本發(fā)明屬于有機合成、醫(yī)藥領域，具體涉及一種雙黃酮-銅配合物及其制備方法和應用。

背景技術：

雙黃酮類化合物是裸子植物特有的化學成分，例如銀杏、卷柏等，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等生物活性。其中，穗花杉雙黃酮(Amentoflavone，Ame)是雙黃酮類化合物中較為常見的一種，其結(jié)構式如下所示：

Sun等研究發(fā)現(xiàn)穗花杉雙黃酮通過激活hPPARγ來提高抗癌基因的表達，從而達到抑制乳腺癌細胞和宮頸癌細胞的效果[Lee E.,Shin S.,Lee J.etal.Cytotoxic activities of amentoflavone against human breast and cervical cancers are mediated by increasing of pten expression levels due to peroxisome proliferator-activated receptor γactivation[J].Bulletin of the Korean Chemical Society,2012,33(7):2219-2223.]。Chen等研究發(fā)現(xiàn)穗花杉雙黃酮通過抑制因子NF-kappaB的活性，阻礙血管的生成和癌細胞的新陳代謝，達到抑制腫瘤細胞生長的目的[Chen J.H.,Chen W.L.,Liu Y.C.Amentoflavone induces anti-angiogenic and anti-metastatic effects through suppression of NF-kappa B activation in MCF-7cells[J].Anticancer Research,2015,35(12):6685-6693.]。Lee等研究發(fā)現(xiàn)，穗花杉雙黃酮可以抑制由紫外輻射引起的金屬蛋白酶的表達，從而起到抗氧化、防輻射的作用[Lee C.W.,Na Y.,Park N.,etal.Amentoflavone inhibits UVB-induced matrix metalloproteinase-1expression through the modulation of AP-1 mponents in normal human fibroblasts[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2012,166:1137-1147.]。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)穗花杉雙黃酮和銀杏黃素具有一定的抗氧化活性，去除DPPH自由基的能力較強[Zhang Y.P.,Shi S.Y.,Wang Y.X.,etal.Target-guided isolation and purification of antioxidants from Selaginella sinensis by offline coupling of DPPH-HPLC and HSCCC experiments[J].Journal of Chromatography B,2011,879:191-196.]。Li等研究表明，穗花杉雙黃酮具有抗氧化活性，可有效清除OH^-·，O₂^-·，DPPH·，ABTS⁺·等自由基，并可以保護DNA免受OH^-·引起的氧化損傷[Li X.C.,Wang L.,Han W.J.,etal.Amentoflavone protects against hydroxyl radical-induced DNA damage via antioxidant mechanism[J].Turkish Journal of Biochemistry-Turk Biyokimya Dergisi,2014,39(1):30-36.]。

中藥配位化學表明，微量元素和有機化合物反應生成的配合物存在著配合平衡，所以可以呈現(xiàn)出原來成分的生物活性；又由于微量元素間、有機成分間、配合物間以及它們相互間的協(xié)同和拮抗作用可以減弱或增強原有各成分的生物活性，也可能產(chǎn)生新的生物活性[曹治權.中藥藥效的物質(zhì)基礎和作用機理研究新思路(一)-中藥中化學物種形態(tài)和生物活性關系的研究[J].上海中醫(yī)藥大學學報,2000,14(1):36-39.]。例如，Zhou等研究發(fā)現(xiàn)槲皮素稀土配合物清除O₂^-·的能力均強于槲皮素，槲皮素稀土配合物可以抑制多種腫瘤，且抗腫瘤活性均強于槲皮素，其中配合物對膀胱腫瘤細胞具有較強的抑制作用，而槲皮素無此作用[Zhou J.,Wang L.F.,Wang J.Y.,etal.Synthesis,characterization,antioxidative and antitumor activities of solid quercetin rare earth(III)complexes[J].Journal of Inorganic Biochemistry,2001,83:41-48.]。

