本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，尤其涉及一種高效擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

自然殺傷細(xì)胞(Natural Killer cell，NK cell)是T細(xì)胞、B細(xì)胞之外的第三大類(lèi)淋巴細(xì)胞，是人體免疫系統(tǒng)的第一道防線，在機(jī)體抗病毒感染和抗腫瘤免疫中起重要作用。NK細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞無(wú)MHC限制性，可以在無(wú)預(yù)先致敏的情況下殺傷腫瘤細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞。同時(shí)，還可以產(chǎn)生一系列的細(xì)胞因子進(jìn)而對(duì)機(jī)體的獲得性免疫進(jìn)行調(diào)節(jié)，是連接機(jī)體固有免疫和特異性免疫的橋梁。NK細(xì)胞由于具有直接殺傷活性和免疫調(diào)節(jié)活性，而一度成為免疫細(xì)胞過(guò)繼療法的新熱點(diǎn)。此外，還有越來(lái)越多的報(bào)道將原代NK細(xì)胞或NK細(xì)胞系進(jìn)行基因改造以提高其殺傷腫瘤細(xì)胞的特異性和活性，進(jìn)而進(jìn)行過(guò)繼免疫治療，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中均取得了良好的效果?？梢?jiàn)，NK細(xì)胞在腫瘤的生物治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。

NK細(xì)胞的殺傷功能及療效與其數(shù)量直接相關(guān)，然而NK細(xì)胞在外周血中比例小，約占外周血PBMC的5％～10％，傳統(tǒng)的使用的野生型IL-2擴(kuò)增NK細(xì)胞的方案，不僅NK擴(kuò)增倍數(shù)有限，端粒酶活性降低，而且擴(kuò)增后NK細(xì)胞的各種活化受體或CD16分子表達(dá)丟失導(dǎo)致NK細(xì)胞毒性減弱；最近的研究發(fā)現(xiàn)，野生型IL-2還可以擴(kuò)增Treg細(xì)胞，而Treg細(xì)胞能夠顯著抑制NK細(xì)胞的殺傷作用，從而影響NK細(xì)胞的臨床療效。盡管?chē)?guó)外已有商品化的NK細(xì)胞分離試劑盒，利用這些試劑，通過(guò)FACS分選或MACS法純化可獲得90％以上純度的NK細(xì)胞。但操作復(fù)雜，費(fèi)用昂貴，且高度純化的NK細(xì)胞不能在體外大量擴(kuò)增，難以滿足臨床試驗(yàn)的需求。之前有文獻(xiàn)報(bào)道，采用K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染跨膜IL-21和CD137復(fù)合體與體外PBMC共培養(yǎng)擴(kuò)增NK細(xì)胞，使得NK細(xì)胞數(shù)量、純度和活性顯著增強(qiáng)。然而，腫瘤微環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜的綜合系統(tǒng)，在腫瘤微環(huán)境中存在有大量的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞，這些細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)因子。用僅轉(zhuǎn)染跨膜IL-21和CD137復(fù)合體的K562細(xì)胞激活擴(kuò)增NK細(xì)胞雖然對(duì)腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的殺傷能力，但是對(duì)腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞相關(guān)巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞的殺傷能力卻很弱。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種利用人IL-2突變體聯(lián)合K562細(xì)胞高效擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法。該方法操作簡(jiǎn)單，擴(kuò)增的NK細(xì)胞具有純度高、數(shù)量大、殺傷活性好等優(yōu)點(diǎn)，適合于NK細(xì)胞大規(guī)模制備，為NK細(xì)胞過(guò)繼性免疫治療應(yīng)用于臨床打下了良好的基礎(chǔ)。

本發(fā)明的一種利用人IL-2突變體聯(lián)合K562細(xì)胞高效擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法，包括：

(1)使用慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將CD8α-白介素21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的基因同時(shí)轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞；載體中含有病毒啟動(dòng)子和選擇標(biāo)記基因；

(2)當(dāng)外源表達(dá)載體進(jìn)入宿主細(xì)胞后，激活啟動(dòng)子，體外培養(yǎng)K562細(xì)胞一段時(shí)間后，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分選，獲得穩(wěn)定表達(dá)跨膜蛋白CD8α-IL-21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的K562工程細(xì)胞；

(3)將穩(wěn)定表達(dá)CD8α-IL-21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的K562工程細(xì)胞經(jīng)過(guò)γ射線照射滅活，作為NK細(xì)胞的滋養(yǎng)細(xì)胞；

(4)分離并提取外周血單個(gè)核細(xì)胞(即PBMC)并計(jì)數(shù)，按一定的比例(K562:PBMC)加入滅活的K562滋養(yǎng)細(xì)胞，在IL-2突變體協(xié)同作用下，與PBMC共培養(yǎng)2～3周，即可得到純度較高的NK細(xì)胞。

