本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種組合物及其用途。該組合物作為滲透壓穩(wěn)定劑，對原生質體具有保護作用，能夠防止原生質體失活。本發(fā)明還涉及一種應用該組合物作為滲透壓穩(wěn)定劑誘變原生質體的方法。

背景技術：

原生質體誘變是用誘變方法直接處理原生質體，經過繁殖再生培養(yǎng)，從中選育獲得突變株的過程。由于原生質體沒有細胞壁屏障，誘變劑容易進入細胞內，發(fā)生變異的概率更大、時間更短、效率更高。

常壓室溫等離子體(Atmospheric Room Temperature Plasma，簡稱ARTP)誘變是一種新型高效的物理誘變方法。ARTP誘變技術采用大氣壓射頻輝光放電等離子體源，激發(fā)具有高濃度活性粒子的等離子體射流作用于核酸、蛋白質，細胞整體結構等，能夠使微生物細胞壁、膜的結構及通透性改變，并引起基因損傷，進而使微生物基因序列及其代謝網絡發(fā)生顯著變化，最終導致微生物產生突變。根據(jù)DNA損傷強度和突變率大小評價不同誘變方法的優(yōu)劣，發(fā)現(xiàn)最大突變率與對應的DNA損傷強度呈正相關，ARTP能夠引起更多AT-GC之間的突變。ARTP誘變技術的DNA損傷強度、突變率明顯高于其它傳統(tǒng)誘變方法。ARTP誘變育種技術廣泛應用于細菌、真菌、放線菌、霉菌、藻類、大型真菌、植物及動物細胞。

ARTP誘變技術直接作用于原生質體時，滲透壓穩(wěn)定劑扮演著重要的角色。首先，滲透壓穩(wěn)定劑對去除細胞壁后的原生質體起著至關重要的保護作用，防止原生質體失活。其次，滲透壓穩(wěn)定劑提供原生質體ARTP誘變時的樣品處理環(huán)境，對ARTP高能活性離子的作用能力的強弱有著一定的影響。

滲透壓穩(wěn)定劑的組成在ARTP作用時對突變效果的影響在于：ARTP誘變，要求樣品層薄、分散均一，處理量小(μL級)，以便于ARTP等離子射流集中、高效作用于誘變材料，遠遠小于傳統(tǒng)原生質誘變方法中5mL的樣品處理量。隨著作用時間的延長，微量體系中水分揮發(fā)會對原生質體穩(wěn)定性造成較大影響，滲透壓增高，失去保護后的原生質體可能造成不可挽救性皺縮、脫水失活。因此，ARTP作用條件下，微量體系的穩(wěn)定性直接影響到ARTP對原生質體的作用效果。

如何保證微量體系中原生質體的穩(wěn)定性，使ARTP等離子體更好的應用于原生質體材料，從而提高ARTP誘變技術的突變效率，成為本領域需要解決的技術問題。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供一種組合物，該組合物作為滲透壓穩(wěn)定劑，對原生質體具有保護作用，能夠防止原生質體失活。采用該組合物滲透壓穩(wěn)定劑時，對原生質體進行ARTP誘變，能夠提高突變效率。本發(fā)明的另一個目的是提供一種應用本發(fā)明組合物作為滲透壓穩(wěn)定劑誘變原生質體的方法。

具體地，本發(fā)明涉及一種組合物，其包含：

滲透壓維持劑0.5～1.0wt％(例如0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％或0.9wt％)，

保濕劑5～40wt％，優(yōu)選為8～35wt％，進一步優(yōu)選為10～30wt％(例如15wt％、16wt％、18wt％、20wt％、22wt％、25wt％或28wt％)，

余量為pH緩沖劑，

該組合物的pH值為6.5～7.5(例如6.8、7.0、7.1、7.2或7.4)。

在一個實施方案中，本發(fā)明所述滲透壓維持劑選自：氯化鈉和氯化鉀。所述保濕劑選自：海藻糖、透明質酸、甘油、聚乙二醇和葡萄糖。所述pH緩沖劑選自：PBS緩沖液和Tris-HCl緩沖液。

