(huán)境(6.5-6.0)下不顯電性使得TAT發(fā)揮穿膜效果。pH敏感性多肽修飾的膠束在pH6.0的細(xì)胞攝取量相較pH7.4顯著增加，實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向作用。A.M.Hamilton等將iRGD修飾在納米粒上，表明修飾了iRGD的包載阿霉素的納米粒相比水溶性的iRGD能夠增加其防止腫瘤轉(zhuǎn)移的效果。S.W.Chung等將阿霉素與四肽DEVD偶聯(lián)，可減少阿霉素在體內(nèi)的毒性，并通過(guò)篩選不同的敏感性連接鍵實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)部敏感釋藥發(fā)揮作用。上述遞藥系統(tǒng)可以遞送抗癌藥物和抗生素等藥物，可選自烷化劑、抗生素、植物生物堿、鉑類(lèi)化合物等，具體藥物如紫杉醇、多西他賽、奧沙利鉑、阿霉素、吉西他濱、放線菌素D等。具體的，本發(fā)明提供了一種納米靶向脂質(zhì)體遞藥系統(tǒng)，包括脂質(zhì)載體材料和pH敏感性多肽修飾的兩親性嵌段共聚物。其制備方法是先采用共價(jià)反應(yīng)合成pH敏感性多肽修飾的兩親性嵌段共聚物；再制備包含脂質(zhì)載體材料和pH敏感性多肽修飾的兩親性嵌段共聚物的脂質(zhì)體。上述步驟中的多肽與嵌段共聚物共價(jià)連接的反應(yīng)可以為邁克爾加成反應(yīng)、雙鍵加成反應(yīng)，酯化反應(yīng)、酰胺化反應(yīng)和巰基-巰基反應(yīng)等。SoonSikKwon等通過(guò)硫醇-馬來(lái)酰亞胺邁克爾加成反應(yīng)將CPP共價(jià)連接于DOPC上，過(guò)量的半胱氨酸飽和剩余的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)，成功將CPP修飾于脂質(zhì)體上發(fā)揮其作用。也有研究將多肽羧基與PEG端-OH酯化反應(yīng)，將多肽端的氨基與PEG端羧基酰胺化反應(yīng)接至載體上。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，是將pH敏感性細(xì)胞穿膜肽通過(guò)PEG鏈連接于脂質(zhì)載體材料上，具體的，將pH敏感性多肽通過(guò)半胱氨酸和Mal-PEG-DSPE上的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)連接修飾在脂質(zhì)載體材料的外殼上，修飾pH敏感的在腫瘤酸性條件下可實(shí)現(xiàn)電荷逆轉(zhuǎn)的多肽后，使得脂質(zhì)體遞藥系統(tǒng)表現(xiàn)出易于被腫瘤細(xì)胞攝取的靶向性。首先，采用邁克爾加成反應(yīng)合成HX-Y-CPP，本發(fā)明實(shí)施例中使用CR6G5(HE)10(以下簡(jiǎn)稱為HE-CPP)修飾的HE-CPP-PEG-DSPE，其中，C為半胱氨酸，連接在HE末端，提供巰基。HE-CPP和Mal-PEG-DSPE的摩爾比例范圍為1.1∶1-1.4∶1，優(yōu)選1.25∶1；采用的溶劑可以是二氯甲烷或四氫呋喃，優(yōu)選四氫呋喃；用三乙胺調(diào)pH至6.5-7.2，優(yōu)選7.0；反應(yīng)溫度范圍為25-40℃，優(yōu)選37℃；反應(yīng)時(shí)間為18-48小時(shí)，優(yōu)選24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法除去有機(jī)溶劑，加入5-40mL蒸餾水水化，后冷凍干燥保存。采用薄膜分散法制備載藥脂質(zhì)體，稱取天然磷脂、膽固醇、藥物、HE-CPP-PEG-DSPE均勻混合后加入有機(jī)溶劑溶解，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上去除有機(jī)溶劑成膜，加入水溶液水化后，采用探頭超聲、高速剪切機(jī)或擠出器制備出脂質(zhì)體，溶劑為三氯甲烷和甲醇的混合溶劑，超聲功率為10-30％，優(yōu)選20％；藥物和脂質(zhì)的質(zhì)量比范圍為1∶10-1∶20，優(yōu)選1∶15；DSPE-PEG-HE-CPP占磷脂的總摩爾比例為1％-10％，優(yōu)選為5％。本發(fā)明以多種疏水性小分子抗癌藥物(如紫杉醇、多西紫杉醇等)其中一種為模型，按照上述方法制備載藥脂質(zhì)體，載藥量為60％至90％。以下實(shí)施例所采用的HE-CPP由合肥國(guó)肽生物科技有限公司合成提供。實(shí)施例1HE-CPP-PEG-DSPE的合成稱取5.6mgMal-PEG-DSPE(梵碩生物科技有限公司，B06012)于1.5mLEP管中，加入1mLDMF溶解后，加入9mgHE-CPP溶解震蕩使其均勻分散，用三乙胺調(diào)pH至7.0。反應(yīng)管中沖氮?dú)獗Ｗo(hù)密封，于37℃振搖反應(yīng)24h。于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸掉有機(jī)溶劑DMF，置于干燥器中抽真空4個(gè)小時(shí)，加入水溶液1.5mL水化后凍干保存。反應(yīng)前和反應(yīng)后產(chǎn)物分別配置等摩爾濃度，取96孔板，每孔加入100μL樣品，再加入1mM的DTNB溶液100μL，酶標(biāo)儀450nm檢測(cè)，通過(guò)Ellmantest檢測(cè)巰基的反應(yīng)殘留量計(jì)算反應(yīng)效率，其中HE-CPP-PEG-DSPE得率為55.04％。HE-CPP修飾的脂質(zhì)體的制備稱取120mgSPC(aladdin，G1517069)、20mgCH(膽固醇，上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司，B40333)、10.46mgHE-CPP-PEG-DSPE完全溶解于氯仿中，轉(zhuǎn)移至250mL茄形瓶中，40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉氯仿，鋪成均勻的單分子層膜，放在干燥器中抽真空過(guò)夜。