本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于細(xì)胞色素P450還原酶基因片段合成的dsRNA及其在提高西維因防治飛蝗效果中的應(yīng)用。

技術(shù)背景

西維因是一種用途極為廣泛的氨基甲酸酯類殺蟲劑，具有對人、畜毒性低，穩(wěn)定性好，藥效持久，起效迅速等優(yōu)點，廣泛使用在作物和森林的多種害蟲的日常防治工作中。長期以來，反復(fù)使用以西維因為代表的氨基甲酸酯類殺蟲劑防治飛蝗，已使得飛蝗對西維因產(chǎn)生較為嚴(yán)重的抗性，導(dǎo)致西維因防治劑量加大，蝗災(zāi)防治成本提高，過量使用西維因也對人類身體健康、對生態(tài)平衡造成潛在危害。目前已有通過傳統(tǒng)的農(nóng)藥混配，交替輪換使用、開發(fā)新型殺蟲劑等途徑應(yīng)用于飛蝗防治，但目前田間飛蝗抗藥性危害依然十分嚴(yán)重。因此迫切需要研發(fā)一種新型的增強(qiáng)西維因?qū)︼w蝗防治效果的技術(shù)。

RNA干擾是指內(nèi)源或外源雙鏈RNA，在誘導(dǎo)沉默復(fù)合物與Dicer酶的作用下，專一性的誘導(dǎo)靶基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象。由于RNA干擾可以沉默害蟲農(nóng)藥抗性或抗性基因，對環(huán)境和高等動物安全，所以該技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于害蟲抗藥性防治。

經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，目前已有的飛蝗dsRNA相關(guān)專利申請如下：專利申請?zhí)?01610316474.6，名稱為“一種飛蝗腸道核酸水解酶基因在害蟲防治中的應(yīng)用”；專利申請?zhí)?01610186141.6，名稱為“飛蝗翅表皮蛋白基因及其在害蟲防治中的應(yīng)用”；專利申請?zhí)?01610186149.2，名稱為“飛蝗翅特異表皮蛋白基因及其dsRNA的應(yīng)用”；專利申請?zhí)?01510160191.2，名稱為“Knickkopf基因dsRNA在害蟲防治中的應(yīng)用”；專利申請?zhí)?01510160194.6，名稱為“Retroactive基因及其dsRNA在害蟲防治中的應(yīng)用”；專利申請?zhí)?01510118799.9，名稱為“一種昆蟲細(xì)胞色素P450基因及其應(yīng)用”；專利申請?zhí)?01510080636.6，名稱為“昆蟲幾丁質(zhì)去乙酰基酶基因1及其在害蟲防治中的應(yīng)用”；專利申請?zhí)?01410647729.8，名稱為“一種東亞飛蝗ATP合酶β亞基基因及其dsRNA在害蟲防治中的應(yīng)用”；專利申請?zhí)?01410665503.0，名稱為“一種東亞飛蝗ATP合酶α亞基基因及其dsRNA在害蟲防治中的應(yīng)用”；專利申請?zhí)?01410292658.4，名稱為“昆蟲Ⅱ型幾丁質(zhì)酶基因特異性dsRNA的應(yīng)用”；專利申請?zhí)?01410069843.7，名稱為“蝗蟲Ⅰ型幾丁質(zhì)酶基因的序列及其dsRNA的應(yīng)用”,專利申請?zhí)?01310023385.9，名稱為“昆蟲UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因及其dsRNA的應(yīng)用”；專利申請?zhí)?01210356675.0，名稱為“昆蟲β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因及其應(yīng)用”；專利申請?zhí)?01010163625.1，名稱為“一種昆蟲幾丁質(zhì)合成酶1基因片段及其dsRNA和應(yīng)用”；專利申請?zhí)?01010163645.9，名稱為“一種昆蟲幾丁質(zhì)合成酶1A基因片段及其dsRNA和應(yīng)用”；專利申請?zhí)?01010163618.1，名稱為“一種昆蟲幾丁質(zhì)合成酶2基因和應(yīng)用”；專利申請?zhí)?01010163634.0，名稱為“一種昆蟲幾丁質(zhì)合成酶1B基因片段及其dsRNA和應(yīng)用”，專利申請?zhí)?01010136330.5，名稱為“昆蟲幾丁質(zhì)酶基因及其dsRNA的應(yīng)用”。

