本發(fā)明屬于臨床診斷領(lǐng)域，涉及肺腺癌篩查診斷試劑，具體涉及血漿microRNAs用于制備篩查診斷肺腺癌患者的診斷試劑的用途。

背景技術(shù)：

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤，死亡率居惡性腫瘤之首。我國(guó)肺癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，年平均增長(zhǎng)近2％。肺癌根據(jù)病理學(xué)特點(diǎn)的不同分為多種組織類型，肺癌組織類型不同，其治療措施也不同。根據(jù)2004版WHO分類，常見肺癌組織病理學(xué)分型分為非小細(xì)胞癌(NSCLC)和小細(xì)胞癌(SCLC)。非小細(xì)胞癌又分為鱗狀細(xì)胞癌(SCC)、腺癌(AC)和大細(xì)胞癌(LCC)。不同肺癌臨床治療方案不同，預(yù)后效果也不同。因此，為了提高治療效果，肺癌的治療策略已經(jīng)從傳統(tǒng)的以分期為基礎(chǔ)的治療模式轉(zhuǎn)變?yōu)橐越M織學(xué)類型和基因突變?yōu)橹笇?dǎo)的個(gè)體化、精準(zhǔn)的多學(xué)科治療模式。個(gè)體化治療提高了肺癌的治療和預(yù)后效果。

腺癌作為最常見的肺癌組織學(xué)類型，在全球及我國(guó)發(fā)病率均呈上升趨勢(shì)。流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病有明顯的性別差異，尤其是腺癌。腺癌占原發(fā)肺癌的50％，是非吸煙患者的主要組織學(xué)類型。目前在肺癌研究最深入、臨床應(yīng)用最多的是針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR的小分子酪氨酸激酶抑制劑，而易瑞沙、吉非替尼和厄洛替尼是其主要的代表。隨著對(duì)這類小分子靶向治療藥物研究的深入，逐漸發(fā)現(xiàn)其療效與肺癌患者的臨床特征相關(guān)，其中亞裔、女性、腺癌、不吸煙是其臨床“優(yōu)勢(shì)人群”的主要特征(楊新杰等，鹽酸?？颂婺嵋痪€治療晚期肺腺癌的臨床療效觀察，中國(guó)肺癌雜志2013年7月；馬智勇等，易瑞沙治療男性、不吸煙或輕度吸煙的晚期肺腺癌患者療效研究，醫(yī)藥論壇雜志2010年11月)。

這些結(jié)果讓研究者得出一個(gè)推測(cè)：腺癌在男性和女性中的發(fā)病率、發(fā)病機(jī)制和臨床治療效果均存在差異。為了適應(yīng)個(gè)性化治療，腺癌的研究有必要分性別開展。

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院黃威博士在畢業(yè)論文“三種病理亞型肺癌組織中腫瘤標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)、驗(yàn)證及其靶基因的初步篩選”中詳細(xì)研究了用于肺癌診斷的microRNAs標(biāo)記物。首先，作者應(yīng)用激光捕獲顯微切割技術(shù)從44例正常肺組織、36例腺癌、30例鱗癌及16例小細(xì)胞癌中獲取純的上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，進(jìn)行全基因組microRNAs表達(dá)分析，經(jīng)過(guò)方差分析和聚類分析發(fā)現(xiàn)16個(gè)差異表達(dá)的microRNAs可以區(qū)分三種肺癌病理亞型(肺腺癌、肺鱗癌和小細(xì)胞肺癌)，并最終確定其中的7個(gè)作為候選標(biāo)記物進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證；然后，作者在三種病理亞型肺癌組織中驗(yàn)證7個(gè)候選microRNAs腫瘤標(biāo)記物，建立診斷肺癌病理亞型的回歸模型，并且分析7個(gè)候選microRNAs的預(yù)后價(jià)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)蝹€(gè)候選microRNA鑒別正常肺組織與肺腺癌的AUC值不理想，經(jīng)過(guò)Logistic回歸分析建立模型發(fā)現(xiàn)hsa-miR-375和hsa-miR-34a兩個(gè)相互配合可以得到最佳AUC 0.910，敏感性80％，特異性97％，敏感度較低。也就是說(shuō)，經(jīng)過(guò)作者的研究，無(wú)論是單個(gè)microRNA還是多個(gè)microRNAs的聯(lián)合均不能有效診斷區(qū)分正常肺組織與肺腺癌，準(zhǔn)確度和敏感度不盡如人意。而且，該方法是一種基于組織中標(biāo)志物的方法，需要取患者的肺組織用于檢測(cè)，依然是一種介入診斷方法，不方便。

