本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種人肝再生增強(qiáng)因子突變體、基因及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

以HBV感染為代表的各種慢性肝病，難以有效徹底的治愈，導(dǎo)致各種肝纖維化、肝損傷、肝硬化和肝癌等，是長(zhǎng)期以來(lái)我國(guó)人民健康的沉重負(fù)擔(dān)。

多種動(dòng)物來(lái)源的“促肝細(xì)胞生成素”，現(xiàn)在臨床上仍然在使用；這類(lèi)藥物，純度低，雜質(zhì)多，有效成分不明，臨床副反應(yīng)大。尋求一種能夠有效促進(jìn)肝再生的藥物，很有意義。

1994年，Hagiya等人(Hagiya M.et al.,1994,PNAS,91:8142-8146)首先發(fā)現(xiàn)了大鼠ALR(肝臟再生增強(qiáng)因子augmenter of liver regeneration)基因。大鼠體內(nèi)的的ALR，是由兩條125個(gè)氨基酸多肽鏈組成的同源二聚體，分子量約30KD。在埃克瘺模型中，大鼠ALR能在體內(nèi)發(fā)揮顯著的生物學(xué)作用，但在體外不能刺激肝源細(xì)胞的增殖。Giorda等人(Giorda R,et al,1996,Mol Med,2:97-108)于1996年克隆了人肝再生增強(qiáng)因子(human augmenter of liver regeneration，hALR)的基因，并發(fā)現(xiàn)hLAR在睪丸和肝臟中表達(dá)豐度最高。其后，大量的研究表明，體外重組表達(dá)的重組人肝臟再生增強(qiáng)因子(recombinant human augmenter of liver regeneration，簡(jiǎn)稱rhALR)的生物活性研究結(jié)果表明，rhALR對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷與肝纖維化有明顯的治療作用。

ALR是一種進(jìn)化過(guò)程中高度保守的蛋白，hALR和釀酒酵母的ERV1有46％的氨基酸序列同源性，而ERV1是一種以FAD為輔基、定位于線粒體內(nèi)膜空間的氧化還原酶，與線粒體的生成、細(xì)胞分裂周期的調(diào)節(jié)有關(guān)。

hALR同樣也是一種含F(xiàn)AD的氧化還原酶，其巰基氧化活性與肝臟再生相關(guān)。天然的hALR是同源二聚體蛋白，有兩種形式：?jiǎn)捂?25個(gè)氨基酸的截短型，定位于細(xì)胞核；單鏈205的氨基酸的全長(zhǎng)型，定位于線粒體和胞漿。很多研究結(jié)果表明，截短型的hALR(125aa)重組蛋白，即具有顯著的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)和肝再生活性。

采用基因工程技術(shù)，研制重組人肝臟再生增強(qiáng)因子(recombinant human augmenter of liver regeneration，簡(jiǎn)稱rhALR)，則正是一種很有希望的候選藥物。

現(xiàn)有技術(shù)中，按表達(dá)體系分類(lèi)，rhALR主要是畢赤酵母和大腸桿菌兩種表達(dá)體系。但大腸桿菌表達(dá)體系由于是原核表達(dá)系統(tǒng)，在表達(dá)真核細(xì)胞的蛋白時(shí)，在蛋白折疊和翻譯后修飾等方面存在缺陷，最終表達(dá)的rhALR活性較差。而畢赤酵母表達(dá)的rhALR產(chǎn)量低，且不均一，大部分蛋白發(fā)生了降解，使N端7個(gè)氨基酸殘基被切掉了。

授權(quán)公告號(hào)為CN100339478C的中國(guó)發(fā)明專利公開(kāi)了一種肝再生增強(qiáng)因子及其突變體，為同源二聚體蛋白，該蛋白的組成亞基是截短行的hALR(125aa)去除了N端前7個(gè)氨基酸殘基，即剩下118個(gè)氨基酸長(zhǎng)度?；钚詸z測(cè)發(fā)現(xiàn)，該突變體與另一種只在N端7～12個(gè)氨基酸殘基部分有明顯差異的人ALR蛋白(GenBank XM_034465)及該人ALR蛋白第12位精氨酸缺失的突變體，三者的酵母來(lái)源產(chǎn)物活性無(wú)顯著差異。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種人肝再生增強(qiáng)因子突變體，表達(dá)時(shí)均一性更好，活性顯著提高。

