本發(fā)明涉及基因變異檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種人類腫瘤基因變異聯(lián)合檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：肺癌是世界上常見的癌癥，發(fā)病率和死亡率居各癌癥之首。2002年全世界肺癌的新發(fā)病率為138萬，近一半發(fā)生在發(fā)展中國家。據(jù)2008年我國衛(wèi)生部的統(tǒng)計，肺癌死亡率為30.83/10萬。肺癌已經(jīng)成為發(fā)病率和死亡率第一位的惡性腫瘤，肺癌的死亡例數(shù)遠(yuǎn)大于乳腺癌和前列腺癌死亡例數(shù)的總和。肺癌從組織病理學(xué)上可以分為兩大類：小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌約占所有肺癌病例數(shù)85％，包括鱗癌、腺癌和大細(xì)胞癌。發(fā)達(dá)國家的肺癌患者的5年生存率為15％～20％，而我國肺癌患者5年生存率僅為10％。其主要原因是大多數(shù)肺癌由于缺乏高靈敏度的基因突變檢測和確診技術(shù)，以及相匹配的科學(xué)治療方案，從而失去了治療的最佳時機(jī)。因此，肺癌的基因突變檢測和診斷技術(shù)，對于與之匹配的科學(xué)有效的化療方案，提高肺癌患者的生存率，延長生存期有著重大的現(xiàn)實意義。肺癌的發(fā)生主要由于致癌環(huán)境下，驅(qū)動基因的突變，導(dǎo)致突變細(xì)胞過度增殖而形成。肺癌的驅(qū)動性基因突變是一種惡性的基因突變，是導(dǎo)致肺癌發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥的最根本原因。美國國立癌癥研究所的肺癌突變聯(lián)盟組織14家研究單位，對1000例的肺腺癌的驅(qū)動突變進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示約60％的患者含有驅(qū)動性基因突變。進(jìn)一步表明了檢測肺癌驅(qū)動性突變對于肺癌的早期診斷和化療靶向用藥的預(yù)后提供重要的中間信息。同時，肺癌的驅(qū)動性突變的檢測是肺癌靶向藥物的開發(fā)和用藥的前提和基礎(chǔ)。目前常見的檢測這些基因突變的方法主要有sanger測序法和熒光定量法。Sanger測序法中，單對引物可檢測多個突變，但對多個基因、或同一基因的不同外顯子的突變位點就需要分別進(jìn)行擴(kuò)增測序，操作繁瑣，并且靈敏度較低約20％，假陽性率較高。熒光定量PCR法雖然靈敏度高，但對每對引物只能檢測一種突變，且每種突變需要單獨建立一個PCR體系，同時檢測多個突變位點的操作繁瑣。這兩種方法對樣本的需要量都較大，不適合同時檢測多個基因突變位點。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種人類腫瘤基因變異聯(lián)合檢測試劑盒，可同時檢測多個基因的不同的突變位點，同時具有檢測靈敏度高，重復(fù)性好的特點。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種人類腫瘤基因變異聯(lián)合檢測試劑盒，包括以下部分：EGFR基因引物組、KRAS基因引物組、BRAF基因引物組、NRAS基因引物組、PIK3CA基因引物組、HiFi酶、PCR反應(yīng)液、消化酶、連接酶、連接緩沖液、連接接頭、熒光探針、QPCR反應(yīng)的Taq酶、QPCR引物和QPCR反應(yīng)液；所述EGFR基因引物組包括4對引物，所述EGFR基因引物的核酸序列如SeqIDNo1～SeqIDNo8所示；所述BRAF基因引物組包括1對引物；所述BRAF基因引物的核酸序列如SeqIDNo9～SeqIDNo10所示；所述基因NRAS引物組包括2對引物，所述NRAS基因引物的核酸序列如SeqIDNo11～SeqIDNo14所示；所述基因KRAS引物組包括2對引物，所述KRAS基因引物的核酸序列如SeqIDNo15～SeqIDNo16所示；所述PIK3CA基因引物組包括2對引物，所述PIK3CA基因引物的核酸序列如SeqIDNo17～SeqIDNo20所示。優(yōu)選的，熒光探針的核苷酸序列如SeqIDNo21所示。優(yōu)選的，QPCR引物的核苷酸序列如SeqIDNo22～SeqIDNo23所示。優(yōu)選的，連接接頭的核苷酸序列如SeqIDNo24～SeqIDNo33所示。優(yōu)選的，所述消化酶為磷酸二酯酶；所述磷酸二酯酶的酶活力為5U/μL。優(yōu)選的，所述連接酶為T4連接酶；所述T4連接酶的酶活力為1U/μL。