申請(qǐng)人認(rèn)為，上述博士論文未能篩選出有效診斷區(qū)分正常肺組織與肺腺癌的microRNAs的關(guān)鍵原因在于忽視了肺腺癌的性別差異，樣本分類錯(cuò)誤，自然無(wú)法得出理想結(jié)果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供血漿microRNAs用于制備篩查診斷肺腺癌患者的診斷試劑的用途；具體地，為提高篩查的準(zhǔn)確度、敏感度和特異性，根據(jù)性別差異，提供一組血漿microRNAs標(biāo)記物用于制備篩查診斷男性群體中肺腺癌患者的診斷試劑，提供另外一組血漿microRNAs標(biāo)記物用于制備篩查診斷女性群體中肺腺癌患者的診斷試劑。

上述目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

篩查診斷男性群體中肺腺癌患者的技術(shù)方案如下：

一組用于篩查診斷男性群體中肺腺癌患者的血漿microRNAs標(biāo)記物，由如下microRNAs組成：miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-564、miR-615-5p、miR-601；miR-224-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；miR-146a-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；miR-564的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；miR-615-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；miR-601的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

一組篩查診斷男性群體中肺腺癌患者的microRNAs引物、探針的組合，microRNAs引物包括反轉(zhuǎn)錄引物、定量PCR前引物和定量PCR后引物：miR-224-3p的反轉(zhuǎn)錄引物序列如SEQ ID NO.9所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.17所示，定量PCR后引物序列如SEQ ID NO.25所示；miR-146a-5p的反轉(zhuǎn)錄引物序列如SEQ ID NO.10所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.18所示，定量PCR后引物序列如SEQ ID NO.25所示；miR-564的反轉(zhuǎn)錄引物序列如SEQ ID NO.11所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.19所示，定量PCR后引物序列如SEQ ID NO.25所示；miR-615-5p的反轉(zhuǎn)錄引物序列如SEQ ID NO.12所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.20所示，定量PCR后引物序列如SEQ ID NO.25所示；miR-601的反轉(zhuǎn)錄引物序列如SEQ ID NO.13所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.21所示，定量PCR后引物序列如SEQ ID NO.25所示；各microRNAs探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。

一種用于篩查診斷男性群體中肺腺癌患者的診斷試劑，含有上述microRNAs引物、探針的組合。

一種用于篩查診斷男性群體中肺腺癌患者的診斷試劑盒，含有上述microRNAs引物、探針的組合。

進(jìn)一步地，所述的診斷試劑盒還含有PCR反應(yīng)常用的酶和試劑，如逆轉(zhuǎn)錄酶、緩沖液、dNTPs、MgCl2、DEPC水和Taq酶等，以及標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰?/p>

篩查診斷女性群體中肺腺癌患者的技術(shù)方案如下：

一組用于篩查診斷女性群體中肺腺癌患者的血漿microRNAs標(biāo)記物，由如下microRNAs組成：miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-648、miR-523-5p、miR-758-5p；miR-224-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；miR-146a-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；miR-648的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；miR-523-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；miR-758-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

一組篩查診斷女性群體中肺腺癌患者的microRNAs引物、探針的組合，microRNAs引物包括反轉(zhuǎn)錄引物、定量PCR前引物和定量PCR后引物：miR-224-3p的反轉(zhuǎn)錄引物序列如SEQ ID NO.9所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.17所示，定量PCR后引物序列如SEQ ID NO.25所示；miR-146a-5p的反轉(zhuǎn)錄引物序列如SEQ ID NO.10所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.18所示，定量PCR后引物序列如SEQ ID NO.25所示；miR-648的反轉(zhuǎn)錄引物序列如SEQ ID NO.14所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.22所示，定量PCR后引物序列如SEQ ID NO.25所示；miR-523-5p的反轉(zhuǎn)錄引物序列如SEQ ID NO.15所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.23所示，定量PCR后引物序列如SEQ ID NO.25所示；miR-758-5p的反轉(zhuǎn)錄引物序列如SEQ ID NO.16所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.24所示，定量PCR后引物序列如SEQ ID NO.25所示；各microRNAs探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。