然而，到目前為止，有關雙黃酮配合物的合成及其生物活性的研究未見報道。

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種穗花杉雙黃酮-銅配合物，滿足抗腫瘤和抗氧化活性藥物的使用需求。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述雙黃酮-銅配合物的制備方法。本發(fā)明還有一目的是提供雙黃酮-銅配合物的應用。

技術方案：為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術方案為：

雙黃酮-銅配合物，結(jié)構式如下：

X為NO₃^-或Cl^-。

一種制備所述雙黃酮-銅配合物的方法：將銅鹽用醇溶解后加入到雙黃酮的醇溶液中，控制pH為5-7，加熱攪拌，反應2-5h，有沉淀產(chǎn)生，將沉淀過濾，用醇和水洗滌后用二甲亞砜作為溶劑重結(jié)晶，干燥，得雙黃酮-銅配合物。

所用雙黃酮為穗花杉雙黃酮，但不局限于穗花杉雙黃酮，泛指具有5-OH和4-C＝O或5”-OH和4”-C＝O的雙黃酮類化合物。

所用銅鹽為硝酸銅、氯化銅等醇溶性銅鹽。

所用溶劑為包括乙醇、甲醇及不同濃度的甲醇、乙醇水溶液等。

用堿的醇溶液調(diào)節(jié)pH值，所用堿包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水、乙醇鈉、甲醇鈉等常用堿類。

反應時，加熱溫度為30-50℃，反應時間為2-5h。

溶液中雙黃酮與銅離子的摩爾比為2-2.5：1。

重結(jié)晶所用溶劑為二甲亞砜，干燥方法為冷凍干燥、低溫真空干燥等。

所述雙黃酮-銅配合物在制備抗腫瘤藥物和/或抗氧化藥物中的應用。

有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明首次合成得到了穗花杉雙黃酮-銅配合物，采用MTT法研究了Ame-Cu配合物的抗腫瘤活性，結(jié)果表明，Ame-Cu配合物抑制肝癌細胞(HepG2)和宮頸癌細胞(HeLa)的能力強于Ame本身，紫外-可見吸收光譜、熒光光譜和粘度法表明Ame-Cu配合物抗腫瘤活性的機理可能是配合物與嵌入式插入DNA，引起細胞凋亡。鄰苯三酚自氧化法、ABTS法顯示Ame-Cu配合物清除自由基能力強于Ame本身，說明配合物的抗氧化活性強于Ame；有利于進一步開發(fā)雙黃酮類化合物，為新藥研究提供依據(jù)，有利于人類健康事業(yè)的發(fā)展。

附圖說明

圖1是Ame和Ame-Cu配合物的紅外光譜譜圖；

圖2是Ame和Ame-Cu配合物的紫外-可見吸收光譜譜圖；

圖3是Ame質(zhì)譜圖；

圖4是Ame-Cu配合物的質(zhì)譜圖；

圖5是Ame和Ame-Cu配合物對HepG2細胞的抑制作用結(jié)果圖；

圖6是Ame和Ame-Cu配合物對HeLa細胞的抑制作用結(jié)果圖；

圖7是fDNA對Ame紫外-可見吸收光譜的影響結(jié)果圖；

圖8是fDNA對Ame-Cu配合物紫外-可見吸收光譜的影響結(jié)果圖；

圖9是Ame對fDNA-EB體系熒光發(fā)射光譜的影響結(jié)果圖；

圖10是Ame-Cu配合物對fDNA-EB體系熒光發(fā)射光譜的影響結(jié)果圖；

圖11是Ame和Ame-Cu配合物對fDNA溶液粘度的影響結(jié)果圖；

圖12是Ame對鄰苯三酚自氧化速率的影響結(jié)果圖；

圖13是Ame-Cu配合物對鄰苯三酚自氧化速率的影響結(jié)果圖；

圖14是Ame對ABTS⁺·自由清除能力結(jié)果圖；

圖15是Ame-Cu配合物對ABTS⁺·自由清除能力結(jié)果圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。

