本發(fā)明屬于環(huán)境微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株施氏假單胞菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

水體中的氮主要以有機(jī)氮、氨氮和硝酸鹽氮等形式存在，是導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化、危害人體健康和破壞水體生態(tài)環(huán)境最為常見(jiàn)的污染物之一。農(nóng)業(yè)氮肥、工業(yè)廢水及城鎮(zhèn)污水等的排放是水體中氮素的主要來(lái)源。如何經(jīng)濟(jì)、高效地去除水體中氮素污染己成為水污染控制領(lǐng)域的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。微生物具有來(lái)源廣、繁殖快和適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)等特征，因此生物脫氮被認(rèn)為是最為經(jīng)濟(jì)有效的方法。

傳統(tǒng)的生物脫氮包括硝化和反硝化兩個(gè)過(guò)程。硝化過(guò)程是硝化細(xì)菌在好氧條件下將氨轉(zhuǎn)化為硝酸鹽，反硝化過(guò)程是反硝化細(xì)菌在缺氧或厭氧條件下將硝酸鹽還原的過(guò)程。目前為止，盡管傳統(tǒng)生物脫氮是多數(shù)污水處理工藝的主要承擔(dān)者，但仍存在著工藝復(fù)雜、基建費(fèi)用高等缺點(diǎn)。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究證明反硝化在好氧條件下也能實(shí)現(xiàn)。好氧反硝化技術(shù)的出現(xiàn)，可實(shí)現(xiàn)硝化與反硝化在同一構(gòu)筑物中進(jìn)行，基建和操作成本大幅下降。好氧反硝化的提出突破了傳統(tǒng)物脫氮的定式思維，得到研究者的廣泛關(guān)注，具有廣闊的應(yīng)用前景。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家學(xué)者們已相繼分離出多種高效的好氧反硝化菌株，這為好氧反硝化菌株的廣泛應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。專(zhuān)利CN201310680417.2 公開(kāi)了一株具有好氧反硝化能力的施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）在污水處理中的應(yīng)用，該菌株可用于處理高硝酸鹽廢水，其對(duì)NO₃^--N最高去除率可達(dá)99.6%，且無(wú)NO₂^--N的累積，并可同時(shí)去除有機(jī)廢水中的COD，去除率可達(dá)60%~80%。潘玉瑾等（好氧反硝化菌P. chengduensis ZPQ2的篩選及其反硝化條件優(yōu)化，水污染防治，2015，07）從SBR反應(yīng)器活性污泥中篩選出一株假單胞菌ZPQ2，經(jīng)48 h培養(yǎng)，菌株ZPQ2對(duì)NO₃^--N和COD去除率分別達(dá)到93.4％和98.1％。楊先基等（一株好氧反硝化細(xì)菌的分離鑒定及反硝化能力，環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，07）從活性污泥中分離出一株施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）G3，該菌在氧氣充足的情況下，24 h內(nèi)對(duì)NO₂^--N積累量為12.03 mg/l，對(duì)NO₃^--N的去除率為91.09％。由此可見(jiàn)，很多不同種屬的假單胞菌株都具有高效的反硝化能力，在含氮廢水處理領(lǐng)域有極大的應(yīng)用潛力。

此外，目前幾乎沒(méi)有關(guān)于好氧反硝化細(xì)菌的自動(dòng)聚集沉降性能方面的報(bào)道，因此，還亟待從環(huán)境中篩選此類(lèi)細(xì)菌，并將其應(yīng)用于含氮廢水處理領(lǐng)域中，以期獲得高效脫氮的同時(shí)實(shí)現(xiàn)高效的泥水分離效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一株具有自動(dòng)聚集沉降能力的施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）XL-2。該菌株在好氧條件下實(shí)現(xiàn)好氧反硝化及快速泥水分離，適用于含硝態(tài)氮有機(jī)廢水的處理。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一株施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）XL-2，于2016年11月10日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 13252。本發(fā)明施氏假單胞菌XL-2的16SrDNA基因序列見(jiàn)序列表，序列長(zhǎng)度為1282bp，在GenBank中基因序列登錄號(hào)為KY435925。

所述的施氏假單胞菌XL-2為直或稍彎的革蘭氏陰性桿菌，無(wú)核，不形成芽孢，細(xì)菌大小為0.45×（1.2-2.3）μm；菌落為淺黃綠色，邊緣不規(guī)則，表面有褶皺、濕潤(rùn)、半透明。