一種用于篩查診斷女性群體中肺腺癌患者的診斷試劑，含有上述microRNAs引物、探針的組合。

一種用于篩查診斷女性群體中肺腺癌患者的診斷試劑盒，含有上述microRNAs引物、探針的組合。

進(jìn)一步地，所述的診斷試劑盒還含有PCR反應(yīng)常用的酶和試劑，如逆轉(zhuǎn)錄酶、緩沖液、dNTPs、MgCl2、DEPC水和Taq酶等，以及標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰?/p>

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明提供的一組血漿microRNAs標(biāo)記物可以準(zhǔn)確用于篩查診斷男性群體中肺腺癌患者，靈敏度高，特異性強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)男性群體中肺腺癌患者的無(wú)介入診斷；本發(fā)明提供的另一組血漿microRNAs標(biāo)記物可以準(zhǔn)確用于篩查診斷女性群體中肺腺癌患者，靈敏度高，特異性強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)女性群體中肺腺癌患者的無(wú)介入診斷。

附圖說(shuō)明

圖1為5個(gè)microRNAs(miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-564、miR-615-5p、miR-601)聯(lián)合診斷區(qū)分男性病例組和男性健康對(duì)照組的ROC曲線圖；

圖2為5個(gè)microRNAs(miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-648、miR-523-5p、miR-758-5p)聯(lián)合診斷區(qū)分女性病例組和女性健康對(duì)照組的ROC曲線圖；

圖3為驗(yàn)證集中用5個(gè)microRNAs(miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-564、miR-615-5p、miR-601)聯(lián)合診斷區(qū)分男性病例組和男性健康對(duì)照組的準(zhǔn)確性圖；

圖4為驗(yàn)證集中用5個(gè)microRNAs(miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-648、miR-523-5p、miR-758-5p)聯(lián)合診斷區(qū)分女性病例組和女性健康對(duì)照組的準(zhǔn)確性圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖詳細(xì)介紹本發(fā)明的技術(shù)方案和技術(shù)效果。

肺腺癌患者和健康志愿者自2014年9月至2015年9月期間于南京軍區(qū)南京總醫(yī)院和南京鼓樓醫(yī)院收集，取血經(jīng)患者同意并通過(guò)南京軍區(qū)南京總醫(yī)院和南京鼓樓醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。男性病例組由96名原發(fā)性肺腺癌男性患者組成，女性病例組由82名原發(fā)性肺腺癌女性患者組成，取血之前均未進(jìn)行手術(shù)、化療、放療或內(nèi)分泌治療。男性健康對(duì)照組和女性健康對(duì)照組分別由58例男性健康志愿者和54例女性健康志愿者組成。樣本年齡均在25-60歲之間，男性病例組與男性健康對(duì)照組以及女性病例組與女性健康對(duì)照組之間年齡均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值分別為0.072和0.068)。所有患者和健康志愿者均經(jīng)過(guò)組織病理確證。將男性病例組、女性病例組、男性健康對(duì)照組、女性健康對(duì)照組隨機(jī)對(duì)半分成測(cè)試集和驗(yàn)證集。測(cè)試集用于血漿差異microRNAs的發(fā)現(xiàn)，并初步用于評(píng)價(jià)差異microRNAs作為標(biāo)記物篩查男性群體中肺腺癌患者和篩查女性群體中肺腺癌患者的診斷效能；驗(yàn)證集用于進(jìn)一步驗(yàn)證microRNAs標(biāo)記物的診斷準(zhǔn)確性。樣本分組情況如下表：

實(shí)施例1：基于microRNA芯片的血漿差異microRNA發(fā)現(xiàn)及定量確證

一、實(shí)驗(yàn)材料

1、儀器試劑

高速離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；NanoDrop 1000分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾Thermo Scientific公司；Agilent 2100Bioanalyzer System購(gòu)自美國(guó)Agilent公司；普通PCR反應(yīng)儀和實(shí)時(shí)熒光PCR儀購(gòu)自美國(guó)PE公司；DYCP-31B型電泳儀購(gòu)自北京六一生物科技有限公司；BIO-RAD凝膠成像分析購(gòu)自美國(guó)伯樂；超低溫冰箱購(gòu)自海爾集團(tuán)。mirvana^TMparis^TMkit購(gòu)自美國(guó)Ambion公司；Agilent RNA 6000Pico Kit購(gòu)自美國(guó)Agilent公司；Trizol總RNA提取試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan Universal PCR Master Mix、cDNA合成試劑盒購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾Thermo Scientific公司；引物、探針委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。未特別強(qiáng)調(diào)的儀器和試劑均為本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用的儀器和試劑，且易于獲得。