人肝再生增強(qiáng)因子突變體，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

畢赤酵母分泌表達(dá)重組蛋白至細(xì)胞外，是依賴Kex2酶識(shí)別切割KR^↓(賴氨酸-精氨酸)序列。所以畢赤酵母表達(dá)125aa的截短型hALR時(shí)，會(huì)造成表達(dá)產(chǎn)物不均一，其中大部分被酶切掉了N端的7個(gè)氨基酸。而研究發(fā)現(xiàn)缺失前7位氨基酸對(duì)其活性沒(méi)有影響。所以現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)有報(bào)道缺失前7位氨基酸的突變體。

考慮到第71位和第72位氨基酸殘基也為KR序列，有可能也存在被畢赤酵母中Kex2酶識(shí)別切割的可能，所以，本發(fā)明中將第71賴氨酸突變成精氨酸(K71R)，第72位精氨酸突變?yōu)橘嚢彼?R72K)。

天然hALR二聚體是通過(guò)C15-C124兩對(duì)二硫鍵反向組合而成的同源二聚體，同源二聚體活性的產(chǎn)生有可能是兩個(gè)亞基合作完成，也有可能是兩個(gè)亞基各有一個(gè)獨(dú)立的活性區(qū)域。將hALR(SEQ ID No.4)氨基酸序列中的C15和C124位半胱氨酸均突變?yōu)榻z氨酸，以消除天然hALR二聚體中的鏈間二硫鍵，使獲得的重組蛋白能夠以單體形式穩(wěn)定存在。

所以本發(fā)明將hALR的N端前7個(gè)氨基酸殘基刪除后，再進(jìn)行了4個(gè)單點(diǎn)突變(C15S、K71R、R72K、C124S)獲得一種新的突變體，命名為hALRs，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。經(jīng)畢赤酵母重組表達(dá)獲得的該突變體蛋白命名為rhALRs。

本發(fā)明又提供了人肝再生增強(qiáng)因子突變體基因，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本發(fā)明又提供了包含所述人肝再生增強(qiáng)因子突變體基因的重組表達(dá)載體。所述重組表達(dá)載體的原始載體可以是適合大腸桿菌表達(dá)的質(zhì)粒，也可以是適合真核細(xì)胞(如酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞)表達(dá)的載體。

本發(fā)明又提供了包含所述重組表達(dá)載體的宿主生物體。所述重組表達(dá)載體的原始載體種類(lèi)決定了所適用的宿主生物體，可以是原核表達(dá)的大腸桿菌，也可以是真核細(xì)胞(如酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞)。

優(yōu)選的，所述宿主生物體為酵母。

更優(yōu)選的，所述宿主生物體為畢赤酵母。

本發(fā)明還提供了所述的宿主生物體在生產(chǎn)重組人肝再生增強(qiáng)因子突變體中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種重組人肝再生增強(qiáng)因子突變體的生產(chǎn)方法，包括以下步驟：