上述18個專利申請的核心內(nèi)容均涉及利用注射法dsRNA沉默飛蝗某個關(guān)鍵基因/致死基因引起飛蝗致死表型，然而上述關(guān)鍵基因/致死基因沉默后，飛蝗死亡現(xiàn)象顯現(xiàn)較慢，需要等待多日或一個發(fā)育齡期才能逐步觀察到致死效果，這非常不利于蝗災(zāi)集中爆發(fā)后的應(yīng)急防控。更為重要的是飛蝗不僅僅是一種農(nóng)業(yè)害蟲，更是食物鏈中的重要環(huán)節(jié)。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)閾值以下，應(yīng)當(dāng)保持一定數(shù)量的飛蝗種群數(shù)量，以維持生態(tài)平衡。若上述飛蝗關(guān)鍵基因/致死基因序列在生產(chǎn)過程中人工大量擴(kuò)增或者通過植物轉(zhuǎn)基因手段轉(zhuǎn)入農(nóng)作物，就有發(fā)生關(guān)鍵基因/致死基因非受控轉(zhuǎn)移的潛在風(fēng)險，進(jìn)而可能引起飛蝗種群數(shù)量急劇減少，導(dǎo)致天敵動物數(shù)量降低，最終危害農(nóng)田生態(tài)平衡，誘發(fā)其它昆蟲災(zāi)害。

細(xì)胞色素P450是昆蟲三大代謝解毒酶系之一，該酶參與包括西維因在內(nèi)的多種農(nóng)藥的代謝解毒。細(xì)胞色素P450的活力嚴(yán)格依賴與細(xì)胞色素P450還原酶提供電子。因此將昆蟲細(xì)胞色素P450還原酶干擾，就可以降低昆蟲細(xì)胞色素P450對農(nóng)藥的解毒能力，從而達(dá)到提高農(nóng)藥對害蟲的防治效果。通常昆蟲僅含有一個細(xì)胞色素P450還原酶基因，dsRNA介導(dǎo)的細(xì)胞色素P450還原酶干擾多數(shù)不會直接引起昆蟲死亡。這大大方便了研究者通過干擾細(xì)胞色素P450還原酶，同時調(diào)節(jié)多個細(xì)胞色素P450酶活力，進(jìn)而提高害蟲對農(nóng)藥的敏感性。目前尚未見通過dsRNA干擾技術(shù)，針對飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶提高飛蝗西維因致死率的相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶基因片段合成的dsRNA及其在提高西維因防治飛蝗效果中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的一種飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶基因，該基因的核苷酸序列為SEQ ID NO：1所示的序列；該基因核苷酸序列的獲得是依據(jù)非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫，采用blastx軟件對飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對注釋；針對搜索注釋獲得的待定飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶基因，采用Oligo軟件設(shè)計全長上游引物SEQ ID NO：3和全長下游引物SEQ ID NO：4；以飛蝗cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得一條長度為2043bp的DNA片段；將經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收試劑盒純化后的PCR產(chǎn)物與pEASY-T1載體連接，熱激法轉(zhuǎn)入Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，在瓊脂平板挑取菌落，在含有氨芐霉素-卡那霉素雙抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時后，送上海生工公司測序；測序獲得細(xì)胞色素P450還原酶基因全長為2043bp，其核苷酸序列為SEQ ID NO：1所示。

本發(fā)明提供一種飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶基因編碼的氨基酸序列，其特征在于氨基酸序列為SEQ ID NO：2所示的序列；該氨基酸序列的獲得是根據(jù)三聯(lián)密碼子原則，將SEQ ID NO：1通過Translate tool軟件翻譯為相應(yīng)的氨基酸，并對其相對分子量和等電點進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測結(jié)果表明細(xì)胞色素P450還原酶基因編碼680個氨基酸，相對分子量為77.1KD，理論等電點為5.49。

本發(fā)明提供一種兩端均融合有T7啟動子的飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶基因片段，以及基于該片段合成的dsRNA和基于該片段合成的dsRNA在提高西維因防治飛蝗效果中的應(yīng)用；基于飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶基因序列，設(shè)計5’端含有T7啟動子的上游引物SEQ ID NO：5和5’端含有T7啟動子的下游引物SEQ ID NO：6，以飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶基因DNA為模板，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增獲得目的片段SEQ ID NO：7；將該目的片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外切膠純化后，用T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄試劑盒合成dsRNA；之后用玻璃針將該dsRNA注射入飛蝗腹部第二腹節(jié)，檢測飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶mRNA表達(dá)水平和酶活力水平的下降程度，以及該dsRNA提高西維因?qū)︼w蝗防治效果的能力。