2、實(shí)驗(yàn)樣品

早晨空腹抽取測(cè)試集肺腺癌患者和健康志愿者外周血2mL，放入EDTA管內(nèi)，輕輕混勻，使血與管內(nèi)抗凝物質(zhì)充分接觸，防止血細(xì)胞破裂。將EDTA管放入4℃冰箱，在2小時(shí)內(nèi)分離血漿。首先，820g轉(zhuǎn)速離心10分鐘，將上層液相小心吸出，避免吸取中間白色細(xì)胞層。將上層液相轉(zhuǎn)入事先預(yù)冷的1.5mL離心管，16000g轉(zhuǎn)速繼續(xù)離心10分鐘，以便進(jìn)一步分離血漿和血細(xì)胞。將第二步離心以后得到的血漿，以500μL體積分裝，轉(zhuǎn)入-80℃冰箱長(zhǎng)期保存。

其他材料包括常規(guī)試劑、常規(guī)儀器等均為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知并易于獲取的材料。相關(guān)試劑的配制按照產(chǎn)品說(shuō)明書操作，或者按本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)方法配制即可。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1、血漿總RNA的提取

mirvana^TMparis^TMkit用于抽提血漿總RNA，NanoDrop 1000分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度。對(duì)RNA質(zhì)量的評(píng)價(jià)通過(guò)Agilent RNA 6000Pico Kit由Agilent 2100Bioanalyzer System來(lái)完成。方法均參照各自說(shuō)明書。用RNA完整指數(shù)(RIN)衡量總RNA的質(zhì)量，該值從1到10分別反應(yīng)樣本的質(zhì)量。RIN≥7-10表示質(zhì)量好，RIN≥5表示質(zhì)量中等，RIN＜5表示質(zhì)量差。本實(shí)驗(yàn)中，以RIN＞5作為抽提總RNA合格的標(biāo)準(zhǔn)。

2、全基因組microRNA分析

microRNA芯片檢測(cè)以及結(jié)果分析由上海生物芯片有限公司完成。microRNA芯片包含723個(gè)人microRNAs和76個(gè)人病毒microRNAs探針，microRNA數(shù)據(jù)來(lái)自Sanger v.10.1數(shù)據(jù)庫(kù)。每一張芯片包含八個(gè)上樣位點(diǎn)?？俁NA(100ng)通過(guò)Cy3標(biāo)記，芯片通過(guò)XDR Scan(PMT100，PMT5)掃描芯片上的信號(hào)。標(biāo)記和雜交過(guò)程按照Agilent microRNA芯片系統(tǒng)說(shuō)明書操作。芯片圖像信息通過(guò)軟件轉(zhuǎn)換為強(qiáng)度值，消除背景嘈雜信號(hào)以后，信號(hào)強(qiáng)度值直接輸入到軟件進(jìn)行分析。在對(duì)樣本的檢測(cè)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-1228在血漿中穩(wěn)定表達(dá)，故選用hsa-miR-1228作為內(nèi)參，將雜交得到的原始信號(hào)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，得到以2為底數(shù)的log值。如果一個(gè)樣本在芯片上重復(fù)檢測(cè)的數(shù)值，其變異系數(shù)大于15％或者陽(yáng)性信號(hào)值不到5％，認(rèn)為該樣本質(zhì)量不合格，在下一步試驗(yàn)中將被排除?？梢詸z測(cè)到的microRNA定義為在超過(guò)50％的樣本中，芯片都能檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)。

3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR

具體參照試劑盒TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan MicroRNA Assay、TaqMan Universal PCR Master Mix的說(shuō)明書，每個(gè)樣品上樣量為100ng，反應(yīng)步驟如下：

100ng RNA標(biāo)本加入每個(gè)RT反應(yīng)試管中，Nuclease-free water補(bǔ)足體積；加入各反應(yīng)成分后稍作離心混勻，在PCR反應(yīng)儀執(zhí)行如下程序：

16℃30min→42℃30min→85℃5min→4℃保存。

參照TaqMan MicroRNA Assay說(shuō)明書在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，體系和條件如下：

