本發(fā)明屬于刺莧的鑒定方法，具體涉及一種刺莧的實時熒光PCR鑒定方法。

背景技術：

入侵生物的傳播途徑主要有3種：一種是有意識引進，即人為引進具有一定經濟價值、實用價值的物種，最后演變?yōu)槿肭址N；二是無意識引進，即隨著貿易、運輸、旅游等活動而傳入的物種演變而成的入侵種；三是自然入侵，即通過物種自身的擴散能力或者借助自然條件而實現(xiàn)的入侵。據(jù)悉，中國外來入侵植物中約50％是由于檢疫人員疏漏，隨貿易品、運輸工具等方式引進，即無意識引進。但隨著貿易全球化，人為活動范圍的擴大，進出口貿易量的與日俱增，無疑對檢疫工作提出了更高的要求。而檢疫工作中面臨的業(yè)務量大、鑒定專家匱乏也是實際存在的困難。

據(jù)調查研究顯示，中國外來入侵植物約500種，主要集中在菊科(Compositae)、豆科(Leguminosae)、禾本科(Gramineae)等幾個科中，優(yōu)勢屬中較為突出的是莧屬(Amaranthus)。莧屬植物作為糧食、蔬菜、觀賞以及染料植物，對生態(tài)環(huán)境、人類活動等產生積極影響，但該屬的刺莧(A.spinosus)、反枝莧(A.retroflexus L.)、長芒莧(A.palmeri S.Watson)等屬于雜草，具有感化潛力，特別是刺莧，對生長在其周圍植物的萌發(fā)和光合速率都會有一定的影響，降低多種作物的生長和產量。

目前植物物種鑒定通常以傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定為主，若植物以種子、果實等形態(tài)出現(xiàn)，或形態(tài)學信息不足等都會使鑒定面臨困難。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明提供一種刺莧的實時熒光PCR鑒定方法，本發(fā)明利用分子生物學手段，通過檢測物種DNA序列中特異性的片段，解決形態(tài)學鑒定的不足。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

一種刺莧的實時熒光PCR鑒定方法，該鑒定方法包括以下步驟：

步驟1，刺莧DNA提?。?/p>

取樣本2g，液氮研磨至粉末狀，取0.2g研磨后的粉末狀樣品用試劑盒提取DNA，將提取到的DNA溶解在50μL去離子水中，將得到的DNA樣品置于-20℃冰箱保存、備用；

步驟2，特異性引物和探針的設計與合成：

基于葉綠體的PsbA基因，設計選取具有刺莧特異性的引物和探針，所述特異性引物和探針分別為：

F：TAAAGGAGCAATGCCGTTTTCTT，

R：CAGTATTCAGAACTTGCCTTTGA，

P：FAM-TTTTTTTTTTAATTCAAAATGGATTCAAGAT–Eclipse，

步驟3，TaqMan實時熒光PCR：

將步驟2設計選取的引物和探針對步驟1中的DNA樣品進行熒光PCR擴增反應，通過熒光PCR擴增后得到Ct值，通過Ct值對樣品是否含有刺莧進行判定。

所設計的引物和探針對刺莧具有物種的特異性，能用于刺莧的鑒定。

所述步驟3中實時熒光PCR擴增反應體系如下：10μL Premix Ex Taq，10pmol/μL的上游引物0.4μL，10pmol/μL的下游引物0.4μL，10pmol/μL的探針0.4μl，取上述提取得到DNA液2μL，用去離子水補足體積至20μL，應用熒光定量PCR儀進行反應，反應程序為(1)95℃，10sec；(2)95℃，5sec；62℃，23sec；40個循環(huán)，所述實時熒光PCR均重復三次，取三次結果的平均Ct值，當平均Ct值＞35.0或無Ct值，則判定為陰性，當Ct值≤35.0，則判定為陽性。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：

①本發(fā)明利用分子生物學手段，通過檢測物種DNA序列中特異性的片段，有效解決了形態(tài)學鑒定不足，也為快速檢疫鑒定攜帶或夾帶的植物樣本或種子提供有效的解決方案；②本發(fā)明實時熒光PCR方法是基于傳統(tǒng)PCR法的基礎上，設計具有物種特異性的引物和探針，通過特異性引物的擴增，鑒定該物種是否為目標物種，同時結合具有熒光標識的探針實現(xiàn)同步擴增同步檢測，提高檢測效率。