優(yōu)選的，所述PCR反應(yīng)液包含下列含量的組分：10mmol/L的dNTP混合物的5×擴(kuò)增酶反應(yīng)液；所述5×擴(kuò)增酶反應(yīng)液包含以下含量組分：成分濃度Tris-HCl(pH9.2)250mmol/LKCl249mmol/LMgCl28mmol/L甘油50％優(yōu)選的，所述QPCR反應(yīng)液包含下列含量的組分：包含10mmol/L的dNTP混合物的5×擴(kuò)增酶反應(yīng)液；所述5×擴(kuò)增酶反應(yīng)液包含以下含量組分：成分濃度Tris-HCl(pH8.2)250mmol/LKCl249mmol/LMgCl28mmol/L甘油50％優(yōu)選的，所述HiFi酶的酶活力為5U/μL。本發(fā)明還提供了所述的試劑盒在檢測基因EGFR、KRAS、BRAF、NRAS和PIK3CA中一個和多個基因突變中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供了一種人類腫瘤基因變異聯(lián)合檢測試劑盒，包括以下部分：EGFR基因引物組、KRAS基因引物組、BRAF基因引物組、NRAS基因引物組、PIK3CA基因引物組、HiFi酶、PCR反應(yīng)液、消化酶、連接酶、連接緩沖液、連接接頭、熒光探針、QPCR反應(yīng)的Taq酶、QPCR引物和QPCR反應(yīng)液；所述EGFR基因引物組包括4對引物，所述EGFR基因引物的核酸序列如SeqIDNo1～SeqIDNo8所示；所述BRAF基因引物組包括1對引物；所述BRAF基因引物的核酸序列如SeqIDNo9～SeqIDNo10所示；所述基因NRAS引物組包括2對引物，所述NRAS基因引物的核酸序列如SeqIDNo11～SeqIDNo14所示；所述基因KRAS引物組包括2對引物，所述KRAS基因引物的核酸序列如SeqIDNo15～SeqIDNo16所示；所述PIK3CA基因引物組包括2對引物，所述PIK3CA基因引物的核酸序列如SeqIDNo17～SeqIDNo20所示。本發(fā)明提供的聯(lián)合檢測試劑盒能同時檢測人類腫瘤的多種驅(qū)動基因的突變位點，包括EGFR、NRAS、KRAS、PIK3CA和/或BRAF基因的多個突變位點，使實驗結(jié)果靈敏度高，可以檢測出1％的突變率，大大提高了檢測靈敏度，克服了現(xiàn)有技術(shù)中的難題。同時，本發(fā)明提供的試劑盒通過連接接頭的應(yīng)用，使得一次檢測可以同時檢測幾十個甚至幾百個樣本，使整個實驗過程簡單，快速，成本低；另外所述試劑盒對每個樣本的需求量低，每個樣本只需要10～100ngDNA即可。本發(fā)明提供的試劑盒對驅(qū)動性突變基因的檢測提供了有效手段。附圖說明圖1為實施例1中文庫構(gòu)建流程圖；圖2為實施例1中IonTorrentProton測序結(jié)果。具體實施方式本發(fā)明提供了一種人類腫瘤基因變異聯(lián)合檢測試劑盒，包括以下部分：EGFR基因引物組、KRAS基因引物組、BRAF基因引物組、NRAS基因引物組、PIK3CA基因引物組、HiFi酶、PCR反應(yīng)液、消化酶、連接酶、連接緩沖液、連接接頭、熒光探針、QPCR反應(yīng)的Taq酶、QPCR引物和QPCR反應(yīng)液；所述EGFR基因引物組包括4對引物，所述EGFR基因引物的核酸序列如SeqIDNo1～SeqIDNo8所示；所述BRAF基因引物組包括1對引物；所述BRAF基因引物的核酸序列如SeqIDNo9～SeqIDNo10所示；所述基因NRAS引物組包括2對引物，所述NRAS基因引物的核酸序列如SeqIDNo11～SeqIDNo14所示；所述基因KRAS引物組包括2對引物，所述KRAS基因引物的核酸序列如SeqIDNo15～SeqIDNo16所示；所述PIK3CA基因引物組包括2對引物，所述PIK3CA基因引物的核酸序列如SeqIDNo17～SeqIDNo20所示。本發(fā)明中，所述EGFR基因引物組、KRAS基因引物組、BRAF基因引物組、NRAS基因引物組和PIK3CA基因引物組對應(yīng)的正反向序列如表1所示：表1各基因引物組的信息所述各基因引物組的正向序列和反向序列的來源委托生物工程公司合成。所述引物的摩爾濃度優(yōu)選為10μmol/L。所述的引物的體積優(yōu)選為10μL。本發(fā)明中，所述HiFi酶的酶活力優(yōu)選為5U/μL。所述HiFi酶的體積優(yōu)選為10μL。本發(fā)明對所述HiFi酶的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的HiFi酶的來源即可。本發(fā)明實施例中，所述HiFi酶購自ThermoFisher。本發(fā)明中，所述PCR反應(yīng)液優(yōu)選包含下列含量的組分：10mM的dNTP混合物的5×擴(kuò)增酶反應(yīng)液；所述5×擴(kuò)增酶反應(yīng)液包括以下含量組分：成分濃度Tris-HCl(pH9.2)250mmol/LKCl249mmol/LMgCl28mmol/L甘油50％所述PCR反應(yīng)液的體積優(yōu)選為10～100μL。本發(fā)明中，所述連接接頭的核苷酸序列優(yōu)選如SeqIDNo24～SeqIDNo33所示。每種連接接頭對應(yīng)一個待測樣本，從而通過不同的連接接頭來區(qū)分不同樣本的檢測結(jié)果。