加入各反應(yīng)成分并充分混勻后稍作離心，每個(gè)孔10μL，每個(gè)樣本做三個(gè)復(fù)孔。在熒光定量PCR儀上執(zhí)行如下程序：

總共40個(gè)循環(huán)。60℃時(shí)進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)采集，吸收波長(zhǎng)為490nm，釋放波長(zhǎng)為530nm。Cp值由SDS軟件經(jīng)過(guò)二次衍生法計(jì)算得到。

4、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

以芯片檢測(cè)結(jié)果中最穩(wěn)定的hsa-miR-1228作為內(nèi)參對(duì)照，利用Agilent Feature Extraction軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)定量分析。芯片的圖像信息通過(guò)Scanner Control Rev.7.0軟件轉(zhuǎn)換為密度值。信號(hào)經(jīng)背景消除后直接導(dǎo)入GeneSpring GX10軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。以重復(fù)試驗(yàn)獲得的平均標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)比較研究分析。Benjamini-Hochberg校對(duì)的非配對(duì)t檢驗(yàn)(p≤0.01)。利用hierarchical clustering algorithm軟件進(jìn)行聚類分析，篩選出男性肺腺癌與男性健康對(duì)照、女性肺腺癌與女性健康對(duì)照中具有顯著性差異的血漿microRNAs。

實(shí)時(shí)熒光PCR數(shù)據(jù)采用與芯片相同的內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化，非配對(duì)t檢驗(yàn)確定組間差異。p＜0.05設(shè)為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。F檢驗(yàn)和T檢驗(yàn)分析通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)得到的microRNAs表達(dá)值之間的顯著性差異，通過(guò)SPSS軟件分析實(shí)現(xiàn)，p＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均為雙側(cè)。

未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如教科書和實(shí)驗(yàn)指南中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件，為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知或易于獲知。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

microRNA芯片檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與男性健康對(duì)照組相比，男性病例組出現(xiàn)大量上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的microRNAs，部分microRNAs差異表達(dá)非常明顯；與女性健康對(duì)照組相比，女性病例組出現(xiàn)大量上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的microRNAs，部分microRNAs差異表達(dá)非常明顯。

由于microRNA芯片對(duì)microRNA表達(dá)特征的研究是間接的，在分析過(guò)程中仍存在特異性和敏感度不高等缺點(diǎn)。因此，所得結(jié)果有一定的假陽(yáng)性，需要輔助其他更為準(zhǔn)確的表達(dá)研究方法加以驗(yàn)證，本實(shí)驗(yàn)利用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR來(lái)進(jìn)行鑒定。

結(jié)果有13個(gè)血漿差異microRNA得到熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR的確認(rèn)，表達(dá)水平如下：

上表中，斜線代表變換變化不明顯。得到上述血漿差異microRNA后，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)評(píng)價(jià)單個(gè)血漿差異microRNA及其聯(lián)合用于診斷區(qū)分男性肺腺癌與男性健康對(duì)照、女性肺腺癌與女性健康對(duì)照的診斷效能。其中，由于miR-205、miR-206和miR-155-5p的p值大于0.05，不列入下一步實(shí)驗(yàn)考察。

實(shí)施例2：ROC曲線評(píng)價(jià)血漿差異microRNA的診斷效能

ROC曲線評(píng)價(jià)法的原理：

診斷試驗(yàn)的基本評(píng)價(jià)指標(biāo)有敏感度、特異性等，綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)有Youden指數(shù)、ROC、AUC等。對(duì)于診斷試驗(yàn)的評(píng)價(jià)，首先應(yīng)該知道受試者的真實(shí)類別，即哪些屬于健康組，哪些屬于疾病組。劃分健康組和疾病組的標(biāo)準(zhǔn)就是金標(biāo)準(zhǔn)(如本申請(qǐng)中公認(rèn)的組織病理診斷法)。對(duì)于按金標(biāo)準(zhǔn)確定的疾病組和健康組，采用診斷試驗(yàn)檢測(cè)的結(jié)果可以分為如下情況：

陽(yáng)性(True Positive,TP)；診斷試驗(yàn)檢測(cè)為陽(yáng)性(與金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果一致)；

陰性(True Negative,TN)；診斷試驗(yàn)檢測(cè)為陰性(與金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果一致)；

假陽(yáng)性(False Positive,FP)：診斷試驗(yàn)檢測(cè)為陽(yáng)性(與金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果不一致)；

