一種鹽膚木黃酮3?O?單氧酶編碼基因及其應用的制作方法

文檔序號：11722509閱讀：342來源：國知局

本發(fā)明屬于分子生物學領域，具體涉及鹽膚木rchf3m基因。

背景技術：

五倍子是一種重要的化工原料，是由半翅目hemiptera，蚜總科aphidoidea,癭綿科pemphigidae，倍蚜族melaphidini的五倍子蚜蟲生活在漆樹科anacardiaceae鹽膚木屬rhus的寄主植物上，刺激葉片組織增生而形成的蟲癭。中國五倍子利用有2000多年的歷史，古代主要用于中藥，現代廣泛用于化工、醫(yī)藥、紡織、食品等行業(yè)，具有重要的經濟價值。鹽膚木rhuschinensis是角倍蚜schlechtendaliachinensis的主要寄主，角倍是角倍蚜在寄生在鹽膚木上形成的蟲癭，是我國主要的五倍子種類之一，其產量占我國五倍子總產量的70%以上。

角倍的主要活性成分是單寧，單寧（tannins）又稱單寧酸、鞣質，是植物體內一大類多酚黃酮化合物，單寧的生物合成途徑已基本明確,主要是通過莽草酸途徑合成,即由莽草酸途徑形成苯丙氨酸，再經一系列反應后最終形成單寧。許多植物中黃酮生物合成途徑中關鍵酶基因的生化功能已經得到驗證，關鍵酶包括黃酮3-o-單氧酶、花青素3-o-葡糖基轉移酶、無花色素還原酶（lar），花色素還原酶（anr），二氫黃酮醇4-還原酶（dfr）、查兒酮合成酶（chs）和查兒酮異構酶（chi）等。黃酮3-o-單氧酶在角倍的單寧合成過程中起到至關重要的調節(jié)作用，所以，鹽膚木黃酮3-o-單氧酶的表達水平對其產生角倍的單寧含量起著重要的調節(jié)作用，黃酮3-o-單氧酶基因是控制植物黃酮3-o-單氧酶表達的遺傳基礎。只有找到鹽膚木黃酮3-o-單氧酶的基因，才能對鹽膚木進行遺傳改良，從而提高角倍中單寧含量。

技術實現要素：

為解決上述問題，本發(fā)明通過對鹽膚木進行接種，并定期收集不同發(fā)育階段的蟲癭分別提取rna，通過轉錄組測序分析、基因注釋、kegg數據庫比對等步驟，得到了鹽膚木單寧合成關鍵基因rchf3m（序列1、2），并采用qpcr技術對rchf3m基因進行驗證（表2，圖1），具體技術方案如下：

1、樣本收集與處理

將五倍子蚜蟲放于鹽膚木上（rhuschinensismill），五倍子蚜蟲刺激葉翅產生角倍，定期收集生長于鹽膚木葉翅上不同生長時期的角倍，每次收集的角倍清除角倍內所有蚜蟲后分為兩部分保存，一部分冷凍保存，用于提取總rna，另一部分用于測定單寧含量。

2、測序及轉錄組分析

提取去除蚜蟲后的五倍子的總rna，檢測rna質量及純度后進行rna轉錄組測序，序列經閱讀質量分析、統計學比對分析、測序飽和度分析、參考基因讀取分布及參考基因組讀取分布分析后得到高質量鹽膚木轉錄組序列。

3、基因注釋與篩選

拼接得到的所有功能基因都分別注釋到ncbi數據庫中的nr數據庫、nt數據庫及swiss-prot數據庫、kegg數據庫、cog數據庫、go數據庫中，得到與鹽膚木單寧合成通路相關基因，并結合基因表達量與單寧含量同步一致性，最終篩選出鹽膚木單寧合成的關鍵基因rchf3m（dna序列及其對應的蛋白質序列如序列3所示）。

4、基因表達量驗證

為了驗證rchf3m基因，將rchf3m基因做實時熒光定量（qpcr）分析，采用相對定量方法分析rchf3m基因相對表達量(圖1)。

附圖說明

圖1為鹽膚木rhuschinensis5個不同發(fā)育時期單寧含量；

圖2為鹽膚木rchf3m基因qpcr相對定量結果；

圖3為鹽膚木rchf3m基因qpcr相對表達量驗證結果；圖中縱坐標rchf3m基因qpcr相對表達量，橫坐標為鹽膚木發(fā)育的5個不同時間點（從6月21-8月28日）；

圖4為鹽膚木不同發(fā)育時期單寧含量動態(tài)變化圖；圖中縱坐標為單寧含量（單寧占鹽膚木倍子重量的百分數），橫坐標為鹽膚木發(fā)育的5個不同時間點（從6月21-8月28日），5個時間點鹽膚木分別進行rna轉錄組測序分析。

具體實施方式

1、樣本收集

五倍子蚜蟲飼養(yǎng)于中國西南生態(tài)研究中心資源昆蟲研究所中的鹽膚木上（rhuschinensismill）。每隔十五天收集一次生長于鹽膚木葉翅上不同生長時期的角倍，共計8次。每次收集的角倍清除角倍內所有蚜蟲后分為兩部分保存，一部分先以液氮凍存，隨后移入?80°c冰箱中以便提取總rna，另一部分用于單寧含量的測定。