實施例1

精確稱取53.8mg Ame于圓底燒瓶中，用5mL乙醇溶解，精確稱量三水合硝酸銅12.1mg，用5mL乙醇溶解，將硝酸銅溶液滴加到Ame溶液中，向反應溶液中滴加乙醇-氨水(V/V,3:1)溶液，調(diào)節(jié)pH為6，保持30℃反應4-5h，產(chǎn)生沉淀，過濾，依次用乙醇、水洗滌，DMSO重結(jié)晶，冷凍干燥得Ame-Cu配合物。

實施例2

精確稱取53.8mg Ame于圓底燒瓶中，用5mL90％的乙醇溶解，精確稱量三水合硝酸銅12.1mg，用5mL90％的乙醇溶解，將硝酸銅溶液滴加到Ame溶液中，向反應溶液中滴加乙醇-乙醇鈉溶液，調(diào)節(jié)pH為5，保持30℃反應4-5h，產(chǎn)生沉淀，過濾，依次用乙醇、水洗滌，DMSO重結(jié)晶，冷凍干燥得Ame-Cu配合物。

實施例3

精確稱取53.8mg Ame于圓底燒瓶中，用5mL甲醇溶解，精確稱量三水合硝酸銅12.1mg，用5mL甲醇溶解，將硝酸銅溶液滴加到Ame溶液中，向反應溶液中滴加甲醇-甲醇鈉溶液，調(diào)節(jié)pH為7，保持40℃反應3-4h，產(chǎn)生沉淀，過濾，依次用甲醇、水洗滌，DMSO重結(jié)晶，冷凍干燥得Ame-Cu配合物。

實施例4

精確稱取53.8mg Ame于圓底燒瓶中，用5mL85％的甲醇溶解，精確稱量三水合硝酸銅12.1mg，用5mL85％的甲醇溶解，將硝酸銅溶液滴加到Ame溶液中，向反應溶液中滴加甲醇-甲醇鈉溶液，調(diào)節(jié)pH為7，保持50℃反應2-3h，產(chǎn)生沉淀，過濾，依次用甲醇、水洗滌，DMSO重結(jié)晶，冷凍干燥得Ame-Cu配合物。

實施例5

精確稱取53.8mg Ame于圓底燒瓶中，用5mL乙醇溶解，精確稱量二水合氯化銅8.5mg，用5mL乙醇溶解，將氯化銅溶液滴加到Ame溶液中，向反應溶液中滴加乙醇-氨水(V/V,3:1)溶液，調(diào)節(jié)pH為6，保持30℃反應4-5h，產(chǎn)生沉淀，過濾，依次用乙醇、水洗滌，DMSO重結(jié)晶，冷凍干燥得Ame-Cu配合物。

實施例6

精確稱取53.8mg Ame于圓底燒瓶中，用5mL90％的乙醇溶解，精確稱量二水合氯化銅8.5mg，用5mL90％的乙醇溶解，將氯化銅溶液滴加到Ame溶液中，向反應溶液中滴加乙醇-乙醇鈉溶液，調(diào)節(jié)pH為5，保持30℃反應4-5h，產(chǎn)生沉淀，過濾，依次用乙醇、水洗滌，DMSO重結(jié)晶，冷凍干燥得Ame-Cu配合物。

實施例7

精確稱取53.8mg Ame于圓底燒瓶中，用5mL甲醇溶解，精確稱量二水合氯化銅8.5mg，用5mL甲醇溶解，將氯化銅溶液滴加到Ame溶液中，向反應溶液中滴加甲醇-甲醇鈉溶液，調(diào)節(jié)pH為7，保持40℃反應3-4h，產(chǎn)生沉淀，過濾，依次用甲醇、水洗滌，DMSO重結(jié)晶，冷凍干燥得Ame-Cu配合物。

實施例8

精確稱取53.8mg Ame于圓底燒瓶中，用5mL85％的甲醇溶解，精確稱量二水合氯化銅8.5mg，用5mL85％的甲醇溶解，將氯化銅溶液滴加到Ame溶液中，向反應溶液中滴加甲醇-甲醇鈉溶液，調(diào)節(jié)pH為7，保持50℃反應2-3h，產(chǎn)生沉淀，過濾，依次用甲醇、水洗滌，DMSO重結(jié)晶，冷凍干燥得Ame-Cu配合物。