具體實施方式

本實施例刺莧的實時熒光PCR鑒定方法，該鑒定方法包括以下步驟：

步驟1，采集樣品：

供試植物樣品包括莧科莧屬7種(包含刺莧的7個不同地理種和長芒莧的2個不同地理種)和莧科非莧屬8種，以及莧科外植物3種共25個樣品見表1，在野外及田間采集相關植物樣品，每種樣品均采集3株，將采集的樣品分別放入塑料樣品保鮮袋中，帶回實驗室后置于-70℃冰箱保存、備用；

表1供試樣品

步驟2，樣本DNA提?。?/p>

將所述步驟1備用的樣品中的每株植物取2g葉片，分別用液氮研磨后混勻，得到樣品的液氮混合物，取0.2g樣品的液氮混合物，采用試劑盒提取DNA，將提取得到的DNA溶解在50μL去離子水中，置于-20℃冰箱保存、備用；

步驟3，特異性引物和探針的設計：

引物和探針的設計是基于葉綠體的PsbA基因，通過Primer 5軟件設計選取了具有刺莧特異性的引物和探針ASP-1見表2，本發(fā)明所用的TaqMan實時熒光PCR引物和探針由杭州擎科梓熙生物技術有限公司合成，

表2引物和探針序列

步驟4，TaqMan實時熒光PCR：

實時熒光PCR反應體系如下：10μL Premix Ex Taq(Takara，中國)，上游引物(10pmol/μL)0.4μL，下游引物(10pmol/μL)0.4μL，探針(10pmol/μL)0.4μL，取上述提取得到DNA液2μL，用去離子水補足體積至20μL。應用熒光定量PCR儀lightcycle 480(Roche，美國)進行反應，反應程序為(1)95℃，10sec；(2)95℃，5sec；58℃-62℃，23sec；40個循環(huán)。所述實時熒光PCR均重復三次，取三次結果的平均Ct值，當平均Ct值＞35.0或無Ct值，則判定為陰性，當Ct值≤35.0，則判定為陽性。

作為優(yōu)選，本實施例步驟2中試劑盒為QIAGE N DNeasy Plant Mini Kit(美國)試劑盒。

作為進一步優(yōu)選，本實施例熒光定量PCR儀為lightcycle 480。

本實施例在特異性和靈敏度驗證實驗中，熒光PCR反應都重復三次，表示結果的Ct值表示每個反應管內熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數(shù)，取三次結果的平均值；SD表示標準差。

本實施例的結果與分析：

1.引物和探針的特異性驗證

本實施例中設計的引物和探針ASP-1經特異性驗證后顯示，引物和探針ASP-1在不同的擴增溫度下，有不同的特異性，結果顯示62℃時表現(xiàn)的特異性最佳，此時，只有目標物種刺莧得到陽性擴增，見表3，引物和探針組合ASP-1具有較高的刺莧特異性。

表3引物探針特異性驗證

注：*為熒光PCR擴增溫度；—:Ct值低于檢測限。

2.引物和探針靈敏度驗證

選取了衢州刺莧作為代表，對其DNA進行2倍梯度稀釋，檢測引物和探針ASP-1的靈敏度。結果顯示如表4，當DNA濃度稀釋至0.03ng/μL時，ASP-1得到的Ct值為32.2，當濃度降至0.02ng/μL時，Ct值已經低于檢測限。該引物和探針的靈敏度為0.03ng/μL左右。

表4引物和探針靈敏度驗證

注：*用Nanodrop 1000(Thermo)實際測得濃度，該DNA抽提自衢州刺莧；

**2倍梯度稀釋推算得到的濃度；—:Ct值低于檢測限。

3.總結

本發(fā)明在葉綠體PsbA基因上設計了適合刺莧鑒定的引物和探針序列，建立了實時熒光PCR檢測技術。該方法對刺莧的檢測靈敏度可達到0.03ng/μL，足以滿足日常鑒定的檢測需求。同時該方法，從DNA抽提到獲取實時熒光PCR結果，整個過程可在3h內完成，能達到快速鑒定入侵雜草刺莧的目的。熒光PCR方法適用于植物任何生長周期和生長部位，不受實驗材料存活狀態(tài)的影響；同時可對疑似目標植物殘體進行快速準確鑒定，彌補了形態(tài)學鑒定方法的不足，可作為形態(tài)鑒定的輔助方法，可有效的對刺莧植物進行鑒定。

盡管上述實施例已對本發(fā)明作出具體描述，但是對于本領域的普通技術人員來說，應該理解為可以在不脫離本發(fā)明的精神以及范圍之內基于本發(fā)明公開的內容進行修改或改進，這些修改和改進都在本發(fā)明的精神以及范圍之內。