(1)培養(yǎng)所述宿主生物體以表達(dá)重組人肝再生增強(qiáng)因子突變體；

(2)培養(yǎng)產(chǎn)物分離純化獲得純度為醫(yī)學(xué)上可接受的重組人肝再生增強(qiáng)因子突變體，

所述重組人肝再生增強(qiáng)因子突變體為單體形式。

本發(fā)明還提供了所述的人肝再生增強(qiáng)因子突變體基因在生產(chǎn)重組人肝再生增強(qiáng)因子突變體中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了所述人肝再生增強(qiáng)因子突變體在制備預(yù)防或治療肝損傷、肝纖維化、肝衰竭或肝壞死的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明人肝再生增強(qiáng)因子突變體通過(guò)將N端7個(gè)氨基酸殘基刪除，然后再進(jìn)行了4個(gè)單點(diǎn)突變(C15S、K71R、R72K、C124S)獲得一種新的突變體，該突變體的基因在畢赤酵母中表達(dá)獲得的突變體蛋白為單體形式存在，更有利于活性中心(C62-C65)和結(jié)合在附近的FAD的暴露，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其巰基氧化活性提高了20％以上，體外促肝細(xì)胞增殖能力和體內(nèi)四氯化碳肝損傷的保護(hù)效果也有所提高，且潛在酶切位點(diǎn)突變掉后，所得產(chǎn)物更加均一，為后續(xù)的提取純化的規(guī)?；刹僮餍蕴峁┍Ｕ?，為開(kāi)發(fā)臨床應(yīng)用提供了可靠基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中酵母表達(dá)產(chǎn)物初步純化后電泳圖，其中泳道1為樣品，泳道2位分子量標(biāo)記。

圖2為實(shí)施例1中純化后的rhALR和rhALR(Δ1-7)電泳圖，其中泳道1為分子量標(biāo)記，泳道2為rhALR，泳道3為rhALR(Δ1-7)。

圖3為實(shí)施例2中rhALRs發(fā)酵上清液電泳圖，其中泳道1為樣品，泳道2為分子量標(biāo)記。

圖4為實(shí)施例2中rhALRs純化結(jié)果電泳圖，其中泳道1為分子量標(biāo)記，泳道2為離子交換洗脫峰，泳道3為分子篩洗脫峰。

圖5為實(shí)施例3中氧化還原酶活性測(cè)定結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明中所涉及基因合成、克隆、表達(dá)、發(fā)酵、蛋白提取純化等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，均可參見(jiàn)科學(xué)出版社2002年版、薩姆布洛克等人編著的“分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南”中譯本、Invitrogen公司的“畢赤酵母多拷貝表達(dá)載體試劑盒”說(shuō)明書(shū)。

實(shí)施例1

參照Genebank中CAB87993(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/cab87993)所載氨基酸序列(81-205位氨基酸，共125個(gè)氨基酸)，優(yōu)化密碼子，委托生工生物工程上海公司合成適合于畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)的hALR基因(SEQ ID No.3)，克隆至pPICZα，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pPICZα-hALR；表達(dá)質(zhì)粒線性化后，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33，加壓后挑取高抗轉(zhuǎn)化子，試管表達(dá)篩選獲得表達(dá)菌株。

采用BSM培養(yǎng)基發(fā)酵，OD至6以上開(kāi)始甲醇誘導(dǎo)，誘導(dǎo)72～96小時(shí)后放罐，離心收集上清液。

酵母表達(dá)的rhALR，在表達(dá)過(guò)程中即嵌合了FAD分子，表達(dá)產(chǎn)物為天然二聚體，純化后的蛋白溶液呈透明黃色，說(shuō)明發(fā)酵表達(dá)過(guò)程中，已經(jīng)形成了穩(wěn)定的蛋白-FAD復(fù)合體。

但是，酵母表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)超濾濃縮和硫銨沉淀初純后，在SDS-GAGE上呈兩個(gè)條帶(圖1)，大部分表達(dá)蛋白的分子量略低于理論分子量，只有極少量表達(dá)產(chǎn)物位于正確的30KD分子量位置。

繼續(xù)采用陰離子交換層析柱(MonoQ)純化，先后分別用含300mM鹽的PB(pH7.5)和含600mM鹽的PB(pH7.5)洗脫，得組分1和組分2；兩個(gè)組分再分別經(jīng)HIC疏水層析(Phenyl HIC)和分子篩(Sepharcryl S100)進(jìn)一步純化可得兩種單一條帶的ALR樣品(圖2)。洗脫產(chǎn)物加入5％甘露醇，BCA法定量后存放于4℃，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

氨基端測(cè)序(N端測(cè)序)證明，占極少量、位于正確分子量位置的表達(dá)產(chǎn)物，氨基末端序列為MRTQQKRDTK，為天然正確序列，命名為rhALR；占大部分、分子量較小、前7個(gè)氨基酸缺失的表達(dá)產(chǎn)物氨基末端序列為DTKFREDCPP，將這一缺失了前7個(gè)氨基酸的重組人肝再生增強(qiáng)因子突變體，命名為rhALR(Δ1-7)。

