本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種禽流感病毒NA亞型多重探針組合熒光定量RT-PCR分型方法。

背景技術(shù)：

禽流感病毒分為16個HA亞型和9個NA亞型，可組合成不同的HA和NA亞型，如H5N1,H5N2,H5N5,H5N5,H5N8等。NA亞型需要通過神經(jīng)氨酸酶抑制試驗來確定，也可以通過RT-PCR擴增后測序分型。前者需要特異性的NA抗血清，后者耗時較長，而且RT-PCR擴增后通常需要利用瓊脂糖凝膠電泳顯示出目的條帶的大小，與預(yù)期產(chǎn)物大小相比較，得出結(jié)果，耗時較長；或者采用普通SYBR Green法，即通過每個組合中溶解曲線的TM值來判斷陰陽性，再通過多個組合的結(jié)果間接判斷出樣品的NA亞型。這種SYBR Green方法相比與探針法，靈敏性和特異性要低的多。而且需多次不同組合的實驗，才能最終判斷出NA亞型，不能通過一次實驗，迅速、直觀的得出結(jié)果。因此需要建立一種快速的NA分型方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的第一目的在于提供一種禽流感病毒NA亞型RT-PCR單重檢測引物組，所述禽流感病毒NA亞型RT-PCR單重檢測引物組包括一對特異性引物對和一個熒光基團標記的探針。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的禽流感病毒NA亞型RT-PCR單重檢測引物組包括針對9種NA亞型N1～N9的9對特異性引物與帶有熒光探針基團標記的探針，其中，所述特異性引物對與探針分別具有SEQ ID NO 1～27所示的序列。

即本發(fā)明的針對9種NA亞型N1～N9的9對特異性引物與帶有熒光探針基團標記的探針分別為下表N1～N9所示(分別對應(yīng)序列表SEQ ID NO 1～27)：

兼并堿基：R＝A/G,Y＝C/T,S＝G/C,H＝A/C/T,V＝A/G/C

本發(fā)明的另一目的在于提供禽流感病毒NA亞型RT-PCR多重檢測引物組，所述禽流感病毒NA亞型RT-PCR多重檢測引物組包括3組禽流感病毒NA亞型RT-PCR檢測引物組，每組禽流感病毒NA亞型RT-PCR檢測引物組包括一對特異性引物對和一個熒光基團標記的探針。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的禽流感病毒NA亞型RT-PCR多重檢測引物組，包括針對9種NA亞型N1～N9的9對特異性引物與帶有熒光探針基團標記的探針，其中，所述特異性引物對與探針分別具有SEQ ID NO 1～27所示的序列。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的禽流感病毒NA亞型RT-PCR多重檢測引物組，包括三組所述禽流感病毒NA亞型RT-PCR單重檢測引物組。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的禽流感病毒NA亞型RT-PCR多重檢測引物組中，第一組禽流感病毒NA亞型RT-PCR單重檢測引物組包括基因型N1、N4與N5禽流感病毒NA亞型RT-PCR單重檢測引物組；第二組禽流感病毒NA亞型RT-PCR單重檢測引物組包括基因型N3、N2與N6禽流感病毒NA亞型RT-PCR單重檢測引物組；第三組禽流感病毒NA亞型RT-PCR單重檢測引物組包括基因型N7、N9與N8禽流感病毒NA亞型RT-PCR單重檢測引物組，分別為下表2所示：

兼并堿基：R＝A/G,Y＝C/T,S＝G/C,H＝A/C/T,V＝A/G/C

本發(fā)明還提供了一種禽流感病毒NA亞型RT-PCR多重檢測試劑盒，包括反轉(zhuǎn)錄試劑、PCR試劑、超純水，其中，所述PCR試劑中包括如上所述的禽流感病毒NA亞型RT-PCR多重檢測引物組；

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的禽流感病毒NA亞型RT-PCR多重檢測試劑盒中，所述PCR試劑中的禽流感病毒NA亞型RT-PCR多重檢測引物組配制為：

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的禽流感病毒NA亞型RT-PCR多重檢測試劑盒中，所述PCR試劑為25μl，分別為Taqprobe 2×qPCR MasterMix 12.5μl，上下游引物(0.4μmol/L)各1μl，探針(0.4μmol/L)1μl，模板cDNA 2μl，加水至25μl。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的禽流感病毒NA亞型RT-PCR多重檢測試劑盒中，所述PCR反應(yīng)條件為95℃10min，95℃15s，60℃20s，擴增40個循環(huán)，在60℃結(jié)束開始收集熒光信號。

本發(fā)明還提供了上述禽流感病毒NA亞型RT-PCR單重檢測引物組、禽流感病毒NA亞型RT-PCR多重檢測引物組、禽流感病毒NA亞型RT-PCR多重檢測試劑盒在鑒別禽流感病毒中的應(yīng)用。