所述連接接頭的質(zhì)量濃度優(yōu)選為100pmol/L。所述連接接頭的體積優(yōu)選為2～20μL。本發(fā)明中，所述連接緩沖液的主要成分為：成分濃度Tris-HCL(pH7.6)250mmol/LMgCl250mmol/LATP5mmol/LDTT5mmol/L聚乙二醇25％(w/v)本發(fā)明中，所述消化酶優(yōu)選為磷酸二酯酶；所述磷酸二酯酶的酶活力優(yōu)選為5U/μL。本發(fā)明對所述磷酸二酯酶的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的磷酸二酯酶的來源即可。本發(fā)明實施例中，所述磷酸二酯酶購自sigma公司。本發(fā)明中，熒光探針的核苷酸序列優(yōu)選如SeqIDNo21所示。所述RNA探針組的質(zhì)量濃度優(yōu)選為150ng/μl。所述RNA探針組的體積優(yōu)選為200μl。所述熒光探針的來源委托生物工程公司合成。本發(fā)明中，QPCR正向引物的核苷酸序列優(yōu)選如SeqIDNo22；QPCR反向引物的核苷酸序列優(yōu)選如SeqIDNo23所示。所述QPCR正向引物和QPCR反向引物的來源委托生物工程公司合成。所述正向引物或反向引物的摩爾濃度優(yōu)選為10μmol/L。所述正向引物或反向引物的體積優(yōu)選為10μL。本發(fā)明中，所述連接酶為T4連接酶；所述T4連接酶的酶活力為1U/μL。本發(fā)明對所述連接酶的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的連接酶的來源即可。本發(fā)明實施例中，所述連接酶購自ThermoFisher。本發(fā)明中，所述QPCR反應(yīng)液優(yōu)選包含下列含量的組分：10mmol/L的dNTP混合物的5×擴(kuò)增酶反應(yīng)液；所述5×擴(kuò)增酶反應(yīng)液包括以下含量組分：成分濃度Tris-HCl(pH8.2)250mmol/LKCl249mmol/LMgCl28mmol/L甘油50％所述QPCR反應(yīng)液的體積優(yōu)選為10～100μL。本發(fā)明中，所述QPCR反應(yīng)的Taq酶的來源購自ThermoFisher公司。本發(fā)明還提供了所述的試劑盒在檢測基因EGFR、KRAS、BRAF、NRAS和PIK3CA中一個或多個基因突變中的應(yīng)用。本發(fā)明中，所述試劑盒的檢測方法優(yōu)選包括以下步驟：(1)使用上述技術(shù)方案所述試劑盒中所述引物組對待測樣本的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；(2)將所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與消化酶混合，對目的片段兩端的引物進(jìn)行剪切處理，得到平末端DNA片段；(3)將所述步驟(2)得到的平末端DNA片段與連接接頭、連接酶和連接緩沖液混合，連接，得到連接有接頭的DNA片段；(4)用磁珠純化試劑盒按照操作說明對所述步驟(3)得到的DNA片段進(jìn)行純化，得到檢測文庫；(5)用熒光定量PCR法對所述步驟(4)中得到的檢測文庫進(jìn)行定量檢測；(6)將不同樣本制備的定量后的文庫進(jìn)行混合，連接離子球微粒后，將連接有離子球微粒的文庫在OT2儀器上進(jìn)行乳液PCR，得到的模板進(jìn)行測序，得到測序結(jié)果；(7)將篩選后的步驟(6)中得到的測序結(jié)果與人類基因庫hg19數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，獲得突變位點，結(jié)合生物信息學(xué)分析軟件對突變位點進(jìn)行注釋，從而確定突變基因。本發(fā)明使用上述技術(shù)方案所述試劑盒中所述引物組對待測樣本的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。本發(fā)明中，所述PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增體系如下：成分體積Hifi酶1μL5×擴(kuò)增酶緩沖液4μL引物(100pmol/L)1μL模板DNA(10～100ng/μL)2μLddH2O補(bǔ)至20μL本發(fā)明中，所述PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增程序如下：本發(fā)明中，所述PCR產(chǎn)物得到后優(yōu)選進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴(kuò)增情況。所述瓊脂糖凝膠電泳的方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的瓊脂糖凝膠電泳方案即可。得到PCR產(chǎn)物后，本發(fā)明向PCR產(chǎn)物中加入消化酶，對目的片段兩端的引物進(jìn)行剪切處理，得到平末端DNA片段。