2、測序及轉錄組分析

去除蚜蟲后的五倍子以通用植物總rna提取試劑盒（離心柱型）（百泰克，中國）提取總rna。以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提總rna質量。以nanophotometer?分光光度計(implen,ca,usa)檢測純度，以核糖核酸6000納米盒(agilenttechnologies,ca,usa)檢測rna完整度。以打斷后的mrna為模板，隨機六聚體引物合成一鏈cdna，然后配制雙鏈合成反應體系合成雙鏈cdna。合成的雙鏈cdna以qiaquickpcrextractionkit純化，經過磁珠純化、粘性末端修復、3’末端加堿基a、加測序接頭后，進行pcr擴增，從而完成整個文庫制備工作。

去除含接頭的片段，其余所需片段以瓊脂糖凝膠電泳純化并進行pcr擴增。每個擴增樣品以nebnext?ultra?directionalrnalibraryprep試劑盒進行測序(neb,usa)，所得基因代碼整合為測序文庫。整合后，文庫以illuminahiseqtm2000測序平臺雙向測序。最后，構建好的文庫以ampurexp體系純化并以安捷倫生物分析儀2100系統(agilenttechnologies,ca,usa)檢測。經測序儀讀取后，將去除含n（表示無法確定堿基信息）比例大于10%及低質量的片段(質量值q≤5的堿基數占整條read的50％以上)。

轉錄組序列拼接時將trinity2軟件中的min_kmer_cov選項設置為2，其余所有參數均為默認值。序列經閱讀質量分析、統計學比對分析、測序飽和度分析、參考基因讀取分布及參考基因組讀取分布分析后得到。

3、基因注釋

拼接得到的所有功能基因都分別注釋到ncbi數據庫中的nr數據庫、nt數據庫及swiss-prot數據庫、kegg數據庫、cog數據庫、go數據庫中?；虮磉_水平為每條基因堿基讀取比對到參考基因圖譜上的堿基數量，以rpkm表示1，rpkm值的大小反映了基因表達的豐度。將rpkm>0.3設為基因顯著表達閾值。fpkm法能消除基因長度和測序量差異對計算基因表達量的影響，計算得到的基因表達量可直接用于比較不同樣品間的基因差異表達。

4、實時熒光定量分析

為了驗證rna分析結果，實時熒光定量采用icycler熒光實時檢測系統(bio-rad,hercules,ca)，采用相對定量方法分析各目的基因相對表達量。反應體系均為25ul，其中，每個反應體系中包含以1/40(v/v)稀釋過的的模板cdna2ul，及終濃度各為0.5mm的上下游引物。實時熒光定量反應條件為：95°c，5分鐘；95°c，20秒；62°c，45秒；45個循環(huán)。最后，以熔解曲線檢測擴增特異性，熔解曲線反應條件為：變性后樣品冷卻至55°c，然后以每10秒升高0.5°c為1個循環(huán)，重復80個循環(huán)，直至95°c。pcr產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，隨后純化擴增產物并測序，驗證有效擴增。以actin為內參基因校準模板濃度。每個處理重復三次。

