本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及基于磁性納米粒子的革蘭氏陰性病原菌分離方法。
背景技術(shù)：
敗血癥是嚴(yán)重的全身性感染疾病,病情復(fù)雜多變,病死率高。敗血癥患者血液中的病原菌主要包括革蘭氏陰性病原菌和革蘭氏陰病原菌。在治療過程中，革蘭氏陰性病原菌和革蘭氏陰性病原菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)差別較大，選用藥物也有一定差別。傳統(tǒng)的鑒別敗血癥患者血液中病原菌種類的方法主要是血平板培養(yǎng)法，但該方法周期長，大概需要5-7天，在這一過程中很可能會(huì)使病人的病情進(jìn)一步加重。另外，如若不對血液中病原菌進(jìn)行分類，就只能使用廣譜的抗菌素。近年來，隨著人類廣譜和超廣譜抗生素的大量生產(chǎn)和應(yīng)用，導(dǎo)致多重耐藥菌、條件病原菌引起的各類感染增加，抗生素的選擇范圍縮小。目前全球細(xì)菌耐藥形勢空前嚴(yán)峻，細(xì)菌耐藥已被列為威脅人類健康的三大難題之一。同時(shí)，廣譜和超廣譜抗菌素還會(huì)對腸道中的益生菌產(chǎn)生抑制作用，從而對健康產(chǎn)生一定的危害。因此，為了提高對敗血癥患者的治療效果,在治療前對患者血液中的病原菌種類進(jìn)行鑒別，能夠指導(dǎo)臨床更加科學(xué)合理使用抗菌藥物。因此，建立一種高效、快速檢測革蘭氏陰性病原菌的新方法顯得尤為迫切。鑒于需要建立一種高效，快速的檢測方法，基于功能化的磁性納米粒子的分離技術(shù)在病原菌監(jiān)測中得到了迅速發(fā)展。
臨床上應(yīng)用的傳統(tǒng)鑒別革蘭氏陰性病原菌和革蘭氏陰性病原菌的方法，主要是血平板培養(yǎng)法。該方法不但周期長，而且耗費(fèi)大量的人力物力。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種低梯度磁場下，簡便、快捷，高效的磁富集分離患者血液中的革蘭氏陰性病原菌的方法。
革蘭氏陰性病原菌的快速分離方法，包括以下步驟：(1)吸取2ml的磁性納米粒子(10mg/ml)，加入到8mlph＝7.4的無菌的pbs溶液中，然后在外加磁場的作用下，對磁性納米粒子進(jìn)行洗滌，重復(fù)3次，將洗滌后的磁性納米粒子重懸于10ml無菌的pbs溶液中；(2)5.8mgedc，溶于290μl無菌的pbs中，6.5mgnhss，溶于325μl無菌的pbs中，然后將溶解后的edc和nhss加入到洗滌過的磁性納米粒子溶液中，活化1h；(3)將活化后磁性納米粒子用無菌的pbs洗滌3次，重懸于8ml無菌的pbs溶液中；(4)稱取鏈霉親和素0.5mg，溶解到100μl滅菌的pbs溶液中，然后加入到活化后的磁珠溶液中，反應(yīng)2h，然后用滅菌的pbs洗滌3次，重懸于8ml滅菌的pbs溶液中得到鏈霉親和素修飾的磁珠；(5)稱取10mg刀豆蛋白a，溶于400μl滅菌的pbs溶液中，1mg長鏈生物素，溶于100μl滅菌的pbs溶液中，然后將溶解后的長鏈生物素加入到溶解的刀豆蛋白a中，孵育2h，用30kda的超濾管在8℃、3000rpm條件下冷凍離心，用10個(gè)體積滅菌的pbs不斷清洗，得到生物素化的刀豆蛋白a；(6)將生物素化的刀豆蛋白a加入到鏈霉親和素修飾的磁珠中，孵育45min；(7)反應(yīng)完畢后，用無菌的pbs洗滌3次，重懸于10ml無菌的pbs溶液中，得到終濃度為2mg/ml的刀豆蛋白a-磁性納米粒子復(fù)合物，用于富集革蘭氏陰性病原菌。(8)取10ml待測樣品溶液，加入1mg刀豆蛋白a-磁性納米粒子復(fù)合物，置于培養(yǎng)箱上，以200rpm的轉(zhuǎn)速37℃孵育45min；插入磁力架分離6min；(9)磁分離后，無菌pbs溶液清洗后，用無菌的pbs緩沖液重懸即得富集有革蘭氏陰性病原菌-刀豆蛋白a-磁性納米粒子復(fù)合物。