實施例9

對實施例1-8制備的產(chǎn)物進行表征，Ame和Ame-Cu配合物的紅外光譜圖如圖1所示。由圖可以看出，Ame在2800-3500cm^-1有寬的吸收，這是締和羥基伸縮振動峰，因為Ame分子中5-OH和4-C＝O之間，5”-OH和4”-C＝O之間形成了分子內(nèi)氫鍵。而Ame-Cu配合物中此處的吸收均變窄，且在3407cm^-1左右的峰形變得尖銳，說明形成配合物后，分子內(nèi)氫鍵遭到破壞；Ame中1657cm^-1處的強峰為羰基的伸縮振動引起的，是羰基的特征吸收峰，形成配合物后，此處吸收峰向低波數(shù)移動，移動到1630cm^-1，說明羰基參與了配位；配合物在622cm^-1之間產(chǎn)生一吸收峰，這是Cu-O伸縮振動引起的，是氧原子參與配位的有力證明。因此，可以推測，Ame中的羰基、羥基參與了配位，而最可能的配位點為5-OH，4-C＝O，5”-OH和4”-C＝O。

Ame和Ame-Cu配合物的紫外-可見吸收光譜如圖2所示，Ame在337nm(帶I)和270nm(帶II)處有兩個特征吸收峰，這是黃酮類化合物的特征吸收，帶I和帶II分別對應著桂皮酰系統(tǒng)和苯甲酰系統(tǒng)的紫外吸收，均為π-π*的躍遷引起的。Ame-Cu配合物在375-450nm之間產(chǎn)生吸收平臺，為帶I紅移所致，說明桂皮酰系統(tǒng)參與了配位，帶II雖然位置沒有明顯變化，但是吸收強度相對降低，且在298nm處還產(chǎn)生了新的吸收峰，這些現(xiàn)象表明共屬于桂皮酰系統(tǒng)和苯甲酰系統(tǒng)的羰基參與了配位，配位后，共軛體系增大，電子躍遷所需要能量降低，π-π*更易發(fā)生，故帶I發(fā)生紅移。而4-C＝O更易發(fā)生n-π*躍遷，故在298nm處產(chǎn)生一新峰。可以推斷，Cu²⁺與Ame形成配合物的位點為5-OH，4-C＝O，5”-OH，4”-C＝O。

在正離子模式下，分別對Ame及Ame-Cu配合物作了質(zhì)譜分析，并根據(jù)質(zhì)譜模擬得到譜圖上分子離子峰對應的離子結(jié)構式，并由此推斷出Ame-Cu的結(jié)構。