其中，步驟(1)所述的CD8α為在細(xì)胞膜上表達(dá)的膜蛋白，CD8α基因連接IL-21基因后使得IL-21表達(dá)在細(xì)胞膜上，成為跨膜蛋白；而CD19、CD137L、CD86、和CD64為膜蛋白。

步驟(2)所述的純化后的K562工程細(xì)胞其跨膜CD8α-IL-21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的表達(dá)量在85％以上。

步驟(3)所述的滅活K562工程細(xì)胞的γ射線劑量為100Gy，輻照時(shí)間為20～30min。

步驟(4)所述的IL-2突變體是通過(guò)對(duì)氨基酸定點(diǎn)替代，將其IL2α受體結(jié)合點(diǎn)突變，突變的位點(diǎn)在IL-2的37，38，41，42，43，44，45，61，62，65，68和72氨基酸位點(diǎn)。不僅能夠其降低誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能，同時(shí)還保留了其對(duì)NK細(xì)胞的免疫活性，可用于刺激免疫系統(tǒng)，從而提高其臨床療效和應(yīng)用范圍。

步驟(4)所述的PBMC重懸密度為1～2×10⁶，白介素-2突變體的使用濃度為50～100ng/ml，加入K562滋養(yǎng)細(xì)胞與PBMC的比例為0.1：1～1：1，作為更佳選擇，上述方法中K562:PBMC＝0.1:1或0.2:1。

本發(fā)明的方法以穩(wěn)定高表達(dá)膜蛋白CD19、CD137L、CD86、CD64及擴(kuò)膜蛋白IL-21的K562工程細(xì)胞為滋養(yǎng)細(xì)胞，以白介素-2突變體為NK細(xì)胞擴(kuò)增因子，以GT-T551培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在添加適量自體血漿的條件下，體外培養(yǎng)2～3周，成功制備了純度高、體外殺傷活性好的NK細(xì)胞，該NK細(xì)胞高表達(dá)激活受體NKG2D，同時(shí)低表達(dá)抑制性受體CD158α。

本發(fā)明通過(guò)基因工程的方法，構(gòu)建基因修飾的K562工程細(xì)胞，使其可以同時(shí)高表達(dá)膜蛋白CD19、CD64、CD86、CD137L和跨膜蛋白IL-21。將滅活的K562工程細(xì)胞在低濃度IL-2突變體存在的條件下與體外分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng)，不僅可以高效地?cái)U(kuò)增人NK細(xì)胞，而且還可以增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷功能。在K562細(xì)胞中轉(zhuǎn)染CD19有助于激活NK細(xì)胞識(shí)別并殺傷腫瘤微環(huán)境中的B細(xì)胞；而CD137L為T(mén)NF超家族的新成員，與其配體結(jié)合后介導(dǎo)的共刺激信號(hào)，可促進(jìn)T細(xì)胞和NK細(xì)胞增殖；轉(zhuǎn)染CD86有助于提升NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞、微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞的殺傷作用；CD64分布于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞表面，參與調(diào)理吞噬作用及抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，轉(zhuǎn)染CD64可以增強(qiáng)NK細(xì)胞的ADCC效應(yīng)。而培養(yǎng)過(guò)程中使用的人白細(xì)胞介素II突變體是通過(guò)對(duì)氨基酸定點(diǎn)替代，將其IL-2α受體結(jié)合點(diǎn)突變，不僅能夠其降低誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能，同時(shí)還保留了其對(duì)NK細(xì)胞的增殖活性，可用于刺激免疫系統(tǒng)，從而提高其臨床療效和應(yīng)用范圍。較傳統(tǒng)方法制備的NK細(xì)胞，該方法具有操作簡(jiǎn)單，擴(kuò)增的NK細(xì)胞具有純度高、數(shù)量大、殺傷活性好等優(yōu)點(diǎn)，適合于NK細(xì)胞大規(guī)模制備，為NK細(xì)胞過(guò)繼性免疫治療應(yīng)用于臨床打下了良好的基礎(chǔ)。本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果：

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例一中CD19、CD137L、CD86、IL-21在K562基因工程細(xì)胞中的表達(dá)情況；

圖2為實(shí)施例二中NK細(xì)胞體外擴(kuò)增線性圖，顯示NK細(xì)胞在轉(zhuǎn)染跨膜IL-21、CD19、CD137L、CD64和CD86的K562細(xì)胞與低劑量的IL-2突變體共同作用下線性增長(zhǎng)，以該K562與低劑量的野生型IL-2擴(kuò)增的NK細(xì)胞作為對(duì)照；

圖3為實(shí)施例二中在K562工程細(xì)胞和IL-2突變體共同作用下，體外培養(yǎng)21天時(shí)NK細(xì)胞的純度，以該K562工程細(xì)胞與低劑量的傳統(tǒng)IL-2擴(kuò)增的NK細(xì)胞作為對(duì)照；

