本發(fā)明屬于分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種水稻香味基因fgr功能標(biāo)記及其專用引物序列。
背景技術(shù)：
：水稻是重要的糧食作物之一，隨著世界人口的增長，人民生活水平的提高，水稻產(chǎn)量及其米質(zhì)的改良成為全球農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種專家研究的熱點。其中水稻香味是米質(zhì)改良的重要指標(biāo)之一。水稻香味是由編碼甜菜醛脫氫酶BADH2(betainealdehydedehydrogenase)基因序列的8個堿基缺失、3處堿基的變異和終止密碼子的提前產(chǎn)生而導(dǎo)致BADH2原有功能缺失，從而使甜菜醛脫氫酶的作用底物2-乙?；?1-吡咯啉在代謝途徑中斷，香味物質(zhì)2-乙?；?1-吡咯啉不斷積累，使水稻的葉片和籽粒產(chǎn)生香味，因此推斷水稻中的BADH2基因與控制水稻隱性香味性狀基因fgr是同一基因。Bradbury等(2005)對米香基因區(qū)域的17個基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)控制BADH2的基因在香與非香水稻品種中有明顯的差異。水稻香味基因fgr的cDNA全長1807bp，包含有15個外顯子，編碼一個由503氨基酸組成的蛋白產(chǎn)物。如圖1所示，香米品種中fgr基因的第7個外顯子8bp缺失；244~252位的氨基酸KKIMASAA變成IYFSCSYG；并提前形成終止密碼子，造成253位以后的氨基酸全部缺失，蛋白功能缺失。王軍等（2008）利用fgr分子標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將第2或第7個外顯子缺失的fgr基因用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳與未缺失的FGR基因區(qū)分開，但此技術(shù)需要用到具有毒性的丙烯酰胺試劑，而且與瓊脂糖凝膠電泳相比更加耗時、耗材。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種水稻香味基因fgr功能標(biāo)記及其專用引物序列，采用無毒試劑瓊脂糖凝膠，并且可以節(jié)約大量時間、物力、財力。對此，本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種水稻香味基因fgr功能標(biāo)記的專用引物序列，所述水稻香味基因fgr的香味等位基因的顯性分子標(biāo)記M-fgr由三條引物構(gòu)成：fgrF引物：ttgtttggagcttgctgatg；fgrIn引物：AACCATAGGAGCAGgTGAAAT；fgrR引物：acaaagtcccgcacttcaga。本發(fā)明還提供了一種水稻香味基因fgr功能標(biāo)記，采用以下步驟進(jìn)行分子標(biāo)記：步驟S1：提取水稻植株的基因組DNA；步驟S2：PCR擴(kuò)增：以步驟S1的水稻植株基因組DNA為模板，將所述的fgrF、fgrIn和fgrR引物加入到PCR反應(yīng)體系中，對所述的水稻植株基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增得到擴(kuò)增產(chǎn)物；步驟S3：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量百分比濃度為1.2%的包含有GelRed核酸染料的瓊脂糖凝膠中電泳，然后在紫外燈下觀察并拍照獲得電泳圖；步驟S4：根據(jù)電泳圖進(jìn)行分析。進(jìn)一步，進(jìn)行電泳圖分析時，如果同時含有569bp和260bp兩條特征條帶，則為含有香味fgr等位基因，表型為香味品種；如果僅含有569bp的特征條帶，則為不含香味fgr等位基因，表型為非香味品種。進(jìn)一步，所述PCR反應(yīng)體系為20μL的體系：2.0μL的10×PCRBuffer；0.5μL的10mMdNTPs；5μM的fgrF引物1.0μL；5μM的fgrIn引物1.0μL；5μM的fgrR引物1.0μL；0.2μL的TaqDNA聚合酶，2.0μL的模板DNA，12.3μL的ddH2O。進(jìn)一步，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec、58℃退火45sec、72℃延伸1min，循環(huán)35次；然后72℃延伸5min后得到擴(kuò)增產(chǎn)物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：1、采用本發(fā)明的技術(shù)方案，PCR擴(kuò)增后，采用瓊脂糖凝膠電泳即可檢測，試劑無毒。2、使用方法簡單，可以節(jié)約大量時間、物力、財力，降低了育種成本。附圖說明圖1為香味基因fgr第7外顯子序列；圖2為本發(fā)明香味基因fgr等位基因的擴(kuò)增示意圖；圖3為本發(fā)明檢測的24個水稻親本品種分子標(biāo)記的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中，1-中九B；2-美B；3-良豐B；4-西菲B；5-龍豐B；6-博IIB；7-158B；8-地谷B；9-福伊B；10-谷梅4號；11-112B；12-998B；13-桂99；14-明恢63；15-9311；16-B5；17-金圍矮；18-關(guān)東94；19-廣占63S；20-Y58S；21-宜香B；22-百香139；23-桂育9號；24-泰豐B；圖4為本發(fā)明檢測的48個水稻BC1F1代雜交品種分子標(biāo)記的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖中，M為Marker2000，從上至下條帶分別為2000bp、1000bp、750bp、500bp和200bp。