實(shí)施例2

畢赤酵母分泌表達(dá)重組蛋白至細(xì)胞外，是依賴Kex2酶識(shí)別切割KR^↓(賴氨酸-精氨酸)序列。所以畢赤酵母表達(dá)125aa的截短型hALR時(shí)，會(huì)造成表達(dá)產(chǎn)物不均一，其中大部分被酶切掉了N端的7個(gè)氨基酸。而研究發(fā)現(xiàn)缺失前7位氨基酸對(duì)其活性沒(méi)有影響。所以現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)有報(bào)道缺失前7位氨基酸的突變體。

考慮到第71位和第72位氨基酸殘基也為KR序列，有可能也存在被畢赤酵母中Kex2酶識(shí)別切割的可能，所以，本發(fā)明中將第71賴氨酸突變成精氨酸(K71R)，第72位精氨酸突變?yōu)橘嚢彼?R72K)。

天然hALR二聚體是通過(guò)C15-C124兩對(duì)二硫鍵反向組合而成的同源二聚體，同源二聚體活性的產(chǎn)生有可能是兩個(gè)亞基合作完成，也有可能是兩個(gè)亞基各有一個(gè)獨(dú)立的活性區(qū)域。將hALR(SEQ ID No.4)氨基酸序列中的C15和C124位半胱氨酸均突變?yōu)榻z氨酸，以消除天然hALR二聚體中的鏈間二硫鍵，使獲得的重組蛋白能夠以單體形式穩(wěn)定存在。

所以本發(fā)明將hALR的N端前7個(gè)氨基酸殘基刪除后，再進(jìn)行了4個(gè)單點(diǎn)突變(C15S、K71R、R72K、C124S)獲得一種新的突變體，命名為hALRs，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。對(duì)應(yīng)的基因序列參照Genebank中CAB87993所載氨基酸序列(81-205位氨基酸，共125個(gè)氨基酸)，進(jìn)行優(yōu)化密碼子，委托生工生物工程上海公司合成適合于畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)的hALRs基因(序列如SEQ ID No.2所示)，克隆至pPICZα，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pPICZα-hALRs；表達(dá)質(zhì)粒線性化后，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33，加壓后挑取高抗轉(zhuǎn)化子，試管表達(dá)篩選獲得表達(dá)菌株。采用BSM培養(yǎng)基發(fā)酵，OD至6以上開(kāi)始甲醇誘導(dǎo)，誘導(dǎo)72-96小時(shí)后放罐，離心收集上清液；SDS-PAGE顯示表達(dá)條帶均實(shí)清晰，表明表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)均一(圖3)。

超濾濃縮后硫銨沉淀，沉淀用PB(pH7.5)溶解并透析，得粗提液。

粗提液上陰離子交換層析柱(MonoQ，GE公司)，先后分別用含200mM鹽的PB(pH7.5)洗滌后，再用含600mM鹽的PB(pH7.5)洗脫，得重組表達(dá)的hALRs蛋白，命名為rhALRs；再經(jīng)分子篩(填料Sepharcryl S100)進(jìn)一步純化可得單一條帶純蛋白(圖4)。

洗脫產(chǎn)物加入5％甘露醇，Bradford法定量后存放于4℃，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

純化后的蛋白溶液呈透明黃色，說(shuō)明發(fā)酵表達(dá)過(guò)程中，已經(jīng)形成了穩(wěn)定的蛋白-FAD復(fù)合體。

實(shí)施例3

氧化還原酶活性檢測(cè)。按文獻(xiàn)(Lisowsky T.et al,Digest Liver Dis.,2001,33:173)方法進(jìn)行。

精確稱取谷胱甘肽(GSH)用20mM PB(pH7.5)配制成10mM的GSH母液，精確稱取DTNB(5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸))用水配制成10mM的溶液；酵母表達(dá)純化的rhALR、rhALR(Δ1-7)(實(shí)施例1中制備)和rhALRs(實(shí)施例2中制備)，同樣用20mM PB(pH7.5)稀釋至1mg/mL。