在另一個實施方案中，本發(fā)明所述的組合物，其包含：

滲透壓維持劑0.5～1.0wt％，

保濕劑15～25wt％，

余量為pH緩沖劑，

該組合物的pH值為6.5～7.5。

在另一個實施方案中，本發(fā)明所述的組合物，其包含：

滲透壓維持劑0.6～0.9wt％，

保濕劑15～25wt％，

余量為pH緩沖劑，

該組合物的pH值為6.5～7.5。

在另一個實施方案中，本發(fā)明所述的組合物，其包含：

氯化鈉或氯化鉀0.5～1.0wt％(例如0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％或0.9wt％)，

甘油3～8wt％(例如4wt％、5wt％、6wt％或7wt％)，

海藻糖15～22wt％(例如16wt％、17wt％、18wt％、19wt％、20wt％或21wt％)，

余量為Tris-HCl緩沖液，

該組合物的pH值為6.8～7.2(例如6.9、7.0或7.1)。

在另一個實施方案中，本發(fā)明所述的組合物，其包含：

氯化鈉或氯化鉀0.5～1.0wt％(例如0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％或0.9wt％)，

透明質酸3～8wt％(例如4wt％、5wt％、6wt％或7wt％)，

甘油3～8wt％(例如4wt％、5wt％、6wt％或7wt％)，

聚乙二醇3～8wt％(例如4wt％、5wt％、6wt％或7wt％)，

余量為Tris-HCl緩沖液，

該組合物的pH值為7.0～7.5(例如7.1、7.2、7.3或7.4)。

在另一個實施方案中，本發(fā)明所述的組合物，其包含：

氯化鈉或氯化鉀0.5～1.0wt％(例如0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％或0.9wt％)，

葡萄糖8～12wt％(例如9wt％、10wt％或11wt％)，

透明質酸0.5～1.2wt％(例如0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、1.0wt％或1.1wt％)，

海藻糖3～8wt％(例如4wt％、5wt％、6wt％或7wt％)，

余量為PBS緩沖液，

該組合物的pH值為6.5～7.5(例如6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3或7.4)。

本發(fā)明還涉及前述任一項所述的組合物作為原生質體的滲透壓穩(wěn)定劑的用途。

本發(fā)明還涉及前述任一項所述的組合物在原生質體ARTP誘變中的應用。

本發(fā)明還涉及一種誘變原生質體的方法，其包括：使用本發(fā)明前述任一項所述的組合物作為原生質體的滲透壓穩(wěn)定劑。

在一個實施方案中，本發(fā)明所述的誘變原生質體的方法，其包括：

(1)提供原生質體懸浮液；

(2)將原生質體懸浮液置于本發(fā)明任一項所述的組合物中，得到待誘變原生質體樣品；

(3)對步驟(2)得到的待誘變原生質體樣品進行誘變。

在另一個實施方案中，本發(fā)明所述的誘變原生質體的方法，該方法采用常壓室溫等離子體對原生質體進行誘變。

在另一個實施方案中，本發(fā)明所述的誘變原生質體的方法，包括以下步驟：

a)用復合酶對細胞進行破壁處理，得到原生質體懸浮液；

b)將原生質體懸浮液置于所述的組合物中，調整原生質體濃度為3×10⁶～3×10⁸CFU/mL，得到待誘變原生質體樣品；

c)采用常壓室溫等離子體育種儀對待誘變原生質體樣品進行誘變，載樣量為10～30μL，作用功率為100～200w，作用時間為15～50秒。

在一個實施方案中，本發(fā)明所述的原生質體可以是細菌、真菌、放線菌、霉菌、藻類、大型真菌、植物及動物細胞的原生質體，優(yōu)選為真菌原生質體。

在一個實施方案中，本發(fā)明所述的聚乙二醇是指分子量小于2000的聚乙二醇，為常規(guī)市售試劑，其在本發(fā)明的組合物中作為保濕劑。

本發(fā)明所述的PBS緩沖液為本領域常用的緩沖液，可以根據(jù)現(xiàn)有技術中記載的方法配制。

本發(fā)明所述的Tris-HCl緩沖液為本領域常用的緩沖液，可以根據(jù)現(xiàn)有技術中記載的方法配制。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明提供的組合物，作為滲透壓穩(wěn)定劑，具有以下一個或多個優(yōu)點：