具體實施方式以下將結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步地詳述。實施例1一種水稻香味基因fgr功能標(biāo)記的專用引物序列，所述水稻香味基因fgr的香味等位基因的顯性分子標(biāo)記M-fgr由三條引物構(gòu)成：fgrF引物：ttgtttggagcttgctgatg；fgrIn引物：AACCATAGGAGCAGgTGAAAT；fgrR引物：acaaagtcccgcacttcaga。水稻香味基因fgr功能標(biāo)記的具體實施步驟如下：(1)提取水稻基因組DNA分別取種植于南寧的24份水稻葉片，通過CTAB提取法（十六烷基三甲基溴化銨法）獲得水稻的基因組DNA。(2)PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為20ul：2.0μL的10×PCRBuffer；0.5μL的10mMdNTPs；5μM的三種引物各1.0uL；0.2μL的TaqDNA聚合酶，2.0μL的模板DNA，12.3μL的ddH2O。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；然后35個循環(huán)94℃變性30sec，58℃退火45sec，72℃延伸1min；最后72℃延伸5min獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。(3)將擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量百分比濃度為1.2%并含有GoldRed核酸染料的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，紫外燈下觀察拍照得到電泳圖。(4)結(jié)果與分析24個水稻親本品種的分子標(biāo)記的電泳圖詳見圖3，24個水稻親本品種的香味表型和基因型詳見表1。如圖3所示，標(biāo)號為21、22有兩條亮帶，為含香味基因fgr的品種，在表1中基因型為“+”，而其他為不含香味基因fgr的品種，基因型為“-”；經(jīng)過對比得出，采用所述水稻香味基因fgr功能標(biāo)記的方法鑒定的結(jié)果與水稻親本品種香味表型一致。表124個水稻親本品種及其香味表型和基因性編號品種基因型（fgr+）表型編號品種基因型（fgr+）表型1中九B-非香13桂99-非香2美B-非香14明恢63-非香3良豐B-非香159311-非香4西菲B-非香16B5-非香5龍豐B-非香17金圍矮-非香6博IIB-非香18關(guān)東94-非香7158B-非香19廣占63S-非香8地谷B-非香20Y58S-非香9福伊B-非香21宜香B+香10谷梅4號-非香22百香139+香11112B-非香23桂育9號-非香12998B-非香24泰豐B-非香實施例2(1)水稻材料將香味品種宜香B與非香味品種美B雜交獲得F1代，再與以美B為母本雜交獲得BC1F1。(2)水稻基因組DNA提取取48個BC1F1品種單株，通過CTAB提取法（十六烷基三甲基溴化銨法）獲得水稻的基因組DNA。(3)PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為20uL：2.0μL的10×Buffer；0.5μL的10mMdNTPs；5μM的三種引物各1.0uL；0.2μL的TaqDNA聚合酶，2.0μL的模板DNA，12.3μL的ddH2O。PCR反應(yīng)程序：94℃5min；然后35個循環(huán)94℃30sec，58℃45sec，72℃1min；最后72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量百分比濃度為1.2%并含有GoldRed核酸染料的瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下觀察拍照。(4)結(jié)果與分析結(jié)果如圖4所示為48個BC1F1代水稻雜交品種分子標(biāo)記的瓊脂糖凝膠電泳圖。標(biāo)號為1、4、23、28、31、34和46的7個植株為含fgr等位基因的香味品種，而其它為無香味品種，與用氫氧化鉀法檢測的香味表型結(jié)果一致。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQUENCELISTING<110>廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點開放實驗室廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所<120>水稻香味基因fgr功能標(biāo)記及其專用引物序列<130><160>3<170>PatentInversion3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1ttgtttggagcttgctgatg20<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2aaccataggagcaggtgaaat21<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3acaaagtcccgcacttcaga20當(dāng)前第1頁1 2 3