本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種基于3d溫敏型生物凝膠懸滴培養(yǎng)法體外計數(shù)肝癌循環(huán)腫瘤細胞的方法。

背景技術(shù)：

肝細胞肝癌(hepatocellularcarcinoma,hcc)是一種起源于肝細胞的惡性腫瘤，素有“癌中之王”的稱號，其發(fā)病較其他腫瘤而言相對隱匿，病程短、治療困難，嚴重威脅著人類的生命健康。據(jù)2016年《acancerjournalforclinicians》雜志的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示：2015年中國境內(nèi)共計281.4萬人死于各種癌癥，其中42.2萬人死于肝癌，僅次于肺癌(61.0萬)與胃癌(49.8萬)，病死率居全國第3位。由于在肝癌的早期，患者多沒有典型臨床癥狀和體征，臨床上難以發(fā)現(xiàn)，而一旦出現(xiàn)典型癥狀，多已是中、晚期肝癌，此時往往伴隨著肝癌的肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移，最終患者多因此死亡。肝癌患者較差的預(yù)后主要是由于肝內(nèi)及肝外轉(zhuǎn)移。而研究表明那些直徑僅有0.5cm-1cm的肝癌瘤體(目前的影像學(xué)檢查的極限)就已經(jīng)開始向血道散播循環(huán)腫瘤細胞(circulatingtumorcell,ctc)，甚至在遠端器官中形成微小的轉(zhuǎn)移灶，成為肝癌惡性患者出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)和遠端轉(zhuǎn)移的高危因子。因此檢測肝癌患者體內(nèi)是否具有ctc顯得尤為迫切。

ctc在外周血中數(shù)量稀少，其檢測診斷存在一定的技術(shù)難度。目前檢測方法分為兩大類：1、不富集ctc，直接根據(jù)腫瘤標(biāo)志物通過流式細胞術(shù)、pcr等手段進行檢測；2、通過ctc表面標(biāo)志物磁珠富集后，熒光染色后進行計數(shù)。目前這些檢測手段都取得了一定的臨床數(shù)據(jù)，其代表為強生公司的cellsearch系統(tǒng)，2004年美國食品和藥品管理局(foodanddrugsadmistration,fda)批準(zhǔn)了該系統(tǒng)用于檢測轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者外周血ctc，成為第一個獲準(zhǔn)進入臨床運用的ctc檢測方法。

遺憾的是，目前現(xiàn)有的檢測系統(tǒng)并不適用于肝癌ctc檢測。以cellsearch系統(tǒng)為例，儀器分選所用的epcam靶點僅適用于上皮來源的ctc。但進一步研究表明，即使用于在上皮來源ctc檢測，該系統(tǒng)所獲得的數(shù)據(jù)也極不完善：美國mdanderson和baylor醫(yī)學(xué)院的研究人員發(fā)現(xiàn)，在腫瘤ctc轉(zhuǎn)移中會發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition,emt)，從而epcam及ck蛋白在ctc中發(fā)生降解從而無法被系統(tǒng)捕捉；過高的假陽性也限制了該系統(tǒng)應(yīng)用于腫瘤篩查，有研究發(fā)現(xiàn)克羅恩病人中有11％-19％的患者會出現(xiàn)ck+/epcam+陽性信號，這些細胞實際是是腸上皮細胞而非腫瘤細胞；本發(fā)明對geo數(shù)據(jù)庫中樣本量最大的一例肝癌數(shù)據(jù)芯片集進行分析(樣本涵蓋220例癌旁與225例癌組織)，結(jié)果顯示epcam在肝癌中的陽性率低于30％。這些結(jié)果均提示現(xiàn)有的技術(shù)手段依然存在技術(shù)上的巨大漏洞，并不適用于肝癌ctc檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對目前肝癌ctc檢測面臨的臨床問題，提供一種新型的肝癌循環(huán)腫瘤細胞的計數(shù)方案，具體是指一種基于3d溫敏型生物凝膠懸滴培養(yǎng)法體外計數(shù)肝癌循環(huán)腫瘤細胞的方法，該方法在檢測肝癌患者外周血中腫瘤細胞數(shù)目、并由此判斷預(yù)后中的應(yīng)用；本發(fā)明還提供了溫敏型生物凝膠及其培養(yǎng)上清的制備方案與配方。