本發(fā)明中，所述消化酶的加入體積量為PCR產(chǎn)物的體積的0.1倍。本發(fā)明中，所述消化的方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的消化方法即可。所述消化的程序如下：溫度時間50℃10min55℃10min60℃20min得到平末端DNA片段后，本發(fā)明將所述平末端DNA片段、連接接頭、連接酶和連接緩沖液混合，連接，得到連接有接頭的DNA片段。本發(fā)明中，所述平末端DNA片段、連接接頭、連接酶和連接緩沖液混合量的比例如下：組分體積5×連接緩沖液5μL連接酶(Ligase)1μL連接接頭(100pmol/L)2μL消化產(chǎn)物22μL總體積30μL所述連接的方法沒有特殊限制采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的連接方案即可。本發(fā)明中所述連接采用PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。所述連接的程序如下：溫度時間22℃30min72℃10min得到連接有接頭的DNA片段后，本發(fā)明用磁珠純化試劑盒按照操作說明對所述DNA片段進(jìn)行純化，得到檢測文庫。本發(fā)明中，所述磁珠純化試劑盒購于貝克曼公司。得到檢測文庫后，本發(fā)明用熒光定量PCR法對所述檢測文庫進(jìn)行定量檢測。本發(fā)明中，所述熒光定量PCR的反應(yīng)體積如下：組分體積QPCR的Taq酶1μL5×QPCR緩沖液5μLQPCR引物(100pmol/L)2μL熒光探針(100pmol/L)2μL模板2μLddH2O補(bǔ)至20μL本發(fā)明中，所述熒光定量PCR的反應(yīng)程序如下：得到定量后的文庫后，本發(fā)明將不同樣本制備的定量后的文庫進(jìn)行混合，連接離子球微粒后，將連接有離子球微粒的文庫在OT2儀器上進(jìn)行乳液PCR，得到的模板進(jìn)行測序，得到測序結(jié)果。本發(fā)明中，根據(jù)QPCR結(jié)果得到文庫的濃度，將制備好的文庫稀釋成100pM的濃度，將不同樣本的文庫等體積混合后在配套的儀器IonOneTouch2和ES儀器上面進(jìn)行乳液PCR，富集PCR產(chǎn)物。本發(fā)明中，所述乳液PCR優(yōu)選使用ThermoFisher公司生產(chǎn)的IonOneTouch200templateKitv2試劑盒。得到測序結(jié)果后，本發(fā)明將篩選后的測序結(jié)果與人類基因庫hg19數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，獲得突變位點，結(jié)合生物信息學(xué)分析軟件對突變位點進(jìn)行注釋，從而確定突變基因。本發(fā)明中，所述篩選的方法為使用IontorrentProton儀器自帶的默認(rèn)的質(zhì)控參數(shù)去除多克隆的數(shù)據(jù)和低質(zhì)量的數(shù)據(jù)。本發(fā)明中，所述比對優(yōu)選采用IontorrentProton儀器自帶的服務(wù)器將篩選后的序列數(shù)據(jù)與人類基因庫hg19數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，從而得到突變位點。本發(fā)明中，根據(jù)測序后獲得測序深度數(shù)據(jù)5000以上和覆蓋度數(shù)據(jù)達(dá)到90％以上時，證明測序的質(zhì)量可信度高，得到的比對后得到的堿基變異情況。本發(fā)明中，所述測序深度每個樣本都在3萬以上，測序reads的覆蓋度都在90％以上。本發(fā)明中，檢測的突變位點結(jié)合生物信息學(xué)分析軟件對突變位點進(jìn)行注釋。所述注釋的方法優(yōu)選為參考比對的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行。所述參考比對的數(shù)據(jù)庫優(yōu)選為COSMIC數(shù)據(jù)庫以及REFSEQ數(shù)據(jù)庫。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的一種人類腫瘤基因變異聯(lián)合檢測試劑盒進(jìn)行詳細(xì)的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。實施例1取15年6月-12月送我公司檢測肺癌患者石蠟包埋組織樣本7例。對其進(jìn)行多基因驅(qū)動突變的聯(lián)合檢測。1、按照本發(fā)明所述試劑盒和方法對組織樣本進(jìn)行DNA抽提(抽提試劑盒A購于life公司)，得到的DNA溶于試劑盒中配好的Tris-EDTA中，稀釋gDNA，用qubitdsDNAHSAssayKit定量試劑盒對稀釋后的gDNA進(jìn)行精確定量，使DNA濃度約3ng/uL。