由上可見，本發(fā)明至少有以下優(yōu)點：

1、本發(fā)明針對9個NA亞型設(shè)計了Taqman探針，顯著提高了檢測的特異性；

2、本發(fā)明建立了3個多重探針熒光定量組合RT-PCR體系，每個體系中的各個成分互不干擾，且都能特異地檢測出3個不同NA亞型。

3、本發(fā)明只需要同時進行3個體系的熒光定量PCR，根據(jù)CT值就能直接判斷出NA亞型，實驗流程更加省時、方便，實驗結(jié)果更加直觀、可信。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實驗設(shè)計流程圖；

圖2為普通RT-PCR特異性試驗；

圖3為9個單重探針法熒光定量PCR體系擴增曲線；

圖4為多重探針熒光定量PCR靈敏度檢驗結(jié)果。

具體實施方式

如圖1所示，在本發(fā)明的一個實施例中給出了本發(fā)明實驗設(shè)計流程圖。

以下通過具體實施例進一步對本發(fā)明的技術(shù)方案進行說明，應(yīng)理解以下僅為本發(fā)明的示例性說明，并不用于限制本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍。

實施例1禽流感病毒NA亞型RT-PCR多重檢測

(1)引物的設(shè)計

根據(jù)實驗?zāi)康?，選擇了流行的禽流感病毒9種不同NA的基因序列，包括不同動物源性和不同年代的毒株序列。再通過每個NA亞型序列同源性的比較，選取其保守序列，設(shè)計型特異性引物和不同熒光基團標記的探針。引物、探針序列及產(chǎn)物大小如表1：

表1 9種AIV NA亞型分型引物和探針

兼并堿基：R＝A/G,Y＝C/T,S＝G/C.,H＝A/C/T,V＝A/G/C

(2)病毒核酸的提取

1、加入20μl Proteinase K于一個無菌的1.5ml離心管中。

2、樣品為雞胚尿囊液，來自于臨床分離得到的陽性禽流感病毒，經(jīng)過雞胚傳代后由實驗室凍存的禽流感病毒尿囊液。

在離心管中加入200μl樣品。(注意：如果樣品量不足200μl，用PBS或0.9％NaCl補充)

3、加入200μl Binding Buffer 5(包含5.6μg Carrier RNA(購自北京全式金公司，EasyPure Viral DNA/RNA Kit,貨號為ER201)，漩渦混合15min，室溫放置5min。

4、56℃孵育15min。

5、加入250μl無水乙醇(此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀)，渦旋混合15s，室溫放置5min。

6、將溶液和沉淀一起加入離心柱中，12000×g離心1min，棄掉流出液。

7、加入500μl Wash Buffer 5 12000×g離心1min，棄掉流出液。

8、重復步驟7一次。

9、室溫12000×g離心1min，徹底去除殘留的乙醇，在室溫靜置數(shù)分鐘徹底晾干離心柱。

10、將離心柱轉(zhuǎn)入一個新1.5ml RNase-free的離心管中，并向離心柱中央加20～50μl RNase-free Water,室溫靜置1min。

11、室溫12000×g離心1min，洗脫RNA。

12、將RNA置于-80℃保存。

13、RNA反轉(zhuǎn)錄

RNA反轉(zhuǎn)錄使用諾唯贊生物公司的HiScript Reverse Transcriptase試劑盒。

反應(yīng)體系如下：2μl 5×qRT SuperMix(包括Buffer、dNTP、HiScipt、Reverse Trancriptase、RNase inhibitor、Random primers/Oligo dT Primer mix)，模板RNA(Total RNA)1pg～500ng,加入RNase free ddH₂O至10μl。反應(yīng)程序：25℃10min，50℃30min，85℃5min。得到的cDNA可立即用于PCR反應(yīng)，或在-20℃保存。

(3)普通RT-PCR驗證引物的特異性

取1μl上述獲得的cDNA作為模板進行PCR擴增，體系如下：12.5μl 2×Taq Plus Master Mix，引物F、R各1μl(0.4μmol/L)，加入ddH₂O至25μl。反應(yīng)程序：預(yù)變性溫度為94℃5min，然后按94℃30s，55℃30s，72℃30s，進行35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。

取PCR擴增產(chǎn)物10μl，點樣于1.5％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL溴化乙錠)，以100bp Ladder marker作為標準參照，電泳后可見普通RT-PCR檢測N1～N9流感毒株均出現(xiàn)100bp-200bp左右的型特異條帶，目的條帶大小正確。結(jié)果表明設(shè)計的針對各個NA亞型的引物具有良好的特異性，結(jié)果見圖2，其中M：100bp Marker；1：N1 AIV；2：N2 AIV；3：N3 AIV；4：N4 AIV；5：N5 AIV；6：N6 AIV；7：N7 AIV；8：N8 AIV；9：N9 AIV.。

