本發(fā)明涉及一種維生素b12衍生物，特別是涉及一種新型的熒光標記的維生素b12衍生物，簡稱為vb12-fitc，以及該衍生物的合成方法以及應用。

背景技術(shù)：

維生素b12，又稱甲鈷胺，是一種人體必需的水溶性維生素，無法在體內(nèi)自身合成，僅能通過食物攝入,并儲存于肝臟中。在人體缺乏持續(xù)補充外源性維生素b12的情況下，肝臟中儲存的維生素b12總量在3-6個月內(nèi)即被消耗殆盡。在人體細胞代謝的甲基化、維護神經(jīng)髓鞘的代謝與功能、促進紅細胞的發(fā)育與成熟、參與脫氧核酸(dna)的合成、脂肪及碳水化合物的代謝、核酸與蛋白質(zhì)的合成等多個重要環(huán)節(jié)，均離不開維生素b12的參與。隨著維生素b12的缺乏，最終導致惡性貧血、不可逆性神經(jīng)病變等并發(fā)癥。

維生素作為參與一碳基團代謝的輔酶，與核酸和蛋白質(zhì)的合成密切相關(guān)。細胞的增殖和發(fā)育過程中，核酸和蛋白質(zhì)的合成顯著加快，因而在快速增殖組織——腫瘤病灶中，針對維生素b12受體數(shù)目顯著上調(diào)，表現(xiàn)出對維生素攝取的顯著增加，因而腫瘤對vb12有高攝取現(xiàn)象。這一特性使維生素b12本身具有一定的腫瘤靶向性，在腫瘤吸收代謝途徑、腫瘤顯像治療等方面的研究，維生素b12一定意義。

維生素b12的正常吸收代謝、腫瘤代謝特點日益得到關(guān)注，其吸收代謝途徑、及該途徑下新型靶向給藥，是近年關(guān)注研究熱點，所以維生素b12的顯像、可視化顯得尤為重要。目前vb12的顯像標記，主要通過放射性核素co+、111in、10b、99mtc或正電子cu+標記等途徑來實現(xiàn)，該類方法需要特殊顯像設備、成本高、操作難度大，另外放射性核素、正電子對人體均有放射性的損害。熒光顯像是目前相對安全、成本低廉、無需借助超大型儀器、操作簡便的顯像方法，在維生素b12吸收研究中若能通過熒光標識，可極大降低操作的難度及成本。

然而，維生素b12結(jié)構(gòu)上可反應基團少，難以直接與熒光劑直接反應結(jié)合，必須先在本結(jié)構(gòu)上增加一個“橋梁”，可同時與vb12、熒光劑結(jié)合，進而完成維生素b12的熒光標記。但維生素b12本身結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，見光、遇熱易分解，在劇烈反應條件下則有降解的可能，因此維生素b12熒光標記有很大難度。本發(fā)明通過偶聯(lián)二氨基化合物，將維生素b12結(jié)構(gòu)上的-oh轉(zhuǎn)化成反應活性更高的氨基，在室溫下再與fitc的異硫氰酸根反應，從而實現(xiàn)在溫和條件下制備fitc熒光標記vb12。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的在于提供一種fitc標記的維生素b12衍生物，所構(gòu)建的熒光標記的vb12在維持vb12原有結(jié)構(gòu)的前提下，常溫下活化其低反應活性基團，從而解決了目前核素、正電子標記的維生素b12顯像存在成本高、操作難度大等難題。

本發(fā)明所述的fitc標記的維生素b12衍生物(vb12-fitc)，具有如下的分子結(jié)構(gòu)式：

本發(fā)明的第二個目的是提供所述的fitc標記的維生素b12衍生物的制備方法。

本發(fā)明所述的vb12-fitc的制備方法包括：在vb12結(jié)構(gòu)的低反應活性-oh基團上，偶聯(lián)雙氨基，進而與fitc的異硫氰酸根反應，合成vb12-fitc衍生物。

在一個優(yōu)選實施例中，本發(fā)明所述的vb12-fitc的制備方法包括以下步驟：

(a)維生素b12的氨基化：在惰性氣體氣保護下，將維生素b12溶解于經(jīng)除水處理的二甲基亞砜(dmso)中，按照1:1-1:2比例加入活化劑n,n'-羰基二咪唑(cdi)，20-25℃下避光活化6-12小時，按照1:2-1:5比例加入二氨基化合物，繼續(xù)在20-25℃下反應3-12小時；沉淀并分離反應產(chǎn)物，20-25℃下干燥得到氨基化的維生素b12；