本發(fā)明的第一方面，提供一種用于懸滴培養(yǎng)法體外計數(shù)肝癌循環(huán)腫瘤細胞的溫敏型生物凝膠，由體積比為8:1:1的a液、b液和c液組成(混合時是將a液、b液和c液三種液體按比例逐一混合，并用無菌鉑金棒攪拌均勻，全過程在冰上操作)；

所述的a液，包括生物凝膠的骨架溶液和基質(zhì)溶液，7ml骨架溶液與1ml基質(zhì)溶液在冰上混合，并用無菌鉑金棒攪拌均勻，4℃保存，即得a液；

所述的生物凝膠的骨架溶液：使用親水鏈聚氧乙烯占60％以上的泊洛沙姆，配置體積分數(shù)為20-45％的泊洛沙姆(poloxamer)溶液；配置體積分數(shù)為0.2-0.7％的羥丁基殼聚糖溶液；兩種液體在冰上冰浴15min后，將兩者按體積比1：1充分混合，獲得所述的生物凝膠的骨架溶液；

所述的生物凝膠的基質(zhì)溶液：將0.5-0.8mgiv型膠原、0.01-0.1mg分子量為10000-50000的透明質(zhì)酸和0.01-0.1mg硫酸氨基葡糖多聚糖于1ml超純水中4℃下過夜溶解，獲得生物凝膠的基質(zhì)溶液；

所述的b液組分為10倍濃度的dm/f12培養(yǎng)基，每1mlb液中加入1000-5000iu的rh-egf，作用為調(diào)節(jié)生物凝膠內(nèi)的營養(yǎng)成分和離子濃度；

所述的c液組分為ph＝2.5-3.0的乳酸-乳酸鈉緩沖液(0.025-0.05mol)，作用為調(diào)節(jié)生物凝膠內(nèi)的ph值。

本發(fā)明的第二方面，提供上述的溫敏型生物凝膠在懸滴培養(yǎng)法體外計數(shù)肝癌循環(huán)腫瘤細胞中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三方面，提供一種基于上述的3d溫敏型生物凝膠懸滴培養(yǎng)法體外計數(shù)肝癌循環(huán)腫瘤細胞的方法，包括以下步驟：

(a)取肝癌患者10ml外周血，ficoll密度梯度離心法分離患者外周血有核細胞；

(b)使用stemcellcd45陰選試劑盒去除白細胞，20μl磷酸鹽緩沖液(pbs)重懸；

(c)所述的溫敏型生物凝膠的a液、b液和c液按比例逐一混合，并用無菌鉑金棒攪拌均勻，加入細胞，全過程在冰上操作(具體為800μla液在冰上先與100μlb液混合，無菌鉑金棒攪拌均勻后，加入100μlc液，再次攪拌均勻，加入20μl細胞懸液，全過程在冰上操作)；

(d)24孔培養(yǎng)板在37℃預(yù)熱30min，細胞凝膠混合液50μl/滴加至預(yù)熱培養(yǎng)板上，使凝膠迅速轉(zhuǎn)化為果凍狀；

(e)37℃、5％co2細胞培養(yǎng)箱中孵育2h，加入37℃預(yù)熱的培養(yǎng)上清1ml；

(f)連續(xù)培養(yǎng)7天后，4x物鏡下進行克隆環(huán)計數(shù)。

所述的步驟e中的培養(yǎng)上清為：dm/f12培養(yǎng)基中加入8-10％的gibco10099-141胎牛血清，每100ml培養(yǎng)基加入l-谷氨酰胺200mm。

本發(fā)明的第四方面，提供一種用于肝癌循環(huán)腫瘤細胞懸滴培養(yǎng)法的試劑，包括上述的溫敏型生物凝膠和懸滴培養(yǎng)法培養(yǎng)上清，所述的懸滴培養(yǎng)法培養(yǎng)上清為：dm/f12培養(yǎng)基中加入8-10％的gibco10099-141胎牛血清，每100ml培養(yǎng)基加入l-谷氨酰胺200mm。

本發(fā)明的第五方面，提供一種上述的用于肝癌循環(huán)腫瘤細胞懸滴培養(yǎng)法的試劑在懸滴培養(yǎng)法體外計數(shù)肝癌循環(huán)腫瘤細胞中的應(yīng)用。