按表1配制反應(yīng)體系。

表1 ALR巰基氧化酶活性反應(yīng)測(cè)定

30℃靜置反應(yīng)6小時(shí)，加入DTNB 20μL至終濃度20μM，充分混勻，30℃繼續(xù)反應(yīng)5分鐘，測(cè)定412nm下的吸光度。巰基含量按公式計(jì)算：巰基(μM)＝OD₄₁₂/13.6。

ALR活性定義：在30℃反應(yīng)6小時(shí)能使GSH巰基含量降低一半(50％)，此時(shí)每毫升樣品中的ALR酶活性為1單位(U)。比活性計(jì)算公式為：1/C_1/2，單位是U/mg。

結(jié)果如圖5所示，橫坐標(biāo)為酶(ALR)的濃度，縱坐標(biāo)為殘余巰基數(shù)，使用指數(shù)擬合曲線，得到rhALR：y＝34.035e^-48.44x，R²＝0.9965；

rhALR(Δ1-7)：y＝35.943e^-48.67x，R²＝0.9979；

rhALRs：y＝35.843e^-64.77x，R²＝0.9935。

結(jié)果表明：rhALR、rhALR(Δ1-7)和rhALRs氧化50％GSH巰基的濃度分別為0.0160mg/mL、0.0164mg/mL和0.0132mg/mL，比活性分別為62.5U/mg、60.97U/mg、75.8U/mg；相較于rhALR和rhALR(Δ1-7)，rhALRs的比活性分別提高了21.3％((75.8-62.5)/62.5)和24.3％((75.8-60.97)/60.97)。

實(shí)施例4

體外促肝細(xì)胞生長(zhǎng)活性。

人肝細(xì)胞LH7702，DMEM培養(yǎng)基傳代生長(zhǎng)，每孔5000細(xì)胞種板，24h后換液給藥。組別設(shè)置為：正常對(duì)照組(C+)：培養(yǎng)基含10％胎牛血清；營(yíng)養(yǎng)缺乏組(C-)：培養(yǎng)基含5％胎牛血清；各給藥組：在含5％胎牛血清的培養(yǎng)基中加入不同濃度(10、1、0.1、0.01、0.001μg/ml)的rhALR、rhALR(Δ1-7)(實(shí)施例1中制備)和rhALRs(實(shí)施例2中制備)，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，MTT染色，測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。結(jié)果如表2所示。

表2：重組人ALR對(duì)人肝細(xì)胞的生長(zhǎng)促進(jìn)作用(X＝Mean±SD，n＝8)

注：*表示與C-比較，差異顯著(p<0.05)；**表示與C-比較，差異極顯著(p<0.01)。

結(jié)果表明：1)rhALR和rhALRs在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)均能顯著促進(jìn)人肝細(xì)胞的增殖，抵御營(yíng)養(yǎng)脅迫造成的細(xì)胞損傷；2)rhALRs的促生長(zhǎng)作用稍強(qiáng)于rhALR和rhALR(Δ1-7)；3)值得注意，在高濃度下(10μg/mL)，反而活性未顯示，提示高濃度情況下也許存在細(xì)胞毒作用。

實(shí)施例5

體內(nèi)肝損傷修復(fù)試驗(yàn)。

供試動(dòng)物為體重大約25g的Baclb/c小鼠，每組5只。動(dòng)物腹腔注射10％的CCl₄10mL/kg制備模型，造模4h后，隨即分組開(kāi)始治療試驗(yàn)。供試樣品為rhALR、rhALR(Δ1-7)(實(shí)施例1中制備)和rhALRs(實(shí)施例2中制備)，劑量設(shè)置為100μg/kg、10μg/kg和1μg/kg，每12小時(shí)腹腔注射一次，共4次；同時(shí)設(shè)立腹腔注射生理鹽水作為正常對(duì)照組。完成治療后24h處死動(dòng)物取血，統(tǒng)一用全自動(dòng)生化儀對(duì)血清中的ALT/AST水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如下表3所示。

表3：重組人ALR對(duì)CCl₄損傷模型的肝臟保護(hù)(ALT/AST，U/L，n＝5)