本發(fā)明的有益效果：將一種基于飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶基因片段合成的dsRNA，用玻璃針將該dsRNA注射入飛蝗腹部第二腹節(jié)，可檢測到飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶mRNA表達(dá)水平下降64.3％-81.1％，且細(xì)胞色素P450還原酶活力水平降低18.4％-27.2％，注射該dsRNA后可將西維因?qū)?齡飛蝗的致死率提高至1.73倍-2.3倍。

附圖說明

圖1：飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶基因全長克隆的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖(泳道1所示為DL5000DNA Marker，條帶大小從上到下依次為5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp，泳道2所示為飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶基因全長擴(kuò)增產(chǎn)物條帶)。

圖2：dsRNA對飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶基因表達(dá)影響(dsGFP為注射dsGFP的對照組，dsCPR為注射飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶基因片段dsRNA的處理組)，β-actin為內(nèi)參基因，其中**P<0.01。

圖3：dsRNA對飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶酶活力影響(dsGFP為注射dsGFP的對照組，dsCPR為注射飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶基因片段dsRNA的處理組)，其中*P<0.05。

圖4：注射dsRNA對西維因?qū)︼w蝗致死率的影響。(dsGFP為注射dsGFP的對照組，dsCPR為注射飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶基因片段dsRNA的處理組)，其中*P<0.05。

具體實施方式

實施例1：飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶基因全長cDNA獲得以及氨基酸序列預(yù)測。

1.飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶基因生物信息學(xué)搜索。

用Formatdb程序?qū)w蝗轉(zhuǎn)錄組Unigene序列轉(zhuǎn)化為比對數(shù)據(jù)庫，通過blastx軟件將比對數(shù)據(jù)庫與非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行逐條比對注釋，搜索注釋結(jié)果獲得2條飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶序列。

2.飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶基因全長cDNA獲得。

2.1)PCR全長擴(kuò)增所需全長引物設(shè)計：

采用Sequencher軟件將比對注釋得到的2條飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶基因進(jìn)行比對，拼接為1條全長序列；并采用Oligo軟件分別設(shè)計全長上游引物ATGGAGGCAGAGGCAGGCAACGAG(SEQ ID NO:3)和全長下游引物TCAGCTCCATACATCTGAAGAAT(SEQ ID NO:4)；將設(shè)計好的一對全長引物發(fā)往生工生物工程(上海)股份有限公司。

2.2)PCR擴(kuò)增所需模板制備：

選取生長狀況良好、跳躍有力的飛蝗3齡若蟲，置于液氮中研磨，參照英駿Trizol試劑盒提取總RNA；采用Oligotex mRNA Mini Kit提取試劑盒和RevertAid^TMH Minus Reverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄cDNA，從而獲得PCR反應(yīng)所需模板。

2.3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)：

PCR擴(kuò)增獲得飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶cDNA通過瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測分離(圖1)；通過切膠回收，膠回收試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)純化后，與pEASY-T1載體鏈接，再轉(zhuǎn)入Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)，瓊脂平板培養(yǎng)挑取飽滿白斑，并接入含有氨芐青霉素和卡那霉素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用質(zhì)粒小提試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取質(zhì)粒后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序；測序獲得的基因全長cDNA的DNA序列為2043bp，其核苷酸序列為SEQ ID NO：1所示的序列。

3.飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶基因氨基酸序列預(yù)測。

采用Translate tool對飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶基因所編碼的氨基酸進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶基因編碼680個氨基酸，其氨基酸序列為SEQ ID NO：2所示的序列，預(yù)測相對分子量為77.1KD，理論等電點為5.49；采用SMART在線軟件對其功能域進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示飛蝗細(xì)胞色素P450基因具有信號肽，含有FMN、FAD和NADP結(jié)構(gòu)域。飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶編碼的氨基酸與黑腹果蠅細(xì)胞色素P450基因編碼的氨基酸序列相似性達(dá)到70％。

實施例2：飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶基因片段dsRNA的合成。

1.飛蝗細(xì)胞色素基因片段dsRNA合成所需模板制備。

基于測序獲得的飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶基因的DNA序列SEQ ID NO：1，采用Oligo軟件設(shè)計一對合成dsRNA所需引物；序列taatacgactcactatagggTATGAAATGGGTCTTGGGGA(SEQ ID NO:5)和taatacgactcactatagggGGGTGCTTCTTCGTTGACTC(SEQ ID NO:6)所示分別為dsRNA合成所需上下游引物(下劃線部分為T7啟動子)；將設(shè)計好的dsRNA引物送往生工生物工程(上海)股份有限公司。