1)能夠維持細胞內外滲透壓平衡，保護原生質體形態(tài)，防止原生質體失活；

2)使用本發(fā)明提供的組合物作為滲透壓穩(wěn)定劑，原生質體樣本的存活狀態(tài)好，在進行ARTP誘變時，能夠提升誘變效果，獲得更多的突變菌株，突變效率更高，突變效率提高50％-200％。

3)本發(fā)明的誘變方法與其他對照誘變方法相比較，在同一篩選平臺下，能夠獲得更多的突變菌株，突變效率更高。

附圖說明

圖1建立ARTP誘變原生質體方法的流程。

圖2米曲霉原生質體ARTP誘變致死率曲線。

具體實施方式

下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。除非特別說明，實施例中采用的試劑、方法和設備均為本技術領域常規(guī)試劑、方法和設備。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產品。

除非特別說明，本發(fā)明實施例所用培養(yǎng)基和試驗條件為本領域常規(guī)培養(yǎng)基和試驗條件。

實施例1組合物的配制

組合物1的配制：

配方：氯化鈉0.8wt％，

甘油5wt％，

海藻糖20wt％，

余量為Tris-HCl緩沖液。

將上述配方中的氯化鈉、甘油、海藻糖用Tris-HCl緩沖液溶解，混合均勻，調節(jié)pH值至7.10，得到組合物1。

組合物1中所用Tris-HCl緩沖液的配制：將50ml 0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液與45.7ml 0.1mol/L鹽酸混勻后，加水稀釋至100ml，即得。

組合物2的配制：

配方：氯化鈉0.8wt％，

透明質酸5wt％，

甘油 5wt％，

聚乙二醇 5wt％，

余量為Tris-HCl緩沖液。

將上述配方中的氯化鈉、透明質酸、甘油、聚乙二醇用Tris-HCl緩沖液溶解，混合均勻，調節(jié)pH值至7.50，得到組合物2。

組合物2中所用Tris-HCl緩沖液的配制：將50ml 0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液與40.3ml 0.1mol/L鹽酸混勻后，加水稀釋至100ml，即得。

組合物3的配制：

配方：氯化鉀0.8wt％，

葡萄糖10wt％，

透明質酸1wt％，

海藻糖5wt％，

余量為PBS緩沖液。

將上述配方中的氯化鉀、葡萄糖、透明質酸、海藻糖用PBS緩沖液溶解，混合均勻，調節(jié)pH值至7.40，得到組合物3。

組合物3中所用PBS緩沖液的配制：將0.27g磷酸二氫鉀(KH₂PO₄)、1.42g磷酸氫二鈉(Na₂HPO₄)、8g氯化鈉(NaCl)、0.2g氯化鉀(KCl)加去離子水約800mL充分攪拌溶解，然后加入濃鹽酸調pH值至7.4，最后定容到1L，即得。

實施例2 ARTP誘變方法的建立

ARTP誘變方法的建立流程如圖1所示。

1)按照常規(guī)方法獲得真菌原生體

用剛剛萌發(fā)的真菌孢子(例如米曲霉、綠色木霉、杏鮑菇、黑曲霉等)制取原生質體。制備濃度為5×10⁸CFU/ml濃度的單孢子懸浮液，按2％接種量接種到液體培養(yǎng)基中，在搖床轉速為120rpm/min，設定溫度為32℃條件下，搖瓶培養(yǎng)15小時至大多數(shù)孢子剛好萌發(fā)時，G3砂芯漏斗濾除剩余孢子，離心收集剛剛萌發(fā)的孢子及菌絲體。加入適量復合酶溶液進行破壁處理3.5小時，然后用G2砂芯漏斗收集原生質體，制備獲得原生質體懸浮液。

