本發(fā)明涉及基因工程及微生物發(fā)酵，尤其是涉及高產(chǎn)多糖絮凝劑的地衣芽孢桿菌基因工程菌及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferases,Gtfs)是一系列參與催化雙糖、聚糖和糖復(fù)合物中糖鏈合成的一類酶，主要負(fù)責(zé)將活性供體的單糖轉(zhuǎn)移到糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及核酸分子上，完成糖基化反應(yīng)。已有研究表明糖基轉(zhuǎn)移酶基因(epsA)是多糖生物合成過(guò)程中的重要基因，作用是決定多糖的鏈長(zhǎng)并參與多糖的轉(zhuǎn)運(yùn)。(J Bacteriol,1999,181(11):3599-3605；Proc Natl Acad Sci U S A,2001,98(20):11621-11626)。

微生物絮凝劑(Microbial flocculant,MBF)是微生物分泌的能夠使懸浮液中的固體顆粒、菌體、細(xì)胞和膠狀物絮凝沉淀的大分子化合物，主要成分有多糖、糖蛋白、蛋白質(zhì)、纖維素和DNA等。微生物絮凝劑具有安全、高效、可生物降解和對(duì)環(huán)境無(wú)污染等優(yōu)勢(shì)，且能產(chǎn)生絮凝劑的微生物種類多、生長(zhǎng)快、易于采用工程手段而實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。因此微生物絮凝劑的開發(fā)前景十分看好。目前，多糖生物絮凝劑已經(jīng)應(yīng)用于去除紡織印染廢水中的色素(Colloids and Surfaces B-Biointerfaces,2005,44(4):179-186.)，還可以去除工業(yè)廢水中的重金屬離子和其它懸浮污染物(Bioresource Technology,2007,98(2):361-367.)。然而多糖絮凝劑產(chǎn)量低、成本較高，制約著它的大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。目前，對(duì)于培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、生長(zhǎng)因子等外部因素影響多糖絮凝劑合成的報(bào)道已經(jīng)很多(Process Biochemistry,2014,49(4:576-582；Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2014,116:257-264)。而從地衣芽孢桿菌的遺傳及生理學(xué)角度對(duì)其多糖絮凝劑合成量影響的報(bào)道甚是少見(jiàn)。由于多糖絮凝劑結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且大多數(shù)針對(duì)多糖的研究并不關(guān)注絮凝活性，有關(guān)多糖絮凝劑代謝途徑的研究還較少，而通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)改造菌株提高多糖絮凝劑產(chǎn)量的報(bào)道幾乎沒(méi)有，因此通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)優(yōu)良菌株，進(jìn)一步提高多糖絮凝劑活性及產(chǎn)量，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及社會(huì)意義。

本申請(qǐng)人在中國(guó)專利200910111262.4提供了地衣芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，該微生物已于2009年01月14日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCCNo.2876。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中多糖絮凝劑絮凝活性不高、調(diào)控機(jī)理不明等問(wèn)題，提供糖基轉(zhuǎn)移酶基因epsA。

本發(fā)明的第二目的在于提供地衣芽孢桿菌基因工程菌。

本發(fā)明的第三目的在于提供地衣芽孢桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法。

本發(fā)明的第四目的在于提供地衣芽孢桿菌基因工程菌在制備多糖絮凝劑中的應(yīng)用。

所述糖基轉(zhuǎn)移酶基因epsA利用PCR擴(kuò)增克隆多糖絮凝劑合成途徑獲得，所述糖基轉(zhuǎn)移酶基因epsA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示。

所述地衣芽孢桿菌基因工程菌是將所述糖基轉(zhuǎn)移酶基因epsA片段連接到表達(dá)載體上，然后利用電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到地衣芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)中，通過(guò)抗性篩選獲得地衣芽孢桿菌基因工程菌。所述地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)已于2009年01月14日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCCNo.2876；所述表達(dá)載體為游離載體，優(yōu)選表達(dá)載體PHY300PLK-PamyL-TTamyL，所述表達(dá)載體的啟動(dòng)子為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因的啟動(dòng)子PamyL。