圖3為Ame在正離子模式的質(zhì)譜圖，準分子離子峰m/z 539.0920歸屬為[Ame+H]⁺。圖4a為Ame-Cu配合物的質(zhì)譜圖，由圖中可以看出，Ame-Cu配合物主要準分子離子峰為帶兩個正電荷的離子峰，且均帶一個正電荷，分別為m/z678.0256和m/z 756.0403。圖4b為離子峰m/z 678.0256的同位素質(zhì)譜圖，可以看到離子峰m/z 678.0256的同位素峰為m/z 679.0284，m/z 680.0243，m/z 681.0268，m/z 682.0297，相鄰離子峰的分子量分別相差1.0028，0.9959，1.0025，1.0029，從而證實，該離子峰帶一個正電荷。由紅外光譜和紫外-可見光譜可知，Ame與Cu²⁺形成配合物的配位點為5-OH，4-C＝O，5”-OH，4”-C＝O，由于重結(jié)晶和溶解配合物的溶劑為DMSO，DMSO含有氧原子和硫原子，具有強的的配位能力，且較難電離，故配合物中可能含有DMSO，由此推測m/z 678.0256歸屬為[Cu(Ame-H)(DMSO)]⁺，元素組成為C₃₂H₂₃O₁₁CuS，與m/z 678.0256可能的元素組成一致(圖4c)。同時，采用質(zhì)譜模擬軟件對[Cu(Ame-H)(DMSO)]⁺進行模擬，得到模擬質(zhì)譜圖，如圖4d所示。由圖可以看出[Cu(Ame-H)(DMSO)]⁺的同位素離子峰分別為m/z 678.0252，m/z 679.0285，m/z 680.0234，m/z 681.0267，m/z 682.0301，與m/z 678.0256的同位素質(zhì)譜峰匹配度很高，因此，可以證實，離子峰m/z 678.0256對應的離子為[Cu(Ame-H)(DMSO)]⁺。同理，離子峰m/z 826.0636(圖4e)對應的離子為[Cu(Ame-H)(DMSO)₂]⁺。綜上所述，Ame與Cu²⁺形成了1:1的配合物，紅外光譜和紫外-可見光譜證實Ame與Cu²⁺形成配合物的配位點為5-OH，4-C＝O，5”-OH和4”-C＝O，由于5”-OH的活性比5-OH的高，因此，Ame與Cu²⁺形成的配合物的配位點為5”-OH和4”-C＝O可能性最大，故[Cu(Ame-H)(DMSO)]⁺和[Cu(Ame-H)(DMSO)₂]⁺最有可能的結(jié)構式如下所示：

可以發(fā)現(xiàn)離子[Cu(Ame-H)(DMSO)]⁺和[Cu(Ame-H)(DMSO)₂]⁺結(jié)構相似，區(qū)別僅是含有不同數(shù)量的DMSO分子，其原因是離子[Cu(Ame-H)(DMSO)₂]⁺在儀器電壓作用下失去一個DMSO，因此，配合物離子的結(jié)構為[Cu(Ame-H)(DMSO)₂]⁺。此外，由于試驗中金屬鹽為硝酸鹽或鹽酸鹽，故配合物中含有硝酸根或氯離子，因此，Ame-Cu配合物結(jié)構式如下所示：

X為NO₃^-或Cl^-。

實施例10

采用MTT法研究了Ame和Ame-Cu配合物的抗腫瘤活性，過程如下：

(1)將HepG2、HeLa細胞株懸浮液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加100μL，(1×10⁵個/mL)，37℃，于5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；

(2)培養(yǎng)24h后，棄上清液，加入100μL預先稀釋好的樣品，每個濃度設10個復孔，于5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；同時設置對照孔(DMSO、細胞液、MTT)、調(diào)零孔(培養(yǎng)基、DMSO、MTT)；

(3)培養(yǎng)36h后，棄上清液，加入100μL含MTT(5mg/mL)的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4h；

(4)4h后小心去除上清，每孔加200μL DMSO，在恒溫振蕩器中充分振蕩15min，酶標儀595nm處測定吸光度值，通過OD值計算樣品對HepG2、HeLa細胞的抑制率，運用改良Karber公式算出半數(shù)抑制濃度IC₅₀值。

lgIC₅₀＝Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4) (公式2)

式中，IR為抑制率，OD₀為對照組的吸光度，OD₁為樣品組的吸光度，Xm為lg(最大劑量)，I為lg(最大劑量/相鄰劑量)，P為陽性反應率之和，Pm為最大陽性反應率，Pn為最小陽性反應率。

結(jié)果如圖5-6所示。實驗發(fā)現(xiàn)Ame-Cu配合物能有效抑制肝癌細胞HepG2和宮頸癌細胞HeLa的生長，IC₅₀值分別為5.638和5.247μmol·L^-1，比Ame的IC₅₀值小(Ame的IC₅₀值分別為13.633和8.040μmol·L^-1)，說明Ame-Cu配合物抗腫瘤活性較好，且強于Ame。采用紫外-可見光譜法、熒光光譜法和粘度法研究了Ame和Ame-Cu配合物與鯡魚精DNA(fDNA)的相互作用，以進一步揭示抗腫瘤活性的機理，所得圖譜如圖7-11所示，結(jié)果表明，Ame和Ame-Cu配合物與fDNA的相互作用為嵌插模式，且配合物與fDNA作用能力均強于Ame。由此可以推測，Ame及其配合物的抗腫瘤活性的機理可能是Ame或其配合物進入細胞內(nèi)部，與DNA鏈發(fā)生嵌插作用，引起細胞凋亡。由于配合物與DNA的相互作用強于Ame，故其抗腫瘤活性也強于Ame。