本發(fā)明優(yōu)點在于：

1、本發(fā)明的溫敏型生物凝膠以羥丁基殼聚糖和泊洛沙姆為骨架，添加了腫瘤細胞所在的細胞外基質(zhì)(ecm)所含有的iv型膠原、透明質(zhì)酸與硫酸氨基葡糖多聚糖等組分，充分模擬腫瘤在體內(nèi)的生長環(huán)境，使肝癌ctc可以在凝膠中生長，并通過分泌iv型膠原酶溶解部分機制，形成顯微鏡下可見的克隆環(huán)，從而實現(xiàn)計數(shù)的可操作性；同時在培養(yǎng)上清中添加重組人表皮生長因子(rh-egf)，使每一個ctc都可以在凝膠中充分生長，提高計數(shù)的敏感性。

2、本發(fā)明的溫敏型生物凝膠在4℃下呈現(xiàn)溶液狀態(tài)，在溶液狀態(tài)下可以加入循環(huán)腫瘤細胞，使其在凝膠中充分混勻；37℃下呈現(xiàn)果凍狀膠體，肝癌ctc種植后在固定位置生長。

3、本發(fā)明的溫敏型生物凝膠中的iv型膠原酶和透明質(zhì)酸等成分在ctc生長過程中被其分泌的膠原酶、透明質(zhì)酸酶等成分分解，形成折光度不同的克隆環(huán)，便于計數(shù)。

4、本發(fā)明的溫敏型生物凝膠與培養(yǎng)上清中均含有rh-egf，保證所有的肝癌ctc在此體系中可以中充分生長，確保了檢測精度。

5、本發(fā)明的方法簡單，工藝成熟，成本較低，為肝癌循環(huán)腫瘤細胞的診斷提供了新的臨床手段。

附圖說明

圖1為懸滴法培養(yǎng)肝癌ctc的技術(shù)流程示意圖：簡而言之是通過ficoll分離患者外周血有核細胞后，使用cd45磁珠陰選去除白細胞，將剩余細胞與溫敏型3d生物凝膠(具有4℃呈液體，37℃呈果凍樣的特點)混合后，50μl/滴加至預(yù)熱培養(yǎng)板上凝結(jié)，并加入液體培養(yǎng)基作為營養(yǎng)支持。

圖2是懸滴法培養(yǎng)肝癌ctc7天后，凝膠中形成的一個典型的ctc克隆。外周一圈折光度不同的圓環(huán)命名為“克隆環(huán)”，是由肝癌ctc在生長過程中分解基質(zhì)膠中的ecm成分所形成。

圖3是通過單細胞熒光定量pcr法，檢測挑取的5個ctc克隆與正常肝細胞之間腫瘤標(biāo)志物gpc3和afp的相對表達量。

圖4是通過抽取健康志愿者外周靜脈血10ml，分別摻入含有100個、250個、500個和1000個hep3b或smmc-7721腫瘤細胞系細胞。充分混勻后取1ml作為檢測樣本，按照實施例1中的分離培養(yǎng)方法，進行ctc分離、培養(yǎng)與計數(shù)。其敏感度計算公式按正文中所示。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的具體實施方式作詳細說明。

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

除非另有描述，本發(fā)明的實施將采用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組dna和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。這些技術(shù)在下列文獻中有完整的描述：例如，sambrook《分子克隆實驗指南》第2版(1989)；《dna克隆》第i和ii卷(d.n.glover編輯1985)；《寡核苷酸合成》(m.j.gait編輯，1984)；《核酸雜交》(b.d.hames和s.j.higgins編輯.1984)；《蛋白質(zhì)純化：原理和實踐》第2版(springer-verlag，n.y.)，以及《實驗免疫學(xué)手冊》i-iv卷(d.c.weir和c.c.blackwell編輯1986)?；蛘?，可按照試劑生產(chǎn)商所提供的說明書進行。

除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

實施例1：一例肝癌晚期患者術(shù)前ctc培養(yǎng)結(jié)果

1.實驗方法：

(1)抽取該患者10ml術(shù)前外周血，與hbss緩沖液1:1混合，置于50ml離心管中。在另一50ml離心管中加入10mlficoll密度梯度液，將稀釋后的外周血輕輕加至密度梯度液上，使其形成明顯的分層。2000rpm室溫離心20min，此時液體分為4層，用3ml巴氏滴管吸取有核細胞層，加入10mlhbss緩沖液中，1000rpm離心5min收集細胞并充分去除上清，加入1mlhbss(含有2％血清)重懸細胞，并轉(zhuǎn)移至5ml無菌流式管中。