將設(shè)計合成的用于合成dsRNA的所需引物(均含有T7啟動子序列)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得一段長度為519bp的片段；其DNA序列為SEQ ID NO：7所示的序列；經(jīng)過凝膠分離、純化后使用紫外酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，并作為dsRNA合成的模板。

2.飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶基因片段dsRNA的合成。

基于上述制備用于合成dsRNA的模板，采用T7RiboMAX^TM Express RNAi System(Promega)試劑盒，通過T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA。通過微量紫外分光光度計對合成好的dsRNA進(jìn)行定量，最終使其濃度達(dá)到1.0μg/μL，并將其保存于-20℃冰箱中備用。

實施例3：飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶基因片段dsRNA提升西維因?qū)︼w蝗死亡率。

1.飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶基因片段dsRNA的注射。

挑取100頭雌雄各半的3齡第2天若蟲，用于dsRNA注射。將注射dsGFP的3齡若蟲作為對照組，將dsCPR基因片段合成的dsRNA作為處理組。采用玻璃針將3μL(3μg/每只若蟲)的dsCPR注射入飛蝗腹部第二腹節(jié)，同時挑取相同數(shù)量的若蟲注射相同量的dsGFP。待注射完畢后，將兩組若蟲置于相同條件下(光照：黑暗時間＝14:10小時，溫度32±3℃，濕度50％)。飼喂足量的新鮮麥苗、燕麥、麥麩。

2.飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶基因mRNA的表達(dá)檢測。

將注射dsGFP和細(xì)胞色素P450還原酶基因片段dsRNA的飛蝗，繼續(xù)飼養(yǎng)24小時、48小時和72小時，并儲存于液氮中；采用TAKARA Trizol試劑盒提取RNA，并采用RevertAid^TMH Minus Reverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA；采用Real-time PCR技術(shù)檢測細(xì)胞色素P450還原酶基因和β-actin的mRNA表達(dá)，從而對細(xì)胞色素P450還原酶基因沉默效率進(jìn)行比較；結(jié)果顯示，以對照dsGFP組作為基準(zhǔn)，實驗組中的細(xì)胞色素P450還原酶的mRNA極度顯著降低p<0.01(圖2)。

3.注射細(xì)胞色素P450還原酶基因片段的dsRNA后，對細(xì)胞色素P450還原酶活力的影響。

將注射了dsGFP和細(xì)胞色素P450還原酶基因片段dsRNA的飛蝗，繼續(xù)飼養(yǎng)24小時和48小時，每1份蟲體添加10份pH＝7.8的磷酸緩沖液，玻璃勻漿器充分勻漿；蟲體勻漿液經(jīng)10,000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，獲得上清酶液，將950微升工作液(每毫升含0.45毫克細(xì)胞色素C)，與30微升上清酶液和100微升NADPH和20微升氰化鉀混合均勻，25℃條件下恒溫反應(yīng)；酶標(biāo)儀記錄550nm處吸光值的增加值，酶活力計算公式為：細(xì)胞色素450還原酶活力(單位/毫克)＝(550nm吸光度增加值/每分鐘×稀釋因子×1.1倍)/(21.1×樣品體積×樣品蛋白濃度)；結(jié)果如圖3所示，注射dsRNA后，飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶活性顯著下降。

4.注射細(xì)胞色素P450還原酶基因片段的dsRNA后，影響西維因?qū)?齡飛蝗的死亡率。

將注射dsGFP和細(xì)胞色素P450還原酶基因片段dsRNA后的飛蝗，繼續(xù)飼養(yǎng)24小時，在飛蝗腹部第三腹節(jié)，點滴3微升含有10微克每毫升的丙酮溶液和3微升含有15微克每毫升西維因的丙酮溶液，24小時后統(tǒng)計西維因?qū)︼w蝗的致死率；結(jié)果如圖4所示，注射細(xì)胞色素P450還原酶的dsRNA后可將西維因?qū)?齡飛蝗的致死率提高至1.73倍-2.3倍。

SEQUENCE LISTING

<110> 山西大學(xué)

