本發(fā)明涉及天然產(chǎn)物提取技術(shù)領域，尤其涉及一種利用氯化氨溶液從螺旋藻中提取藻藍蛋白的方法。

背景技術(shù)：

藻藍蛋白(phycocyanin，PC)是一種存在于藍藻細胞內(nèi)的光合色素，能高效捕獲光能。因其水溶性、無毒、清亮且著色力強等優(yōu)點，藻藍蛋白被廣泛用于食品著色劑和化妝品的添加劑。藻藍蛋白帶有熒光，可用作熒光標記物。藻藍蛋白在抗腫瘤和提高機體免疫力方面有明顯療效。

現(xiàn)有涉及藻藍蛋白提取純化方法中，藻藍蛋白分離純化過程主要包括使用低溫(-20℃～-10℃)反復凍融方法或冰粉(-50℃～-10℃)破除螺旋藻的細胞壁，加入磷酸鹽緩沖液分離提取藻藍蛋白粗提物，使用冷凍高速離心方法進行固液分離，獲得上清液加入硫酸銨溶液鹽析沉淀，脫鹽過大孔樹脂柱或色譜柱進一步純化，洗脫液脫鹽處理后經(jīng)過凍干或者噴霧干燥獲得高純度的藻藍蛋白粉。上述工藝主要的問題在于工藝路線長，大部分過程需要在低溫處理能耗高，提取周期長，造成生產(chǎn)效率太低，成本過高，生產(chǎn)應用價值不高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種利用氯化氨溶液從螺旋藻中提取藻藍蛋白的方法。本發(fā)明提供的方法無需低溫處理，工藝簡單，通過氯化氨溶液快速分離提取藻藍蛋白工藝，提取收率高，藻藍蛋白純度(A₆₂₀/A₂₈₀)可達3.8以上。

本發(fā)明提供了一種利用氯化氨溶液從螺旋藻中提取藻藍蛋白的方法，包括以下步驟：

1)將螺旋藻進行酶解破壁，得到破壁螺旋藻；

2)將所述破壁螺旋藻與氯化銨溶液混合，將藻藍蛋白萃取到氯化銨溶液中，超濾得到藻藍蛋白上清液；

3)采用磷酸銨溶液對所述藻藍蛋白上清液進行鹽析，將得到的鹽析產(chǎn)物脫鹽后干燥，得到藻藍蛋白。

優(yōu)選的是，所述螺旋藻在光反應器培養(yǎng)得到，所述酶解破壁前將培養(yǎng)得到的螺旋藻進行陶瓷膜過濾；

所述陶瓷膜過濾的溫度為20～30℃，切向流速為3～5m/s，過膜壓力為0.6～0.9bar。

優(yōu)選的是，所述步驟1)酶解破壁用酶為復合酶，所述復合酶包括纖維素酶、果膠酶和溶菌酶；所述酶解時間為3～5h，所述酶解溫度為30～40℃。

優(yōu)選的是，所述步驟2)破壁螺旋藻與氯化銨溶液的體積比為1∶(2～3)；所述氯化銨溶液的濃度為0.05～0.1mol/L，pH值為7～8。

優(yōu)選的是，所述步驟2)萃取包括攪拌過程，所述攪拌的時間為4～6h，轉(zhuǎn)速為50～80rpm。

優(yōu)選的是，所述步驟2)的超濾采用直徑為0.4～0.1μm的超濾膜進行。

優(yōu)選的是，所述步驟3)鹽析過程中藻藍蛋白上清液與磷酸銨溶液的體積比為1∶(2～3)；所述磷酸氨溶液的濃度為0.1～0.5mol/L，pH值為4.0～4.5；所述鹽析的溫度為15～20℃。

優(yōu)選的是，所述步驟3)的鹽析反應進行攪拌，所述攪拌的反應時間為1～2h，轉(zhuǎn)速為20～30rpm。

優(yōu)選的是，所述步驟3)脫鹽方法包括：將鹽析后的藻藍蛋白沉淀加入氯化銨溶液中溶解沉淀，過分子量為1×10⁵～5×10⁵的超濾膜濃縮除去磷酸鹽和銨鹽離子。

優(yōu)選的是，所述步驟3)中的干燥為噴霧干燥。

本發(fā)明提供了一種利用氯化氨溶液從螺旋藻中提取藻藍蛋白的方法。復合酶進行酶解破壁處理在不破壞藻藍蛋白穩(wěn)定性情況下可常溫快速實現(xiàn)螺旋藻的破壁，破壁率可達98％以上；氯化銨溶液經(jīng)過一步萃取，結(jié)合超濾過程即可獲得高純度藻藍蛋白，純度可達2.0以上；采用磷酸銨溶液對所述藻藍蛋白上清液進行鹽析，將得到的鹽析產(chǎn)物脫鹽后干燥得到的藻藍蛋白純度達3.8以上，回收率可達95％以上。本發(fā)明提供的方法無需低溫處理，工藝簡單，通過氯化氨溶液快速分離提取藻藍蛋白工藝，提取收率高。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種利用氯化氨溶液從螺旋藻中提取藻藍蛋白的方法，包括以下步驟：