(4)單重探針熒光定量PCR體系的建立

本實驗所采用的熒光定量PCR反應(yīng)體系為25μl，分別為Taq probe 2×qPCR MasterMix 12.5μl(鎮(zhèn)江愛必夢生物技術(shù)有限公司，貨號：MasterMix-ps)，按照表1中的探針和引物進行反應(yīng)，上下游引物(0.4μmol/L)各1μl，探針(0.4μmol/L)1μl，模板cDNA 2μl，加水至25μl。LightCycler Nano(Roche)實時熒光定量PCR儀反應(yīng)參數(shù)：95℃10min，95℃15s，60℃20s，擴增40個循環(huán)，在60℃結(jié)束開始收集熒光信號。單重探針熒光定量PCR體系擴增曲線見圖3(a～i)，其中圖3a～圖3i分別為引物組N1～N9PCR體系擴增曲線。

結(jié)果表明，9個單重探針法熒光定量PCR體系具有良好的特異性、靈敏性和重復性。

(5)3個多重探針熒光定量體系的建立及優(yōu)化

根據(jù)已經(jīng)建立好的單重探針法熒光定量PCR體系和3種不同熒光基團，將9個體系分成3組，每個組中包含3種不同熒光基團標記的探針。經(jīng)過反復摸索，最終確定3個組合，見表3：

表3 3個多重探針熒光定量體系

(6)多重探針熒光定量PCR特異性檢驗結(jié)果

尿囊液樣本來自于臨床分離得到的陽性禽流感病毒，經(jīng)過雞胚傳代后由實驗室凍存的禽流感病毒尿囊液，其他幾種禽類病原體如禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)，傳染性法氏囊病病毒(IBDV)，新城疫病毒(NDV，Lasota毒株)和細菌菌株(沙門氏菌和大腸桿菌)作為對照。其中禽流感病毒的NA 基因已經(jīng)經(jīng)過基因測序確定其NA亞型。使用全式金公司的EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取尿囊液樣本中的病毒核酸，提取20個N1 AIV陽性樣本，30個N2 AIV陽性樣本，5個N3 AIV陽性樣本，2個N4 AIV陽性樣本，2個N5 AIV陽性樣本,20個N6 AIV陽性樣本,2個N7 AIV陽性樣本,30個N8 AIV陽性樣本,20個N9 AIV陽性樣本和其他禽類病原體核酸。使用特異性引物與Taq Man探針，完成多重熒光定量RT-PCR實驗。結(jié)果表明，本方法具有良好的特異性，各個NA亞型均鑒定正確，且無交叉反應(yīng)，其他禽類病原體均未被檢測出，結(jié)果見表4。

表4 多重熒光定量PCR特異性試驗結(jié)果

(7)多重探針熒光定量PCR靈敏度檢驗結(jié)果

本方法是用不同EID₅₀的尿囊液提取核酸，進行多重熒光定量PT-PCR靈敏度試驗，從而得到用該方法能檢測出的最低EID₅₀。靈敏度檢驗結(jié)果見表5,靈敏度檢驗擴增圖見圖4，表明該方法對不同亞型禽流感病毒具有較高的靈敏度。

表5多重熒光定量PCR靈敏度試驗結(jié)果

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 揚州大學

<120> 禽流感病毒NA亞型多重探針組合熒光定量RT-PCR分型方法

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgtgtgtgca grgayaaytg sc 22

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggaccrcaac tscctgthcc rtcv 24

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccacgcccca atgatggaac aggcagttg 29

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttctatcatc cccagtgaca caaac 25

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tgggaaccaa acaagtgtgc atagcatggt c 31

<210> 7

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<213> 人工序列

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agcagttgct tcgatggaaa g 21

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<213> 人工序列

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cattgacatt cagactcttg agttc 25

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列

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atgaccggga acgacaatga tgcgagtgg 29

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<212> DNA

<213> 人工序列

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atggtgtttg gatagggagg acaaa 25

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caccatttga atccttgtct gtcga 25

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<213> 人工序列

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agcttggaat ccagaagcgg ttttgagatg gt 32

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agaacacaag agtcttcgtg tgttt 25

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<213> 人工序列

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agagtgttat tgggtaatga cggacggtcc a 31

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aagggtgcag gatgtttgct ctaag 25

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<213> 人工序列

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aaggcacaac actcagaggg cgacatgcaa at 32

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tcaatatgtt tggctgatcc cttta 25

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tggcacatgt gcagttgtaa tgactgacgg 30

<210> 22

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<213> 人工序列

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gccctgataa gctggccact 20

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<213> 人工序列

<400> 26

tgcattgttg tttggtcctg atata 25

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<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

atcaccgccc acagtgtaca acagcagggt 30