所述的施氏假單胞菌XL-2在好氧條件下，能以CH₃COONa為碳源、NO₃^--N為氮源進(jìn)行好氧反硝化脫氮，且最終無(wú)中間產(chǎn)物NO₂^--N的積累；該菌株還具有自動(dòng)聚集沉降能力，在高濃度含氮廢水處理領(lǐng)域有很大的應(yīng)用前景。

施氏假單胞菌XL-2在高濃度含氮廢水處理領(lǐng)域時(shí)，所述廢水COD/TN為13~53，較優(yōu)條件為21~40。

施氏假單胞菌XL-2在高濃度含氮廢水處理領(lǐng)域時(shí)，所述廢水pH為5~10，較優(yōu)條件為7~9。

施氏假單胞菌XL-2在高濃度含氮廢水處理領(lǐng)域時(shí)，所述廢水溫度為20~40 ℃，較優(yōu)條件為25~35 ℃。

施氏假單胞菌XL-2在高濃度含氮廢水處理領(lǐng)域時(shí)，所述廢水最優(yōu)處理?xiàng)l件為廢水COD/TN為21~40，pH值7~9，溫度25~35 ℃。

施氏假單胞菌XL-2在高濃度含氮廢水處理領(lǐng)域時(shí)所述菌株XL-2在5 min內(nèi)的自動(dòng)聚集沉降率為22.6%，在150 min內(nèi)的最大自動(dòng)聚集沉降度為60.2%，能快速實(shí)現(xiàn)泥水分離。

與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

1、在好氧條件下，施氏假單胞菌株XL-2能利用高濃度的NO₃^--N進(jìn)行好氧反硝化，20 h內(nèi)對(duì)NO₃^--N去除率高達(dá)95.5%，TN去除率84.8%，COD去除率為74.5%，且最終無(wú)中間產(chǎn)物NO₂^--N的積累。該菌株能實(shí)現(xiàn)廢水中氮素和碳素的高效同時(shí)去除，在含氮廢水處理領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用前景。

2、施氏假單胞菌株XL-2在生長(zhǎng)過(guò)程中能自發(fā)聚集沉降，5 min內(nèi)的自動(dòng)聚集沉降率為22.6%，150 min內(nèi)最大自動(dòng)聚集沉降度為60.2%，能實(shí)現(xiàn)泥水快速分離。

附圖說(shuō)明

圖1為施氏假單胞菌XL-2自沉聚集體掃描電鏡圖；

圖2為施氏假單胞菌XL-2以NO₃^--N為氮源、CH₃COONa為碳源時(shí)的生長(zhǎng)曲線(xiàn)及COD降解圖；

圖3為施氏假單胞菌XL-2以NO₃^--N為氮源、CH₃COONa為碳源時(shí)的TN、NO₃^--N、NO₂^--N變化曲線(xiàn)；

圖4為施氏假單胞菌XL-2自動(dòng)聚集沉降能力隨沉降時(shí)間變化圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

本發(fā)明菌株XL-2從重慶市雞冠石污水廠(chǎng)A²/O二沉池的活性污泥中分離并通過(guò)稀釋平板劃線(xiàn)方法純化所得，具有高效好氧反硝化脫氮性能。

實(shí)施例一：細(xì)菌的分離及鑒定

1、細(xì)菌的分離及純化

細(xì)菌的選擇性篩選：將取回的活性污泥5 ml，接種于裝有100 ml無(wú)菌水的錐形瓶中，并在其中加入一定量的玻璃珠以起到分散活性污泥的作用。然后，將錐形瓶置于120 rpm恒溫振蕩搖床振蕩1 h，得到分散均勻的細(xì)菌懸浮液。再吸取1 ml細(xì)菌懸浮液到100 ml的硝酸鹽液體培養(yǎng)基中，120 rpm、30 ℃恒溫馴化48 h。然后再取培養(yǎng)后的細(xì)菌懸浮液（1 ml）轉(zhuǎn)移到含有100 mg/l的硝酸鹽液體培養(yǎng)基中進(jìn)行二次選擇馴化，120 rpm、30 ℃恒溫馴化48 h。經(jīng)過(guò)三次選擇培養(yǎng)后，將細(xì)菌培養(yǎng)液接種到LB培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)12~24 h。