假陰性(False Negative,FN)：診斷試驗(yàn)檢測(cè)為陰性(與金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果不一致)。

可以用下表表示：

診斷試驗(yàn)的敏感度＝A/(A+C)；診斷試驗(yàn)的特異性＝D/(B+D)。通過(guò)敏感度和特異性可以得出診斷試驗(yàn)相對(duì)于金標(biāo)準(zhǔn)的診斷靈敏程度和特異程度。敏感度高代表將疾病例診斷為陰性的個(gè)數(shù)少，漏診率低；特異性高代表將健康例診斷為陽(yáng)性的個(gè)數(shù)少，誤診率低。

ROC曲線正是基于上述敏感度和特異性繪制出的曲線。以診斷試驗(yàn)中可能的診斷界值作為診斷點(diǎn)，根據(jù)上述表格計(jì)算出相應(yīng)的敏感度和特異性。然后，以敏感度為縱坐標(biāo)，1-特異性為橫坐標(biāo)，將各診斷點(diǎn)時(shí)各點(diǎn)的敏感度和特異性點(diǎn)在坐標(biāo)圖中標(biāo)出，連接坐標(biāo)點(diǎn)得到平滑曲線，該曲線即為ROC曲線。診斷點(diǎn)設(shè)置的越多越密，得到的ROC曲線就越平滑。

ROC曲線是以每一個(gè)檢測(cè)結(jié)果作為可能的診斷界值，其曲線下面積AUC的大小表明了診斷試驗(yàn)準(zhǔn)確度的大小。ROC曲線下面積AUC(ROCAUC)作為診斷試驗(yàn)真實(shí)性評(píng)價(jià)的固有準(zhǔn)確度指標(biāo)已被普遍認(rèn)可，完全無(wú)價(jià)值的診斷試驗(yàn)AUC為0.5，理想的診斷試驗(yàn)AUC為1，而一般認(rèn)為對(duì)于一個(gè)診斷試驗(yàn)，ROC AUC在0.5～0.7之間時(shí)診斷價(jià)值較低，在0.7～0.9之間時(shí)診斷價(jià)值中等，在0.9以上時(shí)診斷價(jià)值較高。

1、單個(gè)血漿差異microRNA用于診斷區(qū)分疾病組和對(duì)照組時(shí)，ROC曲線的繪制方法

將測(cè)試集所有樣本中上述13個(gè)血漿差異microRNA的含量經(jīng)內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化后，得到標(biāo)準(zhǔn)化值，以各可能的標(biāo)準(zhǔn)化值作為診斷點(diǎn)，按照上述方法繪制ROC曲線。

13個(gè)血漿差異microRNA單獨(dú)診斷區(qū)分男性病例組VS.男性健康對(duì)照組、女性病例組VS.女性健康對(duì)照組的ROC曲線下面積AUC及最佳cut-off值處敏感度和特異性如下表所示：

上述結(jié)果表明，通過(guò)microRNA芯片并經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR確證的10個(gè)血漿差異microRNAs單獨(dú)用于診斷區(qū)分男性肺腺癌和男性健康對(duì)照或女性肺腺癌和女性健康對(duì)照的診斷效能較低，AUC在0.5～0.7之間，診斷價(jià)值較低。

2、多個(gè)血漿差異microRNAs聯(lián)合用于診斷區(qū)分疾病組和對(duì)照組時(shí)ROC曲線繪制方法

將測(cè)試集所有樣本中上述7個(gè)(男性和女性各有7個(gè))血漿差異microRNA的含量經(jīng)內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化后，得到標(biāo)準(zhǔn)化值，將男性肺腺癌樣本作為組別1，男性健康志愿者樣本作為組別2(或女性肺腺癌樣本作為組別1，女性健康志愿者樣本作為組別2)，對(duì)上述7個(gè)血漿差異microRNAs中任意多個(gè)血漿差異microRNAs在兩組樣本中的標(biāo)準(zhǔn)化值進(jìn)行二元邏輯回歸，得到二元邏輯回歸方程。然后，將各樣本中該任意多個(gè)血漿差異microRNAs的標(biāo)準(zhǔn)化值代入該二元邏輯回歸方程，即可得到各個(gè)樣本的回歸值，以可能的回歸值作為診斷點(diǎn)，按照上述方法繪制ROC曲線。該ROC曲線即為該任意多個(gè)血漿差異microRNAs聯(lián)合診斷時(shí)的診斷曲線，曲線下面積AUC及最佳cut-off值處敏感度和特異性可體現(xiàn)該任意多個(gè)血漿差異microRNAs的聯(lián)合診斷效能。