(2)加入stemcellcd45陰選磁珠20μl，輕柔混勻后室溫孵育15min，將其放入磁場中，靜置30min，輕柔吸取全部上清，轉(zhuǎn)移至新的5ml無菌流式管中，重復(fù)上述步驟一次。1000rpm離心5min收集細胞，充分去除上清，20μl磷酸鹽緩沖液(pbs)重懸。

(3)800μl生物凝膠a與100μlb液和100μlc液，按已經(jīng)闡明的步驟混合后，加入20μl細胞懸液，全過程在冰上操作。

(4)24孔培養(yǎng)板在37℃預(yù)熱30min，細胞凝膠混合液按50μl/滴加至預(yù)熱培養(yǎng)板上，使凝膠迅速轉(zhuǎn)化為果凍狀。之后培養(yǎng)板在37℃、5％co2細胞培養(yǎng)箱中孵育2h，使凝膠充分凝固。

(5)2h后，沿培養(yǎng)板孔壁緩慢加入37℃預(yù)熱的培養(yǎng)上清1ml。

(6)連續(xù)培養(yǎng)7天后，4x物鏡下進行克隆環(huán)計數(shù)。

(7)克隆挑取與鑒定：在培養(yǎng)出的ctc克隆中，挑取5個進行單細胞熒光定量pcr檢測肝癌標(biāo)志物gpc3和afp的表達量，以10-20個人肝細胞作為對照(膠原酶消化法后倍比稀釋獲取)。

2.實驗結(jié)果：

整個實驗流程簡圖如圖1所示。經(jīng)兩名實驗人員獨立計數(shù)，該患者10ml外周血中一共培養(yǎng)出46個ctc克隆。典型的克隆形態(tài)如圖2所示。經(jīng)過單細胞熒光定量pcr鑒定，相比于正常肝細胞，挑取的5個克隆均高表達gpc3和afp，為肝癌細胞(圖3)。

實施例2：肝癌ctc溫敏型生物凝膠懸滴培養(yǎng)法敏感度檢測

1.實驗方法：

(1)抽取健康志愿者外周靜脈血10ml，分別摻入含有100個、250個、500個和1000個hep3b或smmc-7721腫瘤細胞系細胞。

(2)充分混勻后，取1ml血，按實施例1中的分離培養(yǎng)方法，進行ctc分離、培養(yǎng)與計數(shù)。其敏感度按照如下方法計算：

2.實驗結(jié)果：

經(jīng)過獨立三次獨立重復(fù)實驗，該體系在hep3b細胞系中的檢出率為60％-80％，在smmc7721細胞系中的檢出率為70％-90％。結(jié)果如圖4所示。

實施例3：6例肝癌患者外周血懸滴培養(yǎng)法計數(shù)與cellsearch法計數(shù)敏感度對比

1.實驗方法：

臨床隨機挑取6名肝癌確診患者，每人抽取20ml外周靜脈血，10ml由第三方(中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽醫(yī)院)利用cellsearch系統(tǒng)檢測，10ml由我方進行懸滴培養(yǎng)法計數(shù)。

2.實驗結(jié)果：

1號患者cellsearch檢出ctc數(shù)目為3，懸滴培養(yǎng)法計數(shù)ctc為26；

2號患者cellsearch檢出ctc數(shù)目為6，懸滴培養(yǎng)法計數(shù)ctc為15；

3號患者cellsearch檢出ctc數(shù)目為5，懸滴培養(yǎng)法計數(shù)ctc為40；

4號患者cellsearch檢出ctc數(shù)目為13，懸滴培養(yǎng)法計數(shù)ctc為72；

5號患者cellsearch檢出ctc數(shù)目為1，懸滴培養(yǎng)法計數(shù)ctc為29；

6號患者cellsearch檢出ctc數(shù)目為5，懸滴培養(yǎng)法計數(shù)ctc為61。

懸滴培養(yǎng)法計數(shù)的敏感度要遠高于cellsearch系統(tǒng)。

以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。