1)中所述復合酶溶液的配制：將纖維素酶、果膠酶、溶壁酶按質量比3:3:1混合，用0.8mol/L的氯化鈉溶解，配制成濃度為10mg/mL的復合酶溶液，再用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌，即得。

1)中所述液體培養(yǎng)基的配方為：將蛋白胨5g，酵母浸出粉2g，葡萄糖20g，磷酸氫二鉀1g，硫酸鎂0.5g，蒸餾水1000mL，pH 6.2～6.6。

2)選擇ARTP作用時間范圍

利用ARTP(常壓室溫等離子體)誘變育種儀(型號：ARTP-IIIS型，購自無錫源清天木生物科技有限公司)對原生質體的懸浮液進行誘變處理。

本階段實驗操作時，設備電源功率、工作氣流量和等離子體發(fā)射源與載樣臺之間的距離等處理條件均依照設備出廠設置，通過處理時間不同達到誘變目的。

首先將上述1)中制備的原生質體懸液置于常規(guī)滲透壓穩(wěn)定劑(即0.8mol/L的氯化鈉溶液)中，調整原生質體濃度為3×10⁶CFU/mL-3×10⁸CFU/mL，得到待誘變原生質體樣品。吸取10μL體積的待誘變原生質體樣品滴加至ARTP的樣品臺上，進行不同處理時間的ARTP誘變，將處理后的原生質體懸液與900μL常規(guī)滲透壓穩(wěn)定劑(0.8mol/L的氯化鈉溶液)中混勻后，分別取100μL涂布于原生質體再生培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)48小時后計數(shù)，得到處理后再生菌落數(shù)。將10μL待誘變原生質體樣品(即，未經ARTP誘變的原生質體樣品)作為對照，將其與900μL常規(guī)滲透壓穩(wěn)定劑(0.8mol/L的氯化鈉溶液)中混勻，取100μL涂布于原生質體再生培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)48小時后計數(shù)，得到處理前再生菌落數(shù)。

根據(jù)公式計算ARTP誘變原生質體的致死率，以致死率為縱坐標，處理時間為橫坐標，繪制原生質體ARTP誘變致死率曲線。選擇致死率為90％左右的處理時間作為ARTP最佳處理時間。

所述再生培養(yǎng)基為含有0.8mol/L氯化鈉的適于真菌培養(yǎng)的基礎培養(yǎng)基，例如含有0.8mol/L氯化鈉溶液的PDA或者豆汁培養(yǎng)基，其配制方法可參考潘力等，醬油曲霉孢子原生質體的制備與紫外誘變育種，食品與發(fā)酵工業(yè)，2006年第32卷第8期(p1～4)。

致死率的計算公式為：

原生質體致死率＝(處理前再生菌落數(shù)－處理后再生菌落數(shù))/處理前再生菌落數(shù)

以曲霉原生質體為例，按照上述方法獲得的致死率曲線如圖2所示。對不同真菌原生質進行ARTP誘變，致死率為90％左右時，ARTP最佳處理時間約為15-50秒，根據(jù)不同樣本的誘變難易程度選取對應的誘變致死條件。

3)ARTP載樣片為ARTP設備配套專用載樣片，載樣量為10μL，作用功率為120w，工作氣流量為10SLM(Standard Liter per Minute，表示每分鐘標準升)，等離子體發(fā)射源與載樣臺之間的距離為2mm。