所述半刀豆球蛋白，其分子量為102000da。
所述納米磁性納米粒子粒徑為180nm，表面羧基。
刀豆蛋白a通過氨基與長鏈生物素的活潑酯反應(yīng)脫去n-羥基琥珀酰亞胺，使二者相連，然后長鏈生物素的另一端生物素與磁珠表面的鏈霉親和素相連，刀豆蛋白a與革蘭氏陰性病原菌表面甘露型的糖結(jié)合時(shí)，通過天冬氨酸的兩個(gè)氧原子作為受體與糖的6-oh和4-oh形成氫鍵、天冬酰胺的氮原子作為供體與糖的3-oh形成氧鍵、甘氨酸的主鏈和單糖的3-oh形成氫鍵。
具體原理見圖1。
本方法適用于富集分離復(fù)雜復(fù)雜基質(zhì)中分離革蘭氏陰性病原菌，如裂解血，血清，以及全血樣品。
采用本發(fā)明技術(shù)方案具有如下有益效果：
1、本發(fā)明采用的是180nm的磁性納米粒子，主要用于血液中目標(biāo)菌的快速富集，而采用30nm或者50nm納米磁珠結(jié)合樹狀分子的富集方法是用于磁信號的放大。
2、本發(fā)明采用的刀豆蛋白a是傳統(tǒng)的商業(yè)藥物，相比于抗體，具有穩(wěn)定好，成本低，質(zhì)量可控等優(yōu)點(diǎn)?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn)，在單次分離過程中，本發(fā)明構(gòu)建的分離刀豆蛋白a-磁性納米粒子復(fù)合物在成本上比免疫磁分離陳本降低了151倍；在材料保存方面比免疫磁珠保質(zhì)期也更長。
3、在敗血癥患者血液中，是多種致病菌共存的環(huán)境。本發(fā)明采用的刀豆蛋白a是廣譜的識別革蘭氏陰性菌的分子識別劑，用于分離基質(zhì)中的革蘭氏陰性菌是一種通用的分離策略，可以將基質(zhì)中的大多數(shù)革蘭氏陰性菌都分離出來，然后通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)或者選擇性培養(yǎng)進(jìn)行鑒別。相比之下，抗體因其只能專一的識別，從而分離出對應(yīng)的目標(biāo)菌，其他存在于血液中的致病菌無法鑒別。
4、本發(fā)明借助了鏈霉親和素和長鏈生物素作為介導(dǎo)，具有很好的靈活性，有利于刀豆蛋白a分子與革蘭氏陰性病原菌表面的甘露糖復(fù)合物分子相連。相比于直接偶聯(lián)的方法，該方法分離革蘭氏陰性病原菌能力更強(qiáng)，特別適用于分離全血樣本中革蘭氏陰性病原菌的分離。
5、本方案為將鏈霉親和素先偶聯(lián)在磁性納米粒子表面，然后再將生物素化的刀豆蛋白a分子偶聯(lián)于鏈霉親和素包被的磁性納米粒子上，避免了常規(guī)方法中將刀豆蛋白a分子偶聯(lián)于磁珠表面或者直接將刀豆蛋白a分子直接接在磁性納米粒子表面，導(dǎo)致刀豆蛋白a分子活性降低和空間位阻大的缺點(diǎn)。
6、本發(fā)明在分離過程中，引入了鏈霉親和素和長鏈生物素作為介導(dǎo)，增加了刀豆蛋白a分子與磁性納米粒子接觸的機(jī)會(huì)，使得磁性納米粒子表面可以偶聯(lián)更多的刀豆蛋白a分子，從而大大增加了革蘭氏陰性病原菌表面結(jié)合的磁性納米粒子的數(shù)量，實(shí)現(xiàn)了在低磁場下快速分離所捕獲的革蘭氏陰性病原菌。與傳統(tǒng)的磁分離方法相比，該方法更適用于復(fù)雜基質(zhì)革蘭氏陰性病原菌的分離，提高了復(fù)雜基質(zhì)樣品中革蘭氏陰性病原菌分離效率。