圖4為實(shí)施例二中在K562工程細(xì)胞和IL-2突變體共同作用下，體外培養(yǎng)21天時(shí)NK細(xì)胞表面Fc受體CD16的表達(dá)情況，以該K562工程細(xì)胞與低劑量的傳統(tǒng)白介素-2擴(kuò)增的NK細(xì)胞作為對(duì)照；

圖5為實(shí)施例二中在K562工程細(xì)胞和IL-2突變體共同作用下，體外培養(yǎng)21天時(shí)NK細(xì)胞表面激活受體NKG2D的表達(dá)情況，以該K562工程細(xì)胞與低劑量的傳統(tǒng)IL-2擴(kuò)增的NK細(xì)胞作為對(duì)照；

圖6為實(shí)施例二中在K562工程細(xì)胞和IL-2突變體共同作用下，體外培養(yǎng)21天時(shí)NK細(xì)胞表面抑制性受體CD158α的表達(dá)情況，以該K562工程細(xì)胞與低劑量的野生型IL-2擴(kuò)增的NK細(xì)胞作為對(duì)照；

圖7為實(shí)施例三中在K562工程細(xì)胞和白介素-2突變體共同作用下，體外培養(yǎng)21天后NK細(xì)胞對(duì)K562和MCF-7的殺傷作用統(tǒng)計(jì)對(duì)比結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)和具體的介紹，以使更好的理解本發(fā)明，但是下述實(shí)施例并不限制本發(fā)明范圍。

實(shí)施例一

按照本發(fā)明的方法，以以下具體步驟擴(kuò)增培養(yǎng)NK細(xì)胞：

(1)使用慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將CD8α-白介素21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的基因同時(shí)轉(zhuǎn)染到K562細(xì)胞，CD8α為在細(xì)胞膜上表達(dá)的膜蛋白，CD8α基因連接白介素21基因后使得白介素21表達(dá)在細(xì)胞膜上，成為跨膜蛋白；而CD19、CD137L、CD86、和CD64為膜蛋白，載體中含有病毒啟動(dòng)子和選擇標(biāo)記基因；當(dāng)外源表達(dá)載體進(jìn)入宿主細(xì)胞后，激活啟動(dòng)子，經(jīng)培養(yǎng)一段時(shí)間后，K562細(xì)胞膜上可表達(dá)跨膜IL-21、CD19、CD137L、CD86、和CD64。將上述細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分選，獲得穩(wěn)定表達(dá)CD8αIL-21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的K562細(xì)胞，作為NK細(xì)胞的滋養(yǎng)細(xì)胞；

(2)將穩(wěn)定表達(dá)CD8α-IL-21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的K562細(xì)胞用含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，密度調(diào)至1×10⁷cells/mL，100Gy的γ射線照射20min，滅活該K562細(xì)胞，再用生理鹽水1500rpm離心5min，洗滌3次；

(3)抽取人外周血50ml，用淋巴分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，并用生理鹽水1800rpm離心5min洗滌分離出來(lái)的PBMC，重復(fù)3次，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；

(4)用GT-T551培養(yǎng)基重懸PBMC，調(diào)節(jié)密度至1～2×10⁶cells/mL，把細(xì)胞轉(zhuǎn)移至一T75的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，按0.2：1(K562:PBMC)的比例加入滅活的K562滋養(yǎng)細(xì)胞，并加入IL-2突變體100ng/mL及自體血漿10％(v/v)，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(5)細(xì)胞培養(yǎng)至第3天或第4天，根據(jù)細(xì)胞密度和激活情況，往培養(yǎng)瓶中補(bǔ)充新鮮GT-T551完全培養(yǎng)基(含100ng/mLIL-2突變體及10％自體血漿)；

(6)細(xì)胞培養(yǎng)至第7天進(jìn)入擴(kuò)增階段，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)密度和體積，每隔2～3天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳瓶培養(yǎng)，并補(bǔ)充新鮮含100ng/mLIL-2突變體的GT-T551培養(yǎng)基及1％～5％的自體血漿，培養(yǎng)至第21天，收獲NK細(xì)胞。

對(duì)上述步驟中構(gòu)建的K562工程細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)，分析其表面CD19、CD137L、CD86和IL-21的表達(dá)情況，如圖1所示。圖1顯示構(gòu)建的K562細(xì)胞表面CD19的表達(dá)量為88.70％、CD137L的表達(dá)量為96.99％、CD86的表達(dá)量為98.30％及IL-21的表達(dá)量為88.89％，而且隨著K562細(xì)胞體外傳代次數(shù)增加，其表面膜蛋白的表達(dá)沒(méi)有降低，由此說(shuō)明構(gòu)建的K562細(xì)胞可穩(wěn)定高表達(dá)跨膜蛋白CD19、CD137L、CD86和IL-21。