下述實施例3－5對不同真菌的原生質體進行誘變，考察本發(fā)明的組合物作為滲透壓穩(wěn)定劑在原生質體誘變過程中對于原生質體的影響。

實施例3-5中：

原生質體制備方法以及ARTP處理時間的選擇與實施例2基本相同。

對照方法1為原生質體紫外誘變法，該方法先制備獲得真菌原生質體后，用常規(guī)滲透壓穩(wěn)定劑(0.8mol/L的氯化鈉溶液)調整原生質體濃度為3×10⁶CFU/mL-3×10⁸CFU/mL，得到待誘變原生質體樣品。吸取5ml待誘變原生質體樣品，將其平鋪至常規(guī)培養(yǎng)皿，進行紫外誘變處理。紫外燈經過15min的預熱，紫外燈功率為10W，距離照射位置垂直距離15cm，紫外處理時間統(tǒng)一設定為20秒。

對照方法2為ARTP真菌誘變法，是將真菌孢子直接用ATTP誘變，待誘變樣品的配制與實施例2中1)所述步驟相同。ARTP作用時間統(tǒng)一設定為110秒。其他誘變條件與實施例2中3)所述條件相同。

對照方法3為ARTP原生質體誘變法，該方法先制備獲得真菌原生質體后，用常規(guī)滲透壓穩(wěn)定劑(0.8mol/L的氯化鈉溶液)調整原生質體濃度為3×10⁶CFU/mL-3×10⁸CFU/mL，得到待誘變原生質體樣品。吸取10μL待誘變原生質體樣品，將其均勻涂至載樣片上，進行ARTP誘變處理，處理時間統(tǒng)一設定為20秒。

本發(fā)明的誘變方法為ARTP原生質體誘變法，該方法先制備獲得真菌原生質體后，用本發(fā)明的組合物作為滲透壓穩(wěn)定劑，調整原生質體濃度為3×10⁶CFU/mL-3×10⁸CFU/mL，得到待誘變原生質體樣品。吸取10μL待誘變原生質體樣品，將其均勻涂至載樣片上，進行ARTP誘變處理，處理時間統(tǒng)一設定為20秒。

下述實施例3-5中所用的再生培養(yǎng)基為本行業(yè)通用真菌常規(guī)培養(yǎng)基，不做特殊要求。例如，纖維素酶選擇性平板可參照天津大學碩士論文《一株高活力纖維素分解菌的篩選及酶學性質研究》(萬先凱，2004)第1.3.1.1節(jié)中所述方法配制；漆酶選擇性平板可參照《產漆酶半知真菌Myrothecium verrucaria NF-08菌株的分離及產酶研究》(高冬妮等，林業(yè)科學，2015,51(1)：80-87)中所述方法配制；β-葡萄糖苷酶選擇性平板可參照《產β-葡萄糖苷酶真菌的篩選鑒定、純化及酶學性質分析》(陳靜等，食品科學，2013,34(5)：191-196)中所述方法配制；含有0.8mol/L的氯化鈉溶液的選擇性平板是在上述培養(yǎng)基上加入0.8mol/L的氯化鈉溶液，以起到維持滲透壓的作用。

實施例3采用米曲霉選育纖維素酶菌株

用米曲霉孢子(米曲霉為公司自有菌種資源庫保藏)制取原生質體，制備方法參照實施例2中1)所述方法，制備濃度約為3×10⁷CFU/mL的原生質體懸浮液。采用本發(fā)明的誘變方法以及對照方法1和3分別對所制得的原生質體進行誘變，得到誘變原生質體懸液。其中本發(fā)明的誘變方法中采用實施例1中制備的組合物1作為滲透壓穩(wěn)定劑。

采用對照方法2對米曲霉孢子進行誘變，得到誘變孢子懸液。

將所得誘變原生質體懸液采用0.8mol/L的氯化鈉溶液的進行稀釋，稀釋至適合平板觀察的濃度。本實施例是將所得誘變原生質體懸液置于900μL0.8mol/L的氯化鈉溶液中進行稀釋，混勻后，分別取100μL涂布于含有0.8mol/L的氯化鈉溶液的纖維素酶選擇性平板，將所得誘變孢子懸液置于900μL無菌水中混勻后，取100μL涂布于纖維素酶選擇性平板，分別置于28℃條件下培養(yǎng)48小時，獲得不同的誘變米曲霉菌株。分別對比不同誘變方法獲得的誘變效果，結果見表1。