7、磁性納米粒子偶聯(lián)刀豆蛋白a時(shí)，一般采用疏水吸附或化學(xué)偶聯(lián)方式將具有活性的刀豆蛋白a聯(lián)接在磁性納米粒子表面。刀豆蛋白a與磁性納米粒子表面距離太近，磁性納米粒子本身性質(zhì)及其表面殘留的疏水或強(qiáng)親水基團(tuán)容易引起刀豆蛋白a空間構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致刀豆蛋白a生物活性下降。然而本實(shí)驗(yàn)方案在偶聯(lián)過程中引入鏈霉親和素和長鏈生物素作為介導(dǎo)，其具有一定的空間長度，從而使刀豆蛋白a分子遠(yuǎn)離磁性納米粒子和磁性納米粒子表面，避免了磁性納米粒子本身性質(zhì)及表面對刀豆蛋白a分子的影響。同時(shí)，引入聚乙二醇卻不會(huì)影響刀豆蛋白a分子的空間構(gòu)象，從而起到了保護(hù)刀豆蛋白a分子生物活性的作用。
附圖說明
圖1本發(fā)明所涉及的磁分離技術(shù)的操作流程圖；
具體實(shí)施方式
為了使本發(fā)明更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
磁性納米粒子(180nm)購買于美國上海奧潤有限公司。
長鏈生物素(sulfo-nhs-lc-biotin)，購買于賽默飛世爾科技公司。
刀豆蛋白a分子購買于上海源葉生物科技有限公司。
n-羥基丁二酰亞胺nhss,乙基3-(3-二甲氨基)碳二亞胺鹽酸鹽edc等均為常規(guī)試劑，不再贅述。
0.01mpbs配制方法：8.0gnacl、0.2gkcl、0.24gkh2po4、1.44gna2hpo4溶解于800ml蒸餾水中，用5mnaoh調(diào)整ph至7.4，再定容至1000ml即得0.01mpbs。
實(shí)施例1
1.刀豆蛋白a-磁性納米粒子復(fù)合物合成，按照如下步驟制備:
(1)吸取2ml的磁性納米粒子(10mg/ml)，加入到8mlph＝7.4的無菌的pbs溶液中，然后在外加磁場的作用下，對磁性納米粒子進(jìn)行洗滌，重復(fù)3次，將洗滌后的磁性納米粒子重懸于10ml無菌的pbs溶液中；(2)5.8mgedc，溶于290μl無菌的pbs中，6.5mgnhss，溶于325μl無菌的pbs中，然后將溶解后的edc和nhss加入到洗滌過的磁性納米粒子溶液中，活化1h；(3)將活化后磁性納米粒子用無菌的pbs洗滌3次，重懸于8ml無菌的pbs溶液中；(4)稱取鏈酶親和素0.5mg，溶解到100μl滅菌的pbs溶液中，然后加入到活化后的磁珠溶液中，反應(yīng)2h，然后用滅菌的pbs洗滌3次，重懸于8ml滅菌的pbs溶液中，加入0.3％bsa封閉45min，然后用滅菌的pbs洗滌3次，重懸于8ml滅菌的pbs溶液中，得到鏈酶親和素修飾的磁珠；(5)稱取10mg刀豆蛋白a，溶于400μl滅菌的pbs溶液中，1mg長鏈生物素，溶于100μl滅菌的pbs溶液中，然后將溶解后的長鏈生物素加入到溶解的刀豆蛋白a中，孵育2h，用30kda的超濾管在8℃、3000rpm條件下冷凍離心，用10個(gè)體積滅菌的pbs不斷清洗，得到生物素化的刀豆蛋白a；(6)將生物素化的刀豆蛋白a加入到鏈酶親和素修飾的磁珠中，孵育45min；(7)反應(yīng)完畢后，用無菌的pbs洗滌3次，重懸于10ml無菌的pbs溶液中，得到終濃度為2mg/ml的刀豆蛋白a-磁性納米粒子復(fù)合物，用于富集革蘭氏陰性病原菌。