細(xì)菌的分離和純化：將富集培養(yǎng)后的細(xì)菌培養(yǎng)液用無(wú)菌水進(jìn)行梯度稀釋成10^-1~10^-6，然后將稀釋倍數(shù)為10^-3~10^-6的細(xì)菌培養(yǎng)液分別涂布于含硝酸鹽固體培養(yǎng)基的平板上，倒置培養(yǎng)2~3 d；然后用接種環(huán)小心挑取平板中菌落顏色、大小、形狀不同的單個(gè)菌落分別接種于硝酸鹽液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后測(cè)定硝酸鹽液體培養(yǎng)基中NO₃^--N和TN的去除效果；選取NO₃^--N和TN的去除效果較好的培養(yǎng)液，再稀釋一定梯度后平板劃線(xiàn)于硝酸鹽固體培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)2~3 d；再用接種環(huán)挑取硝酸鹽固體培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落接種于硝酸鹽液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后測(cè)定硝酸鹽液體培養(yǎng)基中NO₃^--N和TN的去除效果；此后經(jīng)過(guò)反復(fù)平板劃線(xiàn)，再檢驗(yàn)NO₃^--N和TN的去除效果，直至NO₃^--N和TN的去除效果達(dá)到穩(wěn)定為止。

將NO₃^--N和TN去除效果最好的單一菌株進(jìn)行16S rDNA基因測(cè)序鑒定，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中已有細(xì)菌的序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果與Pseudomonas stutzeri相似度最高，故該菌株命名為施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）XL-2。

上述涉及的培養(yǎng)基為：

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/l、酵母浸出粉5 g/l、NaCl 5 g/l、NaH₂PO₄·2H₂O和Na₂HPO₄·12H₂O調(diào)節(jié)pH至7~8。

硝酸鹽固體培養(yǎng)基：KNO₃ 0.722 g/l、CH₃COONa 3.418 g/l、NaCl 4 g/l、瓊脂粉15-20 g/l、微量元素3 ml/L、NaH₂PO₄·2H₂O和Na₂HPO₄·12H₂O調(diào)節(jié)pH至7~8。

硝酸鹽液體培養(yǎng)基：KNO₃ 0.722 g/l、CH₃COONa 3.418 g/l、NaCl 4 g/l、微量元素3 ml/l、NaH₂PO₄·2H₂O和Na₂HPO₄·12H₂O調(diào)節(jié)pH至7~8。

所述微量元素溶液為：MgSO₄·7H₂O 3 g/l、MnSO₄·H₂O 3.36 g/l、H₃BO₃ 1.12 g/l、ZnSO₄·7H₂O 3 g/l、FeSO₄·7H2O 0.3 g/l和CaCl₂ 0.6 g/l。

上述液體培養(yǎng)條件為恒溫30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為120 rpm；固體平板培養(yǎng)條件為恒溫30 ℃。

2、細(xì)菌的鑒定：

本發(fā)明中施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）XL-2為直或稍彎的革蘭氏陰性桿菌，無(wú)核，不形成芽孢，細(xì)菌大小為0.45×（1.2-2.3）μm；菌落為淺黃綠色，邊緣不規(guī)則，表面有褶皺、濕潤(rùn)、半透明。

該菌的16S rDNA基因序列見(jiàn)序列表，序列長(zhǎng)度為1282bp，在GenBank中基因序列登錄號(hào)為KY435925。序列結(jié)果與GenBank中已有細(xì)菌的序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果與Pseudomonas stutzeri相似度高達(dá)99%，故該菌命名為施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）XL-2。于2016年11月10日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 13252。

實(shí)施例二：施氏假單胞菌株XL-2對(duì)廢水中NO₃^--N、TN、COD的去除效果

施氏假單胞菌株XL-2以NO₃^--N為唯一氮源、CH₃COONa為唯一碳源時(shí)，考察廢水中NO₃^--N、TN、COD的降解情況及NO₂^--N的積累情況。初始COD濃度為2971 mg/l，初始TN為103 mg/l，初始NO₃^--N濃度為89 mg/l。在30 ℃、120 rpm搖床中連續(xù)培養(yǎng)72 h，并相隔一定時(shí)間取樣。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)圖2及圖3。前20 h，菌株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)迅速；20 h時(shí)，菌株OD₆₀₀（溶液在600 nm波長(zhǎng)處的吸光值）為0.761；36 h后，細(xì)菌生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期，OD₆₀₀穩(wěn)定在0.9左右。20 h內(nèi)菌株XL-2對(duì)NO₃^--N去除率高達(dá)95.5%，TN去除率為84.8%，COD去除率為74.5%，并且最終無(wú)中間產(chǎn)物NO₂^--N的積累。