結(jié)果表明：miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-564、miR-615-5p、miR-601這5個(gè)血漿差異microRNAs聯(lián)合用于診斷區(qū)分男性病例組VS.男性健康對(duì)照組時(shí)的診斷效能最高，且最佳cut-off值處敏感度和特異性高；miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-648、miR-523-5p、miR-758-5p這5個(gè)血漿差異microRNAs聯(lián)合用于診斷區(qū)分女性病例組VS.女性健康對(duì)照組時(shí)的診斷效能最高，且最佳cut-off值處敏感度和特異性高。結(jié)果如下表和圖1和圖2：

申請(qǐng)人進(jìn)一步評(píng)價(jià)了診斷區(qū)分男性病例組和男性健康對(duì)照組的5個(gè)聯(lián)合差異microRNAs對(duì)女性病例組和女性健康對(duì)照組的診斷效能，ROC曲線下面積AUC僅為0.586；申請(qǐng)人還進(jìn)一步評(píng)價(jià)了診斷區(qū)分女性病例組和女性健康對(duì)照組的5個(gè)聯(lián)合差異microRNAs對(duì)男性病例組和男性健康對(duì)照組的診斷效能，ROC曲線下面積AUC僅為0.614。該結(jié)果也進(jìn)一步證明，肺腺癌具有明顯的性別差異，這可能與不同性別肺腺癌的發(fā)病機(jī)理不同有關(guān)，體內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)也存在明顯差異，在進(jìn)行診斷時(shí)應(yīng)該區(qū)別對(duì)待，不同性別采用不同診斷指標(biāo)才能獲得高準(zhǔn)確率。

實(shí)施例3：在驗(yàn)證集中進(jìn)一步驗(yàn)證血漿差異microRNAs聯(lián)合診斷的準(zhǔn)確性

一、實(shí)驗(yàn)材料

同實(shí)施例1。

二、實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

1、血漿總RNA的提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法同實(shí)施例1。

2、在驗(yàn)證集中，基于上述二元邏輯回歸方程將驗(yàn)證集男性肺腺癌和男性健康志愿者樣本中的5個(gè)血漿差異microRNAs(miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-564、miR-615-5p、miR-601)含量的標(biāo)準(zhǔn)化值作二元邏輯回歸變換，計(jì)算出男性樣本中的該5個(gè)血漿差異microRNAs含量的邏輯回歸值。低于最佳cut-off值0.568的預(yù)測(cè)為男性健康志愿者，高于最佳cut-off值0.568的預(yù)測(cè)為男性肺腺癌，最后計(jì)算出以該5個(gè)代謝標(biāo)志物水平預(yù)測(cè)男性肺腺癌和男性健康志愿者分組的準(zhǔn)確率。結(jié)果如圖3，基于5個(gè)血漿差異microRNAs(miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-564、miR-615-5p、miR-601)驗(yàn)證集樣本中的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為98.7％，僅將1例男性健康志愿者誤診為肺腺癌患者，準(zhǔn)確率非常高。

3、在驗(yàn)證集中，基于上述二元邏輯回歸方程將驗(yàn)證集女性肺腺癌和女性健康志愿者樣本中的5個(gè)血漿差異microRNAs(miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-648、miR-523-5p、miR-758-5p)含量的標(biāo)準(zhǔn)化值作二元邏輯回歸變換，計(jì)算出女性樣本中的該5個(gè)血漿差異microRNAs含量的邏輯回歸值。低于最佳cut-off值0.604的預(yù)測(cè)為女性健康志愿者，高于最佳cut-off值0.604的預(yù)測(cè)為女性肺腺癌，最后計(jì)算出以該5個(gè)代謝標(biāo)志物水平預(yù)測(cè)女性肺腺癌和女性健康志愿者分組的準(zhǔn)確率。結(jié)果如圖4，基于5個(gè)血漿差異microRNAs(miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-648、miR-523-5p、miR-758-5p)驗(yàn)證集樣本中的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為98.5％，僅將1例女性健康志愿者誤診為肺腺癌患者，準(zhǔn)確率非常高。