2.富集捕獲：取待測樣品溶液10ml，加入1mg刀豆蛋白a-磁性納米粒子復(fù)合物，置于混勻儀上，以200rpm的轉(zhuǎn)速室溫孵育45min形成革蘭氏陰性病原菌-刀豆蛋白a-磁性納米粒子復(fù)合物；將離心管插入常規(guī)磁力架分離6min；
3.去離子水輕輕清洗后，用pbs緩沖液重懸即得革蘭氏陰性病原菌-刀豆蛋白a-磁性納米粒子復(fù)合物。
實(shí)施例2富集效果實(shí)驗(yàn)
(1)取1ml濃度為105cfu/ml的革蘭氏陰性病原菌于1.5ml無菌離心管中，12000rpm離心5min，棄上清，用等體積無菌pbs溶液重懸。
(2)富集捕獲：取待測樣品溶液10ml，加入1mg刀豆蛋白a-磁性納米粒子復(fù)合物，置于混勻儀上，以200rpm的轉(zhuǎn)速室溫孵育45min形成革蘭氏陰性病原菌-刀豆蛋白a-磁性納米粒子復(fù)合物；將離心管插入常規(guī)磁力架分離6min；
(3)磁分離后，將上清液轉(zhuǎn)入無菌離心管中，而分離得到的革蘭氏陰性病原菌-刀豆蛋白a-磁性納米粒子復(fù)合物則用pbs清洗兩次，混合均勻，并用1ml無菌pbs溶液重懸革蘭氏陰性病原菌-刀豆蛋白a-磁性納米粒子復(fù)合物。
(4)捕獲率計(jì)算：將各組富集的革蘭氏陰性病原菌重懸液進(jìn)行梯度稀釋后，用平板對每個(gè)梯度計(jì)數(shù)，通過捕獲效率公式計(jì)算革蘭氏陰性病原菌的捕獲效率，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。各組捕獲效率的計(jì)算公式如下：[被富集吸附的菌落總數(shù)/(上清液中菌落總數(shù)+被富集吸附的菌落總數(shù))]×100％。
捕獲率如下：
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，刀豆蛋白a-磁性納米粒子復(fù)合物的捕獲革蘭氏陰性病原菌效率達(dá)到90.2％，這說明刀豆蛋白a分子可以很好的與革蘭氏陰性病原菌在短時(shí)間內(nèi)就能分離富集較多的革蘭氏陰性病原菌。
實(shí)施例3
待測樣品為無菌裂解血，加入革蘭氏陰性病原菌調(diào)節(jié)菌落濃度至105cfu/ml備用。
將制備好刀豆蛋白a-磁性納米粒子復(fù)合物(1mg)分別加入到樣品溶液(10ml)中，置于混勻儀上，以200rpm的轉(zhuǎn)速室溫孵育45min。然后常規(guī)磁力架分離6min。磁分離后，將上清液轉(zhuǎn)入無菌離心管中，而分離得到的革蘭氏陰性病原菌-刀豆蛋白a-磁性納米粒子復(fù)合物則用無菌pbs清洗兩次，混合均勻，并用1ml無菌pbs溶液重懸革蘭氏陰性病原菌-刀豆蛋白a-磁性納米粒子復(fù)合物。捕獲效率如實(shí)施例2方法獲得，其余同實(shí)施例2。結(jié)果見表1，表明本方案能高效富集分離樣品中的革蘭氏陰性病原菌。
實(shí)施例4
待測樣品為無菌血清，加入革蘭氏陰性病原菌調(diào)節(jié)菌落濃度至105cfu/ml。其余同實(shí)施例3。
實(shí)施例5
待測樣品為無菌全血，加入革蘭氏陰性病原菌調(diào)節(jié)菌落濃度至105cfu/ml。其余同實(shí)施例3。
表1不同實(shí)際樣品中革蘭氏陰性病原菌分離效果的比較
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。