A、目標(biāo)DNA擴(kuò)增；按下述組分，配制PCR體系，進(jìn)行目的片段擴(kuò)增。成分體積Hifi酶1μL5×擴(kuò)增酶緩沖液4μL引物(100pmol/L)1μL模板DNA(10～100ng/μL)2μLddH2O補(bǔ)至20μL按下述擴(kuò)增條件，進(jìn)行PCR擴(kuò)增：B、引物序列的部分消化：在擴(kuò)增產(chǎn)物中，加入2微升消化酶，按下列條件進(jìn)行消化反應(yīng)?？稍赑CR儀中進(jìn)行。溫度時間50℃10min55℃10min60℃20minC、接頭連接：在消化完成的體系中加入接頭序列和連接酶體系。體系如下：組分體積5×連接緩沖液5μL連接酶(Ligase)1μL連接接頭(100pmol/L)2μL消化產(chǎn)物22μL總體積30μL反應(yīng)條件如下，可在PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)：溫度時間22℃30min72℃10minD、cDNA純化：用本發(fā)明的磁珠(購于貝克曼公司)進(jìn)行DNA的純化。用磁珠吸附目標(biāo)DNA片段，在磁力架上，用75％酒精進(jìn)行洗滌DNA1次，然后用試劑盒中配好的Tris-EDTA溶液進(jìn)行洗脫，得到的純化好的就是我們需要的文庫。E、文庫定量：將上述步驟得到的文庫進(jìn)行熒光定量PCR定量。用參考品做對照，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，將每個文庫稀釋100倍，按照下列的體系配置反應(yīng)液：組分體積QPCR的Taq酶1μL5×QPCR緩沖液5μLQPCR引物(100pmol/L)2μL熒光探針(100pmol/L)2μL模板2μLddH2O補(bǔ)至20μL按照下列反應(yīng)程序進(jìn)行QPCR：按照結(jié)果，將文庫稀釋至100pM濃度，各文庫等體積混合，至此，文庫制備完成。2、在IonOneTouch2實驗平臺上，用IonOneTouch200templateKitv2試劑盒進(jìn)行油包水PCR，并富集PCR產(chǎn)物。操作按照儀器使用說明書進(jìn)行。3、富集后的PCR產(chǎn)物可根據(jù)IonProton200sequencingKit說明進(jìn)行樣品處理，上樣到測序儀配套的P1芯片，IontorrentProton進(jìn)行高通量測序。4、結(jié)果分析。測序結(jié)果經(jīng)過篩選，儀器自帶的程序的默認(rèn)質(zhì)控環(huán)節(jié)將去除多克隆的數(shù)據(jù)和低質(zhì)量的數(shù)據(jù)。Iontorrent平臺自帶的服務(wù)器將得到的數(shù)據(jù)再與人類基因庫hg19數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對(如圖2)，符合率達(dá)到93％。獲得測序深度數(shù)據(jù)圖(如表2所示)和覆蓋度數(shù)據(jù)圖(如表2所示)，以及堿基變異情況(如表3所示)，測序深度每個樣本都在3萬以上，測序reads的覆蓋度都在90％以上。檢測到的突變，結(jié)合生物信息學(xué)分析軟件對突變位點進(jìn)行注釋，注釋主要比對的數(shù)據(jù)庫為COSMIC數(shù)據(jù)庫以及REFSEQ數(shù)據(jù)庫。表2實施例1中待測樣本的測序深度數(shù)據(jù)和覆蓋度數(shù)據(jù)結(jié)果肺癌患者基因突變聯(lián)合檢測結(jié)果見表2。表2本發(fā)明中堿基變異情況由表2可以看出，一次測序?qū)嶒炛校梢酝瑫r檢測多個樣本，同時檢測不同的基因突變包括EGFR、PIK3CA、KRAS、NRAS和BRAF五種基因的多個突變位點，操作流程簡單，耗時短。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQUENCELISTING<110>上海鼎晶生物醫(yī)藥科技股份有限公司<120>一種人類腫瘤基因變異聯(lián)合檢測試劑盒<130>2017<160>33<170>PatentInversion3.3<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1ggtgacccttgtctctgtgttc22<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>2ggaaatatacagcttgcaaggactct26<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>3ctggtaacatccacccagatca22<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>4gctgccagacatgagaaaaggt22<