所述地衣芽孢桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法包括以下步驟：

1)設(shè)計(jì)PCR引物擴(kuò)增糖基轉(zhuǎn)移酶基因epsA；

2)將擴(kuò)增得到的目的基因插入到PHY300PLK-PamyL-TTamyL組成型啟動(dòng)子PamyL下游多克隆位點(diǎn)，得到PHY300-epsA過(guò)表達(dá)質(zhì)粒；

3)然后將PHY300-epsA過(guò)表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入到E.coli DH5α中，以備擴(kuò)增后電轉(zhuǎn)化；

4)將經(jīng)提取、濃縮后的PHY300-epsA過(guò)表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌，37℃復(fù)蘇5h后，涂布四環(huán)素抗性平板，再在37℃培養(yǎng)12h，篩選轉(zhuǎn)化子；

5)轉(zhuǎn)化子經(jīng)質(zhì)粒提取后，利用PCR和雙酶切進(jìn)行驗(yàn)證，從而獲得過(guò)表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶基因的地衣芽孢桿菌重組菌HN301-3。

所述地衣芽孢桿菌基因工程菌在制備多糖絮凝劑中應(yīng)用。

所述地衣芽孢桿菌基因工程菌制備多糖絮凝劑的方法包括以下步驟：

1)刮一環(huán)地衣芽孢桿菌重組菌HN301-3接種于液體種子培養(yǎng)基中，35～37℃，200r/min培養(yǎng)12～16h，制備種子培養(yǎng)液；

2)按體積比，以4％的接種量接種于多糖絮凝劑發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30～40℃，150～300r/min條件下培養(yǎng)50～60h，進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)多糖絮凝劑實(shí)驗(yàn)；

3)將所得發(fā)酵液離心收集上清液，再用乙醇法沉淀，沉淀溶解于水后冷凍真空干燥即得。

在步驟2)中，所述按體積比，以4％的接種量接種于多糖絮凝劑發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37℃，200r/min的條件下培養(yǎng)48～56h。

在步驟3)中，所述乙醇沉淀法是用三倍體積的乙醇提取，4℃靜置12h，離心的速度為6000～8000rpm，離心時(shí)間為10～15min，離心溫度為4℃。

epsA基因是編碼一系列糖基轉(zhuǎn)移酶的eps基因簇上的重要基因，在不同底物特異性的糖基轉(zhuǎn)移酶作用下，地衣芽孢桿菌中多糖合成的步驟基本包括：葡萄糖的磷酸化、糖核苷酸的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)、多糖重復(fù)單元的合成、修飾、聚合和轉(zhuǎn)運(yùn)。epsA會(huì)參與多糖重復(fù)單元的聚合，并決定多糖的鏈長(zhǎng)，之后負(fù)責(zé)將合成的多糖轉(zhuǎn)移到胞外。基于以上理論分析，過(guò)表達(dá)epsA基因，能夠增大多糖絮凝劑合成途徑的代謝流量，有利于提高多糖絮凝劑的產(chǎn)量，降低成本。

本發(fā)明的技術(shù)效果在于：本發(fā)明提供了能提高多糖絮凝劑產(chǎn)量的的基因工程菌的構(gòu)建方法。該方法包括以下過(guò)程：克隆多糖絮凝劑合成途徑的關(guān)鍵酶糖基轉(zhuǎn)移酶基因(epsA)，利用大腸桿菌－芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒構(gòu)建重組表達(dá)載體。通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到地衣芽孢桿菌，通過(guò)四環(huán)素篩選轉(zhuǎn)化子，然后通過(guò)PCR和雙酶切對(duì)對(duì)基因工程菌進(jìn)行驗(yàn)證(如圖1)，從而構(gòu)建了地衣芽孢桿菌重組菌HN301-3，本發(fā)明構(gòu)建的地衣芽孢桿菌重組菌HN301-3比出發(fā)菌株的多糖絮凝劑產(chǎn)量提高了23.17％(如圖2)?？赏糜诙嗵切跄齽┑墓I(yè)化生產(chǎn)，提高產(chǎn)量，降低成本。