(b)fitc與氨基化維生素b12的偶聯(lián)：將步驟a中反應得到的氨基化維生素b12溶解于經(jīng)除水處理的二甲基亞砜(dmso)，按照1:1-1:2比例加入催化劑三乙胺，按照1:1.5比例加入異硫氰酸熒光素(fitc)，20-25℃下避光反應4-12小時，沉淀并分離反應產(chǎn)物，20-25℃下干燥得到fitc標記的維生素b12。

根據(jù)本發(fā)明所述的vb12-fitc的制備方法的進一步特征，所述步驟a中選用的二氨基化合物為1,8-二氨基-3,6-二氧雜辛烷。

根據(jù)本發(fā)明所述的vb12-fitc的制備方法的進一步特征，所述步驟a和b中，在沉淀時加入丙酮作為沉淀劑。

根據(jù)本發(fā)明所述的vb12-fitc的制備方法的進一步特征，所述步驟a和b中，在分離反應產(chǎn)物時，采用離心機在10000r/min條件下離心10min，除去未反應的化合物。

根據(jù)本發(fā)明所述的vb12-fitc的制備方法的進一步特征，所述步驟a和b中，所述干燥是真空干燥。

本發(fā)明第三個目的在于提供所述的vb12-fitc的應用，也就是所述的vb12-fitc在制備診斷和監(jiān)測vb12吸收代謝途徑以及腫瘤中的顯像治療劑中的應用。

基于本發(fā)明所述的vb12-fitc所制備的顯像治療劑在評估vb12-fitc衍生物在診斷和監(jiān)測vb12吸收代謝新途徑以及腫瘤中具有良好的應用前景。

本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明所提供的fitc標記的維生素b12的制備條件溫和(可在常溫下進行)，原料低毒，操作方法簡便，合成效率高，反應產(chǎn)物性質(zhì)穩(wěn)定，具有良好的熒光顯像效果；

(2)本發(fā)明所提供的fitc標記的維生素b12具有腫瘤攝取靶向性，在vb12吸收代謝途徑、腫瘤顯像治療等方面的研究具有良好的應用前景。

附圖說明

圖1是本發(fā)明所述的fitc標記維生素b12的¹hmr質(zhì)譜圖。

圖2是本發(fā)明所述的fitc標記維生素b12的hplc圖。

圖3是本發(fā)明所述的fitc標記維生素b12的流式分析結(jié)果圖。

圖4是本發(fā)明所述的fitc標記維生素b12的共聚焦顯微鏡結(jié)果圖。

圖5是本發(fā)明所述的fitc標記維生素b12的在體成像圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例1：本發(fā)明所述的vb12-fitc的制備

(a)氮氣保護下將200mg的維生素b12溶解于4ml經(jīng)除水處理的二甲基亞砜(dmso)，加入200mg的活化劑n,n'-羰基二咪唑(cdi)，20℃下避光活化12小時，加入400mg二1,8-氨基-3,6-二氧雜辛烷，繼續(xù)在20℃下反應6小時。用500ml丙酮沉淀反應產(chǎn)物，并在10000r/min條件下離心10min分離反應產(chǎn)物，20℃下真空干燥得到氨基化的維生素b12。

(b)將步驟a得到的氨基化維生素b12，稱取150ng溶解于4ml經(jīng)除水處理的二甲基亞砜(dmso)，加入0.1ml的催化劑三乙胺，按照1：1比例加入fitc，20℃下避光反應6小時，沉淀并分離反應產(chǎn)物，20℃下真空干燥得到fitc標記的維生素b12。

實施例2：本發(fā)明所述的vb12-fitc的制備

(a)氮氣保護下將200mg的維生素b12溶解于4ml經(jīng)除水處理的二甲基亞砜(dmso)，加入300mg的活化劑n,n'-羰基二咪唑(cdi)，22℃下避光活化12小時，加入600mg的1,8-二氨基-3,6-二氧雜辛烷，繼續(xù)在22℃下反應6小時。用500ml丙酮沉淀反應產(chǎn)物，并在10000r/min條件下離心10min分離反應產(chǎn)物，22℃下真空干燥得到氨基化的維生素b12。