實施例11

采用鄰苯三酚自氧化法、ABTS法研究了Ame和Ame-Cu配合物清除自由基能力，步驟如下：

(1)鄰苯三酚自氧化法

鄰苯三酚自氧化速率V₀的測定：25℃下，在10mL樣品管中加入2mL的Tris-HCl緩沖液(pH＝8.20)，并加入100μL DMSO作為對照，加入0.8mL蒸餾水后，再加入濃度為2mmol·L^-1的鄰苯三酚溶液0.2mL，混勻后倒入比色皿中，以純水為空白，測定322nm處的吸光度，每10s記錄一次A值，共反應4min。以t為橫坐標，A為縱坐標進行線性回歸，其直線斜率為V₀，測定三次，求平均值。

加入樣品后鄰苯三酚自氧化速率V₁的測定：25℃下，在10mL樣品管中加入2mL的Tris-HCl緩沖液(pH＝8.2)，并加入100μL不同濃度的樣品DMSO溶液，加入0.8mL蒸餾水后，再加入濃度為2mmol·L^-1的鄰苯三酚溶液0.2mL，混勻后倒入比色皿中，以雙蒸水為空白，測定322nm處的吸光度，每10s記錄一次A值，共反應4min。以t為橫坐標，A為縱坐標進行線性回歸，其直線斜率為V₁，測定三次，求平均值。根據(jù)公式3計算自由基清除率。

SR(％)＝(1-v₁/v0)×100％ (公式3)

(2)ABTS法

空白樣清除ABTS⁺·自由基離子能力測定：25℃下，在10mL樣品管中加入2.9mL的ABTS⁺·自由基離子工作液，并加入100μL DMSO，反應5min后，測量紫外-可見光譜，并記錄730nm處的吸收強度A₀。

樣品清除ABTS⁺·自由基離子能力測定：25℃下，在10mL樣品管中加入2.9ml的ABTS⁺·自由基離子工作液，并加入100μL不同濃度的樣品DMSO溶液，反應5min后，測量紫外-可見光譜，并記錄730nm處的吸收強度A₁。根據(jù)公式4計算ABTS⁺·自由基離子清除率。

SR(％)＝(1-A₁/A₀)×100％ (公式4)

如圖12-15所示。鄰苯三酚自氧化法結(jié)果表明Ame和Ame-Cu配合物清除O₂^-·自由基IC₅₀為23.273μmol·L^-1和4.5683μmol·L^-1，可以發(fā)現(xiàn)Ame-Cu配合物清除O₂^-·自由基的能力明顯強于Ame。

Ame和Ame-Cu配合物對ABTS⁺·自由基的清除能力具有濃度依賴性，在一定的范圍內(nèi)，清除率與濃度呈線性關系。本發(fā)明繪制了清除率與濃度(c)的曲線，得到相應的線性方程，并計算得到最大半抑制濃度(IC₅₀值)，Ame和Ame-Cu配合物清除ABTS⁺·自由基的IC₅₀值分別為20.703和6.310μmol·L^-1，可以看出，Ame-Cu配合物清除ABTS⁺·自由基的能力明顯強于Ame。

本發(fā)明首次合成得到了穗花杉雙黃酮-銅配合物，并對其抗腫瘤和抗氧化活性進行研究，發(fā)現(xiàn)，配合物的抗腫瘤、抗氧化活性均強于雙黃酮本身，開辟了雙黃酮類配合物的研究工作，為新藥研發(fā)提供了重要的參考價值。