附圖說(shuō)明

圖1為重組表達(dá)質(zhì)粒PHY300-epsA的PCR和酶切驗(yàn)證結(jié)果圖，其中泳道1,2:Kpn I單酶切重組質(zhì)粒PHY300-epsA；泳道3,4：Kpn I和Spe I雙酶切重組質(zhì)粒PHY300-epsA，泳道5,6:PCR擴(kuò)增epsA。

圖2為地衣芽孢桿菌CGMCC 2876及其重組菌HN301-3多糖絮凝劑絮凝活性和產(chǎn)量比較圖。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好理解本發(fā)明。然而本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅限于說(shuō)明本發(fā)明。

實(shí)施例1：重組表達(dá)載體PHY300-epsA的構(gòu)建

設(shè)計(jì)PCR引物，用于擴(kuò)增epsA基因片段。

上下游引物分別為：

上游引物：GCCGGTACCATGAAAGAAAATATTG(下劃線為KpnI酶切位點(diǎn))

下游引物：GAAACTAGTCATATAGCCAAGCGGC(下劃線為SpeI酶切位點(diǎn))

以Bacillus licheniformis CGMCC 2876基因組DNA為模板，進(jìn)行如下PCR程序：(1)94℃，5min；(2)94℃,30s；(3)55℃，30s；(4)72℃，1min，步驟(2)～(4)重復(fù)35個(gè)循環(huán)；(5)72℃，10min，4℃保存。

PCR反應(yīng)體系如表1所示。

表1

將PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體PHY300PLK-PamyL-TTamyL分別用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Spe I雙酶切，回收后，將PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體以(3︰1)～(5︰1)的比例用T4DNA連接酶在16℃連接12h構(gòu)建重組表達(dá)載體PHY300-epsA。

實(shí)施例2:地衣芽孢桿菌基因工程菌HN301-3的構(gòu)建

將PHY300-epsA過(guò)表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)提取及濃縮后，電擊轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌，37℃復(fù)蘇5h后，涂布四環(huán)素抗性平板，再在37℃培養(yǎng)12h，篩選轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子經(jīng)質(zhì)粒提取后，利用PCR及雙酶切進(jìn)行驗(yàn)證(如圖1)。從而獲得過(guò)表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶基因epsA的地衣芽孢桿菌工程菌HN301-3。

電轉(zhuǎn)化具體步驟如下：

地衣芽孢桿菌感受態(tài)的制備：

(1)在50mL LB培養(yǎng)基中接種一環(huán)B.licheniformis,37℃，200r/min過(guò)夜培養(yǎng)12h；

(2)取過(guò)夜培養(yǎng)液1mL接入50mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，于37℃，200r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中后期，直到細(xì)胞OD₆₀₀達(dá)到0.85～0.95；

(3)細(xì)胞冰浴30min，停止生長(zhǎng)后，(取預(yù)先預(yù)冷的50mL干凈離心管，加入40mL停止生長(zhǎng)的培養(yǎng)液)再于4℃以6 000r/min離心收獲細(xì)胞；

(4)用冰冷(0℃冰水浴)的EP緩沖液40mL懸浮細(xì)胞四次(每次都在0℃冰水浴中晃動(dòng)，使沉淀懸浮，可用槍輕輕吹吸)，并最終將細(xì)胞懸浮于1mL EP緩沖液中,使細(xì)胞濃度達(dá)到(1～1.3)×10¹⁰CFU mL^-1；

(5)將感受態(tài)細(xì)胞分裝于1.5mL離心管(預(yù)冷過(guò)的)中，每管100μL，再直接進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)或-70℃保存感受態(tài)；