加入蒸餾水5mL水化脂質(zhì)單分子層膜，振搖使其成為初級(jí)脂質(zhì)體，探頭超聲5min，200W，將制得的藍(lán)色乳光溶液過(guò)0.22μm濾膜，得到粒徑均一的HE-CPP修飾的脂質(zhì)體，即HE-CPP-L。用瑪爾文粒徑測(cè)定儀，采用動(dòng)態(tài)光散射法技術(shù)測(cè)定樣品粒徑，使用ZetaSize3000HS軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理，測(cè)得HE-CPP-L的粒徑為120.1nm。HE-CPP-L的電位變化分別配置pH為6.0、6.5、7.0、7.5的磷酸鹽緩沖液，將制備得到的HE-CPP-L分別取500μL加入至3mL的緩沖液中，混合均勻并穩(wěn)定后測(cè)定電位，結(jié)果如圖2，HE-CPP修飾的脂質(zhì)體在pH6.4-6.8范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)電荷逆轉(zhuǎn)，由pH為7.4時(shí)負(fù)電荷轉(zhuǎn)變?yōu)檎姾蓮亩C明其體外pH敏感性。實(shí)施例2CPP-PEG-DSPE的合成稱取5.6mgMal-PEG-DSPE于1.5mLEP管中，加入1mLDMF溶解后，加入2.5mgR6溶解混勻，其余操作同實(shí)施例1。采用實(shí)施例1的方法檢測(cè)合成得率，CPP-PEG-DSPE得率為89.62％。CPP修飾的脂質(zhì)體的制備稱取120mgSPC，20mgCH，10.46mgCPP-PEG-DSPE完全溶解于氯仿中，轉(zhuǎn)移至250mL茄形瓶中，40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉氯仿，鋪成均勻的單分子層膜，放在干燥器中抽真空過(guò)夜。加入蒸餾水5mL水化脂質(zhì)單分子層膜，振搖使其成為初級(jí)脂質(zhì)體，探頭超聲5min，200W，將制得的藍(lán)色乳光溶液過(guò)0.22μm濾膜，得到粒徑均一的CPP修飾的脂質(zhì)體，即CPP-L。用馬爾文粒徑測(cè)定儀，采用動(dòng)態(tài)光散射法技術(shù)測(cè)定樣品粒徑，使用ZetaSize3000HS軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理，測(cè)得CPP-L的粒徑為123.7nm。檢測(cè)例1空白載體的細(xì)胞毒性試驗(yàn)空白脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性采用MTT法評(píng)價(jià)。取96孔板，收集對(duì)數(shù)期Hela細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度，每孔加入200μL，使每孔細(xì)胞數(shù)為6000個(gè)左右，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后取出板，棄去舊培養(yǎng)基。用7.4的空白培養(yǎng)基配制系列濃度的普通脂質(zhì)體溶液，CPP-L溶液，HE-CPP-L溶液，每孔加入200μL的載體溶液，于5％CO2，37℃孵育24h后，每孔加入0.5mg/mL的MTT溶液200μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入DMSO150μL，低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔的吸光值。同時(shí)設(shè)置對(duì)照孔(細(xì)胞、培養(yǎng)基、培養(yǎng)液、MTT、DMSO)、空白組(培養(yǎng)基、培養(yǎng)液、MTT、DMSO)。如圖3所示，結(jié)果表明修飾過(guò)多肽的脂質(zhì)體相較未修飾的脂質(zhì)體毒性減小。Cellinhibitionpercent(％)＝(1-Asample/Acontrol)×100％Cellviability(％)＝100-Cellinhibitionpercent其中，Asample是與脂質(zhì)體作用的細(xì)胞樣品孔的吸收，Acontrol是不與脂質(zhì)體作用的細(xì)胞樣品孔的吸收。檢測(cè)例2HE-CPP-L和CPP-L對(duì)Hela細(xì)胞在不同時(shí)間、不同pH的攝取轉(zhuǎn)染前一天，將4-5*104/孔Hela細(xì)胞接種于6孔板，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。1g～24h后于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞匯合至60％～70％時(shí)，置于超凈工作臺(tái)中操作。吸去培養(yǎng)基，用PBS(pH7.4)洗3次，按照給藥濃度香豆素為200ng/mL，分別將載香豆素的空白脂質(zhì)體和HE-CPP-L，CPP-L用不同pH(7.4，6.0)的培養(yǎng)基稀釋?zhuān)尤肓装逯校靠?mL，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染2h和6h后，取出六孔板，用PBS洗滌五次，加入500μl胰酶消化后，加入1mL培養(yǎng)基終止消化，離心后棄掉上次培養(yǎng)基，加入PBS500μL重懸，使其混合均勻后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定分析(Ex＝488nm；Em＝530nm)，計(jì)算平均熒光強(qiáng)度。結(jié)果見(jiàn)圖4，在2h和6h的攝取結(jié)果顯示，Liposome-HE-CPP在pH6.5和pH7.4條件下攝取具有顯著性差異，pH7.4條件下，HE可有效掩蔽CPP的穿膜效果，而在6.5的pH下可實(shí)現(xiàn)彈出CPP，增加在酸性環(huán)境下細(xì)胞的攝取。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3