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>5acgtattttgaaactcaagatcgcattc28<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>6gcaggtactgggagccaatatt22<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>7cacagcagggtcttctctgttt22<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>8ccctgcatgtgttaaacaatacagc25<210>9<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>9aatgactttctagtaactcagcagcat27<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>10tctcttacctaaactcttcataatgcttgc30<210>11<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>11atccgacaagtgagagacaggat23<210>12<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>12tcacactagggttttcatttccattgatta30<210>13<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>13gaggttaatatccgcaaatgacttgc26<210>14<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>14tgcttatttaaccttggcaatagcattg28<210>15<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>15taagtactcatgaaaatggtcagagaaacc30<210>16<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>16attataaggcctgctgaaaatgactga27<210>17<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>17tagctattcgacagcatgccaat23<210>18<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>18ccagagtgagctttcattttctcagt26<210>19<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>19attttacagagtaacagactagctagagaca31<210>20<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>20cattttagcacttacctgtgactccata28<210>21<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>21ccctgcgtgtctccgactc19<210>22<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>22ccatctcatccctgcgtgtct21<210>23<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>23ctctctatgggcagtcggtgat22<210>24<211>12<212>DNA<213>人工序列<400>24tggagataattc12<210>25<211>12<212>DNA<213>人工序列<400>25cttaatcaattc12<210>26<211>12<212>DNA<213>人工序列<400>26caggccaaccac12<210>27<211>12<212>DNA<213>人工序列<400>27cttggacttctc12<210>28<211>12<212>DNA<213>人工序列<400>28tcaacaggaatc12<210>29<211>12<212>DNA<213>人工序列<400>29ttcctagccgac12<210>30<211>12<212>DNA<213>人工序列<400>30caaggctccgtc12<210>31<211>12<212>DNA<213>人工序列<400>31cttggagaggac12<210>32<211>11<212>DNA<213>人工序列<400>32cctgacttatc11<210>33<211>12<212>DNA<213>人工序列<400>33ctgaagcaccac12當(dāng)前第1頁1 2 3