<120> 一種飛蝗細(xì)胞色素P450還原酶基因dsRNA及其應(yīng)用

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2043

<212> DNA

<213> Locusta migratoria

<400> 1

atggaggcag aggcaggcaa cgagctgggc gcgcagccgc tggaggagga gccgctgctg 60

ggcgccgtcg acatcctgct gttggcagcc ctgctggcgc tcgccgtctg gtacctgcgc 120

agccgcaagg ccaagaagga ggcgcagctc aacgccttct ccaccaagtc ctacaccata 180

caaccgacgg ctatgacggc gcccgcctcg gaccagtcgt tcatccagaa gctgaagacg 240

tccgggcgca gcctggtggt gttctacggc agccagacgg gcaccgccga ggagttcgcc 300

gggcgcctcg ccaaggaggg cgcgcgctac cggctcaagg gcatggtcgc cgaccccgag 360

gagtgcgaca tggaagaact gacgagcctc aaagacatcc ccaactcgct ggcggtgttc 420

tgcatggcca cgtacggcga gggcgacccc acagacaacg ccatggagtt ctacgagtgg 480

ctgcagaacg gggaccccga cctctccggt ttaaactacg cggtatttgg gctgggcaat 540

aagacctatg agcactacaa tgaggtggca aagtacatcg ataagaggct ggaagatctt 600

ggcgcaacac gtgtctatga aatgggtctt ggggatgatg atgccaacat tgaagatgat 660

ttcattacat ggaaggatca gttttggcca gctgtatgtg aattctttgg catagagtcc 720

actggtgaag atgtcagtgt aagacagtat cggctcactg agcacgactc catttcctct 780

gataagatat acacagggga agttgcaagg ctgcattcac ttgcaaacca gagaccgcca 840

tatgatgcaa agaacccatt tcttgctcca gttaaagtca acaaagaact tcataaggct 900

ggtgatcgct catgtatgca tatagaattt gatattgagg gatccaaaat gagatatgat 960

tcaggtgacc atgtagctgt ataccccatg aatgatgaag ctcttgtcaa caggataggt 1020

gaactgttga atattgactt ggacactgtg ataacattga caaatactga tgaggagtca 1080

acgaagaagc acccgtttcc ttgtccctgt tcatatcgca cagctctgag gcattacttg 1140

gacatcactt ccaatccccg cactcacatt ttgaaggaac ttatagaata tactaaggat 1200

ccacaggaac aagagaaact taagctcatg tcaagcacat ctcctgaagg aaagtcatta 1260

tacaatcaat ggataattaa agataaccgt aatattgtcc atatactgga agatctaccc 1320

tcctgtaagc ctgctctgga ccatttgtgt gaattgcttc cccggctgca ggcgagatac 1380

tactccattt cgtcatctcc aaaggtgtat ccaaattcag tgcatgtgac agcagtgtta 1440

gtggattaca cgacacctac tggccggcac aacaagggtg ttgcaacaag ttggctgaag 1500

aagaagcaac caaaggaaga ttttacacct actactccaa tctacattag aagatcacag 1560

ttcaggttgc caacaagaac tcagacccca attataatga tcgggccagg gacaggactg 1620

gcacctttcc gtggatttat tcaagaacga catctttcaa gaaaagaagg taagccagtt 1680

ggtgatacca tattatactt tggatgccgt aaaaagtctg aagattttat ttatcaagag 1740

gaactggaac agtatgccaa tgaaggtaca cttaagatgt atgttgcatt ctcaagagac 1800

caagcagaga aagtgtatgt tacccacctg ctacaaaaga acaaagatga aatctggaat 1860

atcattggag aaaacaatgg tcacttatat gtttgtggtg atgcaaaaaa tatggcacgt 1920

gatgtgcatg acattgttgt gaaagttgta atggaaaaag gaaatatgtc ggaatcggaa 1980

gccatggcct atgtgaagaa gatggagaac cagaaaagat attcttcaga tgtatggagc 2040

tga 2043

<210> 2

<211> 680

<212> PRT

<213> Locusta migratoria

<400> 2

Met Glu Ala Glu Ala Gly Asn Glu Leu Gly Ala Gln Pro Leu Glu Glu

1 5 10 15

Glu Pro Leu Leu Gly Ala Val Asp Ile Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu

20 25 30

Ala Leu Ala Val Trp Tyr Leu Arg Ser Arg Lys Ala Lys Lys Glu Ala

35 40 45

Gln Leu Asn Ala Phe Ser Thr Lys Ser Tyr Thr Ile Gln Pro Thr Ala

50 55 60

Met Thr Ala Pro Ala Ser Asp Gln Ser Phe Ile Gln Lys Leu Lys Thr

65 70 75 80

Ser Gly Arg Ser Leu Val Val Phe Tyr Gly Ser Gln Thr Gly Thr Ala

85 90 95

Glu Glu Phe Ala Gly Arg Leu Ala Lys Glu Gly Ala Arg Tyr Arg Leu

100 105 110

Lys Gly Met Val Ala Asp Pro Glu Glu Cys Asp Met Glu Glu Leu Thr

115 120 125

Ser Leu Lys Asp Ile Pro Asn Ser Leu Ala Val Phe Cys Met Ala Thr

130 135 140

Tyr Gly Glu Gly Asp Pro Thr Asp Asn Ala Met Glu Phe Tyr Glu Trp

145 150 155 160

Leu Gln Asn Gly Asp Pro Asp Leu Ser Gly Leu Asn Tyr Ala Val Phe

165 170 175

Gly Leu Gly Asn Lys Thr Tyr Glu His Tyr Asn Glu Val Ala Lys Tyr

180 185 190

Ile Asp Lys Arg Leu Glu Asp Leu Gly Ala Thr Arg Val Tyr Glu Met

195 200 205

Gly Leu Gly Asp Asp Asp Ala Asn Ile Glu Asp Asp Phe Ile Thr Trp

210 215 220

Lys Asp Gln Phe Trp Pro Ala Val Cys Glu Phe Phe Gly Ile Glu Ser

225 230 235 240

Thr Gly Glu Asp Val Ser Val Arg Gln Tyr Arg Leu Thr Glu His Asp

245 250 255

Ser Ile Ser Ser Asp Lys Ile Tyr Thr Gly Glu Val Ala Arg Leu His

260 265 270

Ser Leu Ala Asn Gln Arg Pro Pro Tyr Asp Ala Lys Asn Pro Phe Leu

275 280 285

Ala Pro Val Lys Val Asn Lys Glu Leu His Lys Ala Gly Asp Arg Ser

290 295 300

Cys Met His Ile Glu Phe Asp Ile Glu Gly Ser Lys Met Arg Tyr Asp

305 310 315 320

Ser Gly Asp His Val Ala Val Tyr Pro Met Asn Asp Glu Ala Leu Val

325 330 335

Asn Arg Ile Gly Glu Leu Leu Asn Ile Asp Leu Asp Thr Val Ile Thr

340 345 350

Leu Thr Asn Thr Asp Glu Glu Ser Thr Lys Lys His Pro Phe Pro Cys

355 360 365

Pro Cys Ser Tyr Arg Thr Ala Leu Arg His Tyr Leu Asp Ile Thr Ser

370 375 380

Asn Pro Arg Thr His Ile Leu Lys Glu Leu Ile Glu Tyr Thr Lys Asp

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Pro Gln Glu Gln Glu Lys Leu Lys Leu Met Ser Ser Thr Ser Pro Glu

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Gly Lys Ser Leu Tyr Asn Gln Trp Ile Ile Lys Asp Asn Arg Asn Ile

420 425 430

Val His Ile Leu Glu Asp Leu Pro Ser Cys Lys Pro Ala Leu Asp His

435 440 445

Leu Cys Glu Leu Leu Pro Arg Leu Gln Ala Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser

450 455 460

Ser Ser Pro Lys Val Tyr Pro Asn Ser Val His Val Thr Ala Val Leu

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Val Asp Tyr Thr Thr Pro Thr Gly Arg His Asn Lys Gly Val Ala Thr

485 490 495

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Pro Ile Tyr Ile Arg Arg Ser Gln Phe Arg Leu Pro Thr Arg Thr Gln

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Thr Pro Ile Ile Met Ile Gly Pro Gly Thr Gly Leu Ala Pro Phe Arg

530 535 540

Gly Phe Ile Gln Glu Arg His Leu Ser Arg Lys Glu Gly Lys Pro Val

545 550 555 560

Gly Asp Thr Ile Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Lys Lys Ser Glu Asp Phe

565 570 575

Ile Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Gln Tyr Ala Asn Glu Gly Thr Leu Lys

580 585 590

Met Tyr Val Ala Phe Ser Arg Asp Gln Ala Glu Lys Val Tyr Val Thr

595 600 605

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Asn Asn Gly His Leu Tyr Val Cys Gly Asp Ala Lys Asn Met Ala Arg

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Asp Val His Asp Ile Val Val Lys Val Val Met Glu Lys Gly Asn Met

645 650 655

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