實(shí)施例4：診斷試劑和診斷試劑盒的制備

上述實(shí)施例表明，miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-564、miR-615-5p、miR-601聯(lián)合診斷區(qū)分男性肺腺癌和男性健康志愿者的準(zhǔn)確度高，敏感度和特異性強(qiáng)，可基于miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-564、miR-615-5p、miR-601制作用于篩查診斷男性群體中肺腺癌患者的診斷試劑或診斷試劑盒。該診斷試劑或診斷試劑盒中包括miR-224-3p引物、探針；miR-146a-5p引物、探針；miR-564引物、探針；miR-615-5p引物、探針；miR-601引物、探針。引物具體包括反轉(zhuǎn)錄引物、定量PCR前引物和定量PCR后引物。當(dāng)然，診斷試劑盒還含有PCR反應(yīng)常用的酶和試劑，如逆轉(zhuǎn)錄酶、緩沖液、dNTPs、MgCl₂、DEPC水和Taq酶等，以及標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰Ｒ锖吞结樀脑O(shè)計(jì)是本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段，下表為引物和探針的一種設(shè)計(jì)，也可以設(shè)計(jì)成其他序列。

上述實(shí)施例表明，miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-648、miR-523-5p、miR-758-5p聯(lián)合診斷區(qū)分女性肺腺癌和女性健康志愿者的準(zhǔn)確度高，敏感度和特異性強(qiáng)，可基于miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-648、miR-523-5p、miR-758-5p制作用于篩查診斷女性群體中肺腺癌患者的診斷試劑或診斷試劑盒。該診斷試劑或診斷試劑盒中包括miR-224-3p引物、探針；miR-146a-5p引物、探針；miR-648引物、探針；miR-523-5p引物、探針；miR-758-5p引物、探針。引物具體包括反轉(zhuǎn)錄引物、定量PCR前引物和定量PCR后引物。當(dāng)然，診斷試劑盒還含有PCR反應(yīng)常用的酶和試劑，如逆轉(zhuǎn)錄酶、緩沖液、dNTPs、MgCl₂、DEPC水和Taq酶等，以及標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌?。引物和探針的設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段，下表為引物和探針的一種設(shè)計(jì)，也可以設(shè)計(jì)成其他序列。

本發(fā)明提供的一組血漿microRNAs標(biāo)記物可以準(zhǔn)確用于篩查診斷男性群體中肺腺癌患者，靈敏度高，特異性強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)男性群體中肺腺癌患者的無(wú)介入診斷；本發(fā)明提供的另一組血漿microRNAs標(biāo)記物可以準(zhǔn)確用于篩查診斷女性群體中肺腺癌患者，靈敏度高，特異性強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)女性群體中肺腺癌患者的無(wú)介入診斷。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京九壽堂醫(yī)藥科技有限公司

<120> 血漿microRNAs用于制備篩查診斷男性群體中肺腺癌患者的診斷試劑的用途

<130> 1

<160> 26

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

aaaauggugc ccuagugacu aca 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

ugagaacuga auuccauggg uu 22

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

aggcacggug ucagcaggc 19

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

gggggucccc ggugcucgga uc 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人

<400> 5

uggucuagga uuguuggagg ag 22

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 智人

<400> 6

aagugugcag ggcacuggu 19

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人

<400> 7

cucuagaggg aagcgcuuuc ug 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人

<400> 8

gaugguugac cagagagcac ac 22

<210> 9

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgactg tagtca 56

<210> 10

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacaa cccatg 56

<210> 11

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacgc ctgctg 56

<210> 12

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacga tccgag 56

<210> 13

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacct cctcca 56

<210> 14

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacac cagtgc 56

<210> 15

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacca gaaagc 56

<210> 16

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacgt gtgctc 56

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

acactccagc tgggaaaatg gtgccctagt g 31

<210> 18

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

acactccagc tgggtgagaa ctgaattcca t 31

<210> 19

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

acactccagc tgggaggcac ggtgtcagca g 31

<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

acactccagc tggggggggt ccccggtgct c 31

<210> 21

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

acactccagc tgggtggtct aggattgttg g 31

<210> 22

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

acactccagc tgggaagtgt gcagggcact g 31

<210> 23

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

acactccagc tgggctctag agggaagcgc t 31

<210> 24

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

acactccagc tggggatggt tgaccagaga g 31

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

cgccgcagtg cgtgtcgtgg agt 23

<210> 26

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cgtatcca 8