依照以上步驟體外培養(yǎng)NK細(xì)胞，分別在第0、3、6、9、12、15、18和21天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制NK細(xì)胞擴(kuò)增曲線，如圖2所示，而利用傳統(tǒng)IL-2和K562工程細(xì)胞擴(kuò)增的NK細(xì)胞作為對(duì)照。圖2顯示，在上述方法中所述K562滋養(yǎng)細(xì)胞與IL-2突變體的共同作用下，NK細(xì)胞數(shù)量顯著增加。NK細(xì)胞在前9天為激活并緩慢擴(kuò)增階段，12天開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，21天時(shí)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到8×10⁹，明顯高于對(duì)照組的4.5×10⁹。

實(shí)施例二

將實(shí)施例1所制備的NK細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)，而利用傳統(tǒng)IL-2和K562工程細(xì)胞擴(kuò)增的NK細(xì)胞作為對(duì)照。分析NK細(xì)胞占總細(xì)胞的比例(如圖3所示)、NK細(xì)胞表面Fc受體CD16的表達(dá)情況(如圖4所示)、NK細(xì)胞表面激活受體NKG2D的表達(dá)情況(如圖5所示)以及NK細(xì)胞表面抑制性受體CD158α的表達(dá)情況(如圖6所示)。圖3、圖4、圖5及圖6顯示，利用本發(fā)明所述方法制備的NK細(xì)胞，NK細(xì)胞的純度(即CD3^-CD56⁺的比例)為97.8％，明顯高于對(duì)照組的86.1％；而利用本發(fā)明所述方法制備的NK細(xì)胞表面CD16的表達(dá)為88.7％，也明顯高于對(duì)照組的76.3％；另外，利用本發(fā)明所述方法制備的NK細(xì)胞表面激活受體的表達(dá)為91.7％，明顯高于對(duì)照組的78.1％，同時(shí)抑制受體的表達(dá)為10.1％，明顯低于對(duì)照組的30.8％。

實(shí)施例三

按照以下操作進(jìn)行NK細(xì)胞殺傷率的測(cè)定：

(1)靶細(xì)胞準(zhǔn)備：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的K562和MCF-7細(xì)胞，1000rpm離心5min，細(xì)胞計(jì)數(shù)；用RPMI-1640完全培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為2×10⁵/mL，備用；

(2)效應(yīng)細(xì)胞準(zhǔn)備：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的NK細(xì)胞，1500rpm離心5min，細(xì)胞計(jì)數(shù)并用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至2×10⁶/mL，備用；

(3)靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞共培養(yǎng)：在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入10000個(gè)靶細(xì)胞(即50uL)，按1：1、5：1和10：1的比例加入效應(yīng)細(xì)胞(即NK細(xì)胞)，至終體積100uL/孔；并設(shè)置空白對(duì)照、靶細(xì)胞對(duì)照孔及相應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔，每孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，將細(xì)胞培養(yǎng)板放至37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～12小時(shí)；

(4)每孔加入10uL CCK-8，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱孵育4～6小時(shí)；

(5)在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。

按下述公式計(jì)算其殺傷率：

殺傷率(％)＝{1—(實(shí)驗(yàn)組OD值-相應(yīng)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組OD值)/(對(duì)照靶細(xì)胞組OD值-空白組OD值)}x100％，不同效靶比條件下，NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的殺傷率如圖7所示。圖7顯示，利用本發(fā)明所述方法制備的NK細(xì)胞在體外對(duì)K562細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞都有很明顯的殺傷作用，當(dāng)效靶比為10：1時(shí)，殺傷率分別為89.97％和80.5％。

綜合上述實(shí)施例本領(lǐng)域人員能夠知曉，本發(fā)明的擴(kuò)增方法具備以下優(yōu)點(diǎn)：

1.本發(fā)明方法成本低，操作簡(jiǎn)單，無(wú)需第二次刺激，滋養(yǎng)細(xì)胞使用比例低，制備的NK細(xì)胞數(shù)量大、純度高、殺傷活性好，可用于NK細(xì)胞的大規(guī)模生產(chǎn)；

2.本發(fā)明方法使用的IL-2突變體可減少對(duì)Treg細(xì)胞的誘導(dǎo)和擴(kuò)增，從而降低Treg細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性的抑制作用，可有效地增強(qiáng)NK細(xì)胞的臨床療效；

3.本發(fā)明所制備的NK細(xì)胞，能夠高表達(dá)激活受體NKG2D、Fc受體CD16并且低表達(dá)抑制性受體CD158α，具有應(yīng)用其做后續(xù)相關(guān)臨床應(yīng)用的潛力。

以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。