(b)將步驟a得到的氨基化維生素b12，稱取150ng溶解于4ml經(jīng)除水處理的二甲基亞砜(dmso)，加入0.1ml的催化劑三乙胺，按照1：1.25比例加入fitc，22℃下避光反應6小時，沉淀并分離反應產(chǎn)物，22℃下真空干燥得到fitc標記的維生素b12。

實施例3：本發(fā)明所述的vb12-fitc的制備

(a)氮氣保護下將200mg的維生素b12溶解于4ml經(jīng)除水處理的二甲基亞砜(dmso)，加入400mg的活化劑n,n'-羰基二咪唑(cdi)，25℃下避光活化12小時，加入800mg二1,8-氨基-3,6-二氧雜辛烷，繼續(xù)在25℃下反應6小時。用500ml丙酮沉淀反應產(chǎn)物，并在10000r/min條件下離心10min分離反應產(chǎn)物，20℃下真空干燥得到氨基化的維生素b12。

(b)將步驟a得到的氨基化維生素b12，稱取150ng溶解于4ml經(jīng)除水處理的二甲基亞砜(dmso)，加入0.1ml的催化劑三乙胺，按照1：1.5比例加入fitc，25℃下避光反應6小時，沉淀并分離反應產(chǎn)物，20℃下真空干燥得到fitc標記的維生素b12。

實施例4：本發(fā)明所述的vb12-fitc的分析

(1)vb12-fitc的合成驗證：利用高效液相色譜儀(hplc)、質(zhì)譜分析儀，分別檢測vb12、fitc各自的波譜、分子量，驗證vb2-fitc的偶聯(lián)。

(2)vb12-fitc的腫瘤吸收流式分析：培養(yǎng)胃癌細胞(ags)至70-80％的密度，加入vb12-fitc，共孵育4h后，pbs重懸兩次后，使用流式細胞儀檢測細胞對熒光標記維生素b12的吸收率。

(3)vb12-fitc的腫瘤吸收顯像：在共聚焦皿中培養(yǎng)胃癌細胞(ags)至70-80％的密度，加入vb12-fitc，在不同時間段固定細胞，用dapi染細胞核，并用激光共聚焦觀察vb12-fitc的吸收部位及吸收量。

(4)vb12-fitc的在體腫瘤顯像：利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，在胃癌細胞(ags)中穩(wěn)定轉(zhuǎn)入表達紅光載體片段，進而擴大培養(yǎng)細胞。取1×10⁷細胞，注射入裸鼠皮下，構(gòu)建胃癌裸鼠模型。在尾靜脈注射vb12-fitc前后，分別用活體成像儀觀察vb12的腫瘤靶向性。

質(zhì)譜分析結(jié)果如圖1所示：fitc標記的維生素b12，經(jīng)過離子化后帶上二價電荷，出現(xiàn)不同質(zhì)荷比的離子碎片(1007.41、1020.92，1034.42豐度最高)是因為fitc標記的維生素b12分子結(jié)構(gòu)比較復雜，離子化過程帶上不同數(shù)量的正離子(na⁺、k⁺或h⁺)，如1034的離子碎片帶上了兩個鉀離子、三個鉀離子和3個氫離子：1034×2-1918(fitc-vb12)＝39(k⁺)×2+23(na⁺)×3+3×1(h⁺)。

高效液相色譜法分析如圖2所示：用熒光檢測器fld，采用fitc的激發(fā)波長490nm，發(fā)射波長為520nm，從高效液相的流出曲線看，fitc修飾vb12后，分子極性發(fā)生變化，相比fitc，更快流出柱子，fitc-vb12的流出時間為15.1min，fitc的流出時間為16.8min。從fitc-vb12的流出曲線看，沒反應的fitc的殘留非常少，說明標記效率較高。

流式分析結(jié)果如圖3所示：ags在fitc通道有90.9％的陽性率，這提示ags胃癌細胞對vb12-fitc有高度攝取能力。

共聚焦顯微鏡結(jié)果如圖4所示：隨著時間增加，fitc標記維生素b12的胃癌細胞的吸收量逐漸增加。

活體成像結(jié)果如圖5所示：在胃癌裸鼠模型中，fitc標記維生素b12在腫瘤部位高度聚集。