表1不同誘變方法誘變米曲霉細胞的比較

由上表可知，針對米曲霉的菌種誘變選育纖維素酶菌株，本發(fā)明的誘變方法與其他對照誘變方法相比較，在同一篩選平臺下，能夠獲得更多的突變菌株，突變效率更高。

實施例4采用杏鮑菇選育產漆酶菌株

用杏鮑菇孢子(杏鮑菇為常規(guī)市場市售分離)制取原生質體，制備方法參照實施例2中1)所述方法，制備濃度約為3×10⁷CFU/mL的原生質體懸浮液。采用本發(fā)明的誘變方法以及對照方法1和3分別對所制得的原生質體進行誘變，得到誘變原生質體懸液。其中本發(fā)明的誘變方法中采用實施例1中制備的組合物2作為滲透壓穩(wěn)定劑。

采用對照方法2對杏鮑菇孢子進行誘變，得到誘變孢子懸液。

將所得誘變原生質體懸液采用0.8mol/L的氯化鈉溶液的進行稀釋，稀釋至適合平板觀察的濃度。本實施例是將所得誘變原生質體懸液置于900μL 0.8mol/L的氯化鈉溶液中進行稀釋，混勻后，分別取100μL涂布于含有0.8mol/L的氯化鈉溶液的漆酶選擇性平板，將所得誘變孢子懸液置于900μL無菌水中混勻后，取100μL涂布于漆酶選擇性平板，分別置于28℃條件下培養(yǎng)48小時，獲得不同的杏鮑菇誘變菌株。分別對比不同誘變方法獲得的誘變效果，結果見表2。

表2不同誘變方法誘變杏鮑菇細胞的比較

由上表可知，針對杏鮑菇的菌種誘變選育產漆酶菌株，本發(fā)明的右邊方法與其對照誘變方法相比較，在同一篩選平臺下，能夠獲得更多的突變菌株，突變效率更高。

實施例5采用黑曲霉體選育產β-葡萄糖苷酶菌株

用黑曲霉孢子(黑曲霉為公司自有菌種資源庫保藏)制取原生質體，制備方法參照實施例2中1)所述方法，制備濃度約為3×10⁷CFU/mL的原生質體懸浮液。采用本發(fā)明的誘變方法以及對照方法1和3分別對所制得的原生質體進行誘變，得到誘變原生質體懸液。其中本發(fā)明的誘變方法中采用實施例1中制備的組合物2作為滲透壓穩(wěn)定劑。

采用對照方法2對黑曲霉孢子進行誘變，得到誘變孢子懸液。

將所得誘變原生質體懸液采用0.8mol/L的氯化鈉溶液的進行稀釋，稀釋至適合平板觀察的濃度。本實施例是將所得誘變原生質體懸液置于900μL0.8mol/L的氯化鈉溶液中進行稀釋，混勻后，分別取100μL涂布于含有0.8mol/L的氯化鈉溶液的β-葡萄糖苷酶選擇性平板，將所得誘變孢子懸液置于900μL無菌水中混勻后，取100μL涂布于β-葡萄糖苷酶選擇性平板，分別置于28℃條件下培養(yǎng)48小時，獲得不同的黑曲霉誘變菌株。分別對比不同誘變方法獲得的誘變效果，結果見表3。

表3不同誘變方法誘變黑曲霉細胞的比較

由上表可知，針對黑曲霉的菌種誘變選育產β-葡萄糖苷酶菌株，本發(fā)明的誘變方法與其他對照誘變方法相比較，在同一篩選平臺下，能夠獲得更多的突變菌株，突變效率更高。