地衣芽孢桿菌的電轉(zhuǎn)：

(1)將感受態(tài)細(xì)胞和1～5μg質(zhì)?；旌衔镛D(zhuǎn)移到冰冷的0.1cm間隙的電擊池中；

(2)以1800V、5ms脈沖轉(zhuǎn)化；

(3)迅速往電擊池中加入1mL復(fù)蘇培養(yǎng)基，將菌懸液回收到5mL離心管中，于37℃，200r/min培養(yǎng)5h；

(4)將菌液涂布在抗性平板上，于37℃培養(yǎng)直到平板上出現(xiàn)菌落。

實(shí)施例3:利用地衣芽孢桿菌及其基因工程菌發(fā)酵制備多糖絮凝劑

將地衣芽孢桿菌CGMCC 2876出發(fā)菌株和實(shí)施例2所述基因工程菌接種于液體種子培養(yǎng)基中，37℃，200r/min培養(yǎng)16h，制備種子培養(yǎng)液，以4％(V/V)的接種量接種于多糖絮凝劑發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，200r/min培養(yǎng)，進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)多糖絮凝劑實(shí)驗(yàn)。56h后分別測(cè)定發(fā)酵液絮凝活性及多糖絮凝劑產(chǎn)量(如圖2)。epsA基因過(guò)表達(dá)重組基因工程菌多糖絮凝劑的粗提產(chǎn)量為9.29g/L，較原菌株粗提產(chǎn)量7.51g/L提高了23.17％。

生物絮凝劑的絮凝活性可采用以下方法測(cè)定:

稱取高嶺土粉末0.2g與50mL刻度試管中，依次加入2.5mLCaCl₂溶液(10g/L)和1mL待測(cè)液，蒸餾水加至與刻度線平齊。充分混合后，迅速置于比色皿中，靜置5min后，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)550nm下測(cè)定吸光度。以蒸餾水做空白測(cè)定。計(jì)算公式如下:

絮凝活性(U/mL)＝(B-A)/B×100×D

式中，A：待測(cè)樣品的OD₅₅₀值，B：空白培養(yǎng)基的OD₅₅₀值，D：發(fā)酵液稀釋倍數(shù)。

生物絮凝劑的提取純化方法：

(1)取10mL發(fā)酵液8000rpm離心5min，除菌體，收集上清液，重復(fù)操作兩次。

(2)上清液中加入3倍體積的無(wú)水乙醇，4℃條件下靜置12h。

(3)8000rpm離心10min，棄上清液，加10mL去離子水溶解。上清液中加入3倍體積的無(wú)水乙醇，4℃條件下靜置12h后，離心棄上清液。

(4)冷凍真空干燥。

序列表

<110> 廈門大學(xué)

<120> 高產(chǎn)多糖絮凝劑的地衣芽孢桿菌基因工程菌及其構(gòu)建方法

<130> 2016

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 753

<212> DNA

<213> Bacillus Licheniformis

<400> 1

atgaaagaaa atattgattt tagagaactg attgcaatct tgcgaaaaag aacggttctt 60

attctcgttt tgacaatagg tgtaacattg acgaccggaa tcattcagtt ctatgtgctg 120

acacctgtct atcaggcatc gacgcagatt ttggtgcatc aagtaggaga gaaaaaaggg 180

agcgccacgt acagcgatat tcaaatcaac ctgcaataca cgcggacatt ccaagcgctt 240

ctgaagaacc cggtgatttt ggagcaagtc aagagagagc ttgatttacc ttactctgcc 300

ggccggttgg gtgaaaaaat cgcaacgagc agtgaaagcg aatcagagat tattaacatt 360

acagttcaag acgaaaatca gaaacgggca gccgatatag cgaacacgct aacagcggtg 420

ctcaaaaaag agattaagca aatcatgaac accgatcgga taaccgtcct ttcaaaagcc 480

gacatcgtcg attcgccgac tcctgtcaga ccgaattaca aaatgaatat tttgctggca 540

ttcggcgccg caataatgac cggaatcgct ttggcgttct ttttggattt tatcgatgat 600

acggttgcaa ggccgtctca agtcgaaaag gaagcgggat ttatttattt gggaagtatt 660

gagcaaatga agcatacaaa aagtctgttt cgcggagacc ccgatatgaa tatccgtgtg 720

aaagcaggaa ggagtgagcc gcttggctat tag 753

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 上游引物

<400> 2

gccggtacca tgaaagaaaa tattg 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 下游引物

<400> 3

gaaactagtc atatagccaa gcggc 25