實(shí)施三：施氏假單胞菌株XL-2自動(dòng)聚集沉降效果分析

施氏假單胞菌株XL-2以NO₃^--N為唯一氮源、CH₃COONa為唯一碳源時(shí)，考察菌株在培養(yǎng)12 h時(shí)的自動(dòng)聚集沉降能力。

菌株的自動(dòng)聚集能力以百分比表示。其測(cè)定方法為：細(xì)菌經(jīng)硝酸鹽液體培養(yǎng)基適當(dāng)培養(yǎng)后，調(diào)菌懸液OD₆₀₀至1.0，渦漩振蕩2 min后，取4 ml振蕩后的培養(yǎng)液測(cè)定其在600 nm處的吸光值作為整個(gè)細(xì)菌懸浮液吸光值，然后于30 ℃靜止放置，分別在處理后的5 min，15 min，30 min，60 min，90 min，120 min，150 min和180 min取上層清液轉(zhuǎn)移至另一潔凈試管內(nèi)，在600 nm處測(cè)定上層清液吸光值。每組取8個(gè)平行。

通過(guò)以下公式計(jì)算：

自動(dòng)聚集能力(％)=(1-上層清液吸光值／整個(gè)細(xì)菌懸浮液吸光值)×100

菌株XL-2的自動(dòng)聚集沉降率隨沉降時(shí)間的變化如圖4所示。結(jié)果表明菌株XL-2在5 min內(nèi)的自動(dòng)聚集沉降度為22.6%，在150 min內(nèi)最大自動(dòng)聚集沉降度為60.2%。同時(shí)，通過(guò)掃描電鏡可觀(guān)察到菌株XL-2的沉降聚集體（圖1）。由此可見(jiàn)，菌株在培養(yǎng)過(guò)程中能快速實(shí)現(xiàn)菌水分離，在實(shí)際含氮廢水處理領(lǐng)域中具有很大的應(yīng)用潛力。

最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。

SEQUENCE LISTING

<110> 重慶大學(xué)

<120> 一株施氏假單胞菌及其應(yīng)用

<130> 說(shuō)明書(shū)

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1282

<212> DNA

<213> Pseudomonas stutzeri XL-2

<400> 1

ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgtgaca ttctgattca cgattactag 60

cgattccgac ttcacgcagt cgagttgcag actgcgatcc ggactacgat cggttttatg 120

ggattagctc cacctcgcgg cttggcaacc ctttgtaccg accattgtag cacgtgtgta 180

gcccaggccg taagggccat gatgacttga cgtcatcccc accttcctcc ggtttgtcac 240

cggcagtctc cttagagtgc ccaccttaac gtgctggtaa ctaaggacaa gggttgcgct 300

cgttacggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacagccat gcagcacctg 360

tgtcagagtt cccgaaggca ccaatccatc tctggaaagt tctctgcatg tcaaggcctg 420

gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc 480

gtcaattcat ttgagtttta accttgcggc cgtactcccc aggcggtcga cttaatgcgt 540

tagctgcgcc actaagatct caaggatccc aacggctagt cgacatcgtt tacggcgtgg 600

actaccaggg tatctaatcc tgtttgctcc ccacgctttc gcacctcagt gtcagtatta 660

gcccaggtgg tcgccttcgc cactggtgtt ccttcctata tctacgcatt tcaccgctac 720

acaggaaatt ccaccaccct ctgccatact ctagctcgcc agttttggat gcagttccca 780

ggttgagccc ggggctttca catccaactt aacgaaccac ctacgcgcgc tttacgccca 840

gtaattccga ttaacgcttg cacccttcgt attaccgcgg ctgctggcac gaagttagcc 900

ggtgcttatt ctgttggtaa cgtcaaaaca gcaaggtatt aacttactgc ccttcctccc 960

aacttaaagt gctttacaat ccgaagacct tcttcacaca cgcggcatgg ctggatcagg 1020

ctttcgccca ttgtccaata ttccccactg ctgcctcccg taggagtctg gaccgtgtct 1080

cagttccagt gtgactgatc atcctctcag accagttacg gatcgtcgcc ttggtgagcc 1140

tttacctcac caactagcta atccgaccta ggctcatctg atagcgtgag gtccgaagat 1200

cccccacttt ctcccgtagg acgtatgcgg tattagcgtt cctttcgaaa cgttgtcccc 1260

cactaccagg cagattccta gg 1282