序列1.鹽膚木rchf3m基因序列（996bp）

ttcagacatagcccattctaaggcagtagctgcggtatccgttgctccaaatatgagatc60

ctgtgtcatgcccttaactctattacacgttagcttatcatcaagattggtatcatcatc120

agctagctgcaatagtaaatccaccatgtcttttggcacaaaattatcccccaatgcttc180

cctgttagctttgtgttcatcaaatatgtgctcataaaatggatcaagtcttttctttaa240

ggccttcattcgcttcacatatccttgcaggtccaagaaatccagccacggaatccaatc300

cccaatattcagcactccactgagcaagaacaactcacctaacatctcttgaaactcttc360

aagtgtcacacccgatgtttcatattttgagtcttctgactcactaaagtacttcttacc420

caacacaattctgcttataatgctgagggtaacgcgtgagagatgatctttaagcacagt480

tggcttccccgaacaggcatacaggcgagatataaagtctcgtatttcttcaacacgaat540

gtactcgtaagactcgagtcgttttgaactaaatagctctgtgaggtaaattttacggcc600

tcggcgccaatatggtccataaggagcccacaaaatatctgagttgttaaaagctatgaa660

cttgcctgctgcagtttgaggtctggaagcaaagatatgatcatgtgtcttgagaaaaag720

cttagccatttctggagaagaggcaacaacaagagagaaagagccaatcttgagttgcat780

tatttctccatatttttgggatagtttgtgaaaagattggtgagggagtggaccgatgag840

atgaaggttgccgataataggccacggtttaggacctggtggaaattttcgtgggtggcg900

ccacgaagatgagatttttctgaggaaggctatggcagctagccatgccaggcctaaaat960

aacccaagaaacagcttccattgtattagtgttgtg996

序列2.鹽膚木黃酮3-o-單氧酶氨基酸序列（由轉錄組所得序列的反義鏈翻譯得到）

metglualavalsertrpvalileleuglyleualatrpleuala

151015

alailealapheleuarglysilesersersertrparghispro

202530

arglyspheproproglyprolysprotrpproileileglyasn

354045

leuhisleuileglyproleuprohisglnserphehislysleu

505560

serglnlystyrglygluilemetglnleulysileglyserphe

657075

serleuvalvalalaserserproglumetalalysleupheleu

808590

lysthrhisasphisilephealaserargproglnthralaala

95100105

glylyspheilealapheasnasnseraspileleutrpalapro

110115120

tyrglyprotyrtrpargargglyarglysiletyrleuthrglu

125130135

leupheserserlysargleuglusertyrglutyrileargval

140145150

glugluileargasppheileserargleutyralacyssergly

155160165

lysprothrvalleulysasphisleuserargvalthrleuser

170175180

ileileserargilevalleuglylyslystyrphesergluser

185190195

gluaspserlystyrgluthrserglyvalthrleuglugluphe

200205210

glnglumetleuglygluleupheleuleuserglyvalleuasn

215220225

ileglyasptrpileprotrpleuasppheleuaspleuglngly

230235240

tyrvallysargmetlysalaleulyslysargleuaspprophe

245250255

tyrgluhisilepheaspgluhislysalaasnargglualaleu

260265270

glyaspasnphevalprolysaspmetvalaspleuleuleugln

275280285

leualaaspaspaspthrasnleuaspasplysleuthrcysasn

290295300

argvallysglymetthrglnaspleuilepheglyalathrasp

305310315

thralaalathralaleuglutrpalametserglu

320325

序列3.鹽膚木rchf3m基因堿基序列與編碼氨基酸序列的對應圖

cacaacactaatacaatggaagctgtttcttgggttattttaggcctg48

metglualavalsertrpvalileleuglyleu

1510

gcatggctagctgccatagccttcctcagaaaaatctcatcttcg93

alatrpleualaalailealapheleuarglysileserserser

152025

tggcgccacccacgaaaatttccaccaggtcctaaaccgtggcct138

trparghisproarglyspheproproglyprolysprotrppro

303540

attatcggcaaccttcatctcatcggtccactccctcaccaatct183

ileileglyasnleuhisleuileglyproleuprohisglnser

455055

tttcacaaactatcccaaaaatatggagaaataatgcaactcaag228

phehislysleuserglnlystyrglygluilemetglnleulys

606570

attggctctttctctcttgttgttgcctcttctccagaaatggct273

ileglyserpheserleuvalvalalaserserproglumetala

758085

aagctttttctcaagacacatgatcatatctttgcttccagacct318

lysleupheleulysthrhisasphisilephealaserargpro

9095100

caaactgcagcaggcaagttcatagcttttaacaactcagatatt363

glnthralaalaglylyspheilealapheasnasnseraspile

105110115

ttgtgggctccttatggaccatattggcgccgaggccgtaaaatt408

leutrpalaprotyrglyprotyrtrpargargglyarglysile

120125130

tacctcacagagctatttagttcaaaacgactcgagtcttacgag453

tyrleuthrgluleupheserserlysargleuglusertyrglu

135140145

tacattcgtgttgaagaaatacgagactttatatctcgcctgtat498

tyrileargvalglugluileargasppheileserargleutyr

150155160

gcctgttcggggaagccaactgtgcttaaagatcatctctcacgc543

alacysserglylysprothrvalleulysasphisleuserarg

165170175

gttaccctcagcattataagcagaattgtgttgggtaagaagtac588

valthrleuserileileserargilevalleuglylyslystyr

180185190

tttagtgagtcagaagactcaaaatatgaaacatcgggtgtgaca633

pheserglusergluaspserlystyrgluthrserglyvalthr

195200205

cttgaagagtttcaagagatgttaggtgagttgttcttgctcagt678

leugluglupheglnglumetleuglygluleupheleuleuser

210215220

ggagtgctgaatattggggattggattccgtggctggatttcttg723

glyvalleuasnileglyasptrpileprotrpleuasppheleu

225230235

gacctgcaaggatatgtgaagcgaatgaaggccttaaagaaaaga768

aspleuglnglytyrvallysargmetlysalaleulyslysarg

240245250

cttgatccattttatgagcacatatttgatgaacacaaagctaac813

leuaspprophetyrgluhisilepheaspgluhislysalaasn

255260265

agggaagcattgggggataattttgtgccaaaagacatggtggat858

argglualaleuglyaspasnphevalprolysaspmetvalasp

270275280

ttactattgcagctagctgatgatgataccaatcttgatgataag903

leuleuleuglnleualaaspaspaspthrasnleuaspasplys

285290295

ctaacgtgtaatagagttaagggcatgacacaggatctcatattt948

leuthrcysasnargvallysglymetthrglnaspleuilephe

300305310

ggagcaacggataccgcagctactgccttagaatgggctatgtctgaa996

glyalathraspthralaalathralaleuglutrpalametserglu

315320325。