注：*表示與模型組比較，差異顯著(p<0.05)；**表示與模型組比較，差異極顯著(p<0.01)。

結(jié)果表明：1)ALR對(duì)于CCl₄導(dǎo)致的肝臟損傷具有確切的保護(hù)作用，與模型組相比較，治療組ALT和AST的水平大幅顯著下降；2)10μg/kg劑量治療效果已經(jīng)很顯著，再提高治療劑量(100μg/kg)，不再呈現(xiàn)量效關(guān)系；3)rhALRs的治療效果略好于rhALR和rhALR(Δ1-7)。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽新星生物工程有限公司

<120> 人肝再生增強(qiáng)因子突變體、基因及應(yīng)用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asp Thr Lys Phe Arg Glu Asp Ser Pro Pro Asp Arg Glu Glu Leu Gly

1 5 10 15

Arg His Ser Trp Ala Val Leu His Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Pro Asp

20 25 30

Leu Pro Thr Pro Glu Gln Gln Gln Asp Met Ala Gln Phe Ile His Leu

35 40 45

Phe Ser Lys Phe Tyr Pro Cys Glu Glu Cys Ala Glu Asp Leu Arg Arg

50 55 60

Lys Leu Cys Arg Asn His Pro Asp Thr Arg Thr Arg Ala Cys Phe Thr

65 70 75 80

Gln Trp Leu Cys His Leu His Asn Glu Val Asn Arg Lys Leu Gly Lys

85 90 95

Pro Asp Phe Asp Cys Ser Lys Val Asp Glu Arg Trp Arg Asp Gly Trp

100 105 110

Lys Asp Gly Ser Ser Asp

115

<210> 2

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gacactaagt tcagagaaga ctctccacca gacagagaag aattgggtag acactcttgg 60

gctgttttgc acactttggc tgcttactac ccagacttgc caactccaga acaacaacaa 120

gacatggctc aattcatcca cttgttctct aagttctacc catgtgaaga atgtgctgaa 180

gacttgagaa gaaaattgtg tagaaaccac ccagacacta gaactagagc ttgtttcact 240

caatggttgt gtcacttgca caacgaagtt aacagaaagt tgggtaagcc agacttcgac 300

tgttctaagg ttgacgaaag atggagagac ggttggaagg acggttcttc tgactaa 357

<210> 3

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgcggactc agcagaagcg ggacaccaag tttagggagg actgcccgcc ggatcgcgag 60

gaactgggcc gccacagctg ggctgttctt cacaccctgg ccgcctacta ccccgacctg 120

cccaccccag aacagcagca ggacatggcc cagttcatac atttattttc taagttttac 180

ccctgtgagg agtgtgctga agacctaagg aagaggttgt gcaggaacca cccagacacc 240

cgcacccggg catgcttcac gcagtggctg tgccacctgc acaatgaagt gaaccgcaag 300

ctgggcaagc ctgacttcga ctgctcaaag gtggatgagc gctggcgcga cggctggaag 360

gatggctcct gtgactaa 378

<210> 4

<211> 125

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Arg Thr Gln Gln Lys Arg Asp Thr Lys Phe Arg Glu Asp Cys Pro

1 5 10 15

Pro Asp Arg Glu Glu Leu Gly Arg His Ser Trp Ala Val Leu His Thr

20 25 30

Leu Ala Ala Tyr Tyr Pro Asp Leu Pro Thr Pro Glu Gln Gln Gln Asp

35 40 45

Met Ala Gln Phe Ile His Leu Phe Ser Lys Phe Tyr Pro Cys Glu Glu

50 55 60

Cys Ala Glu Asp Leu Arg Lys Arg Leu Cys Arg Asn His Pro Asp Thr

65 70 75 80

Arg Thr Arg Ala Cys Phe Thr Gln Trp Leu Cys His Leu His Asn Glu

85 90 95

Val Asn Arg Lys Leu Gly Lys Pro Asp Phe Asp Cys Ser Lys Val Asp

100 105 110

Glu Arg Trp Arg Asp Gly Trp Lys Asp Gly Ser Cys Asp

115 120 125