1)將螺旋藻進行酶解破壁，得到破壁螺旋藻；

2)將所述破壁螺旋藻與氯化銨溶液混合，將藻藍蛋白萃取到氯化銨溶液中，超濾得到藻藍蛋白上清液；

3)采用磷酸銨溶液對所述藻藍蛋白上清液進行鹽析，將得到的鹽析產(chǎn)物脫鹽后干燥，得到藻藍蛋白。

本發(fā)明將螺旋藻進行酶解破壁，得到破壁螺旋藻。在本發(fā)明中，所述螺旋藻優(yōu)選為鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)。在本發(fā)明中，所述螺旋藻由螺旋藻藻種在光反應器培養(yǎng)得到，所述酶解前將培養(yǎng)得到的螺旋藻進行陶瓷膜過濾；本發(fā)明對所述螺旋藻藻種的來源沒有特殊的限定，采用本領域技術(shù)人員熟知的螺旋藻藻種市售產(chǎn)品即可。本發(fā)明對所述螺旋藻培養(yǎng)的方法沒有特殊的限定，采用本領域技術(shù)人員熟知的由螺旋藻藻種培養(yǎng)得到螺旋藻的常規(guī)方法即可。在本發(fā)明中，所述陶瓷膜過濾的溫度為25～35℃，所述溫度包括過濾過程中液體和膜的溫度，所述過濾的切向流速為3～5m/s，過膜壓力為0.6～0.9bar。在本發(fā)明中，所述陶瓷膜過濾的條件更優(yōu)選溫度為28℃，切向流速為4m/s，過膜壓力為0.8bar。本發(fā)明所述濃縮優(yōu)選將螺旋藻濃縮至質(zhì)量濃度為50～60％，更優(yōu)選為55％。在本發(fā)明中，所述陶瓷膜的孔徑優(yōu)選為0.1～2μm，更優(yōu)選為1μm。

本發(fā)明酶解的目的為破除螺旋藻的細胞壁，在本發(fā)明中，酶解破壁用酶為復合酶，所述復合酶包括纖維素酶、果膠酶和溶菌酶。在本發(fā)明中，所述纖維素酶酶活優(yōu)選為1200～1800U/g，更優(yōu)選為1500U/g；果膠酶酶活優(yōu)選為800～1200U/g，更優(yōu)選為1000U/g；溶菌酶酶活優(yōu)選為1200～1800U/g，更優(yōu)選為1500U/g；在本發(fā)明中，所述纖維素酶、果膠酶和溶菌酶的質(zhì)量比優(yōu)選為1∶2∶1，所述復合酶總添加量優(yōu)選為0.01～0.05％，更優(yōu)選為0.03％；所述酶解時間為3～5h，更優(yōu)選為4h，所述破壁溫度30～40℃，更優(yōu)選為35℃；所述酶解過程進行攪拌，所述攪拌的轉(zhuǎn)速為50～80rpm，更優(yōu)選為60～70rpm。在本發(fā)明中，所述酶解過程優(yōu)選反應至螺旋藻破壁率達到95％以上，更優(yōu)選為98％以上。

得到破壁螺旋藻后，本發(fā)明將所述破壁螺旋藻與氯化銨溶液混合，將藻藍蛋白萃取到氯化銨溶液中，超濾得到藻藍蛋白上清液。在本發(fā)明中，所述破壁螺旋藻與氯化銨溶液的體積比為1∶(2～3)，更優(yōu)選為1∶2.5；所述氯化銨溶液的濃度為0.05～0.1mol/L，優(yōu)選為0.08mol/L，pH值為7～8，優(yōu)選為7.5。

在本發(fā)明中，所述萃取包括攪拌過程，所述攪拌的時間為4～6h，優(yōu)選為5h，轉(zhuǎn)速為50～80rpm，優(yōu)選為60～70rpm。

在本發(fā)明中，所述步驟2)的超濾采用直徑為0.4～0.1μm，更優(yōu)選為0.6μm的超濾膜進行。

得到藻藍蛋白上清液后，本發(fā)明采用磷酸銨溶液對所述藻藍蛋白上清液鹽析，將得到的鹽析產(chǎn)物脫鹽后干燥，得到藻藍蛋白。

在本發(fā)明中，所述鹽析過程中藻藍蛋白上清液與磷酸銨溶液的體積比為1∶(2～3)，更優(yōu)選為1∶2.2；所述磷酸氨溶液的濃度為0.1～0.5mol/L，更優(yōu)選為0.2mol/L，pH值為4.0～4.5，更優(yōu)選為4.2；所述鹽析的溫度為15～20℃，更優(yōu)選為18℃。

在本發(fā)明中，所述步驟3)的鹽析反應進行攪拌，所述攪拌的反應時間為1～2h，轉(zhuǎn)速為20～30rpm，更優(yōu)選為1.5h，轉(zhuǎn)速25rpm。

在本發(fā)明中，所述步驟3)脫鹽方法包括：將鹽析后的藻藍蛋白沉淀加入氯化銨溶液中溶解沉淀，過分子量為1×10⁵～5×10⁵，更優(yōu)選為3×10⁵的超濾膜濃縮除去磷酸鹽和銨鹽離子。在本發(fā)明中，所述氯化銨溶液的濃度為0.05～0.1mol/L，優(yōu)選為0.08mol/L，pH值為7～8，優(yōu)選為7.5。

在本發(fā)明中，所述步驟3)中的干燥為噴霧干燥。本發(fā)明在進行噴霧干燥過程時，優(yōu)選加入保護劑，所述保護劑的加入能夠提高藻藍蛋白的回收率和噴霧干燥的效率，所述保護劑優(yōu)選為海藻糖、β-環(huán)糊精和多孔淀粉中的一種或多種，所述保護劑的添加質(zhì)量百分比優(yōu)選為0.1～1％，更優(yōu)選為0.3～0.8％。在本發(fā)明中，所述噴霧干燥的條件具體優(yōu)選為入塔風溫為80～120℃，更優(yōu)選為100℃，通氣量為：800～1200L/h，更優(yōu)選為1100L/h。

下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明提供的一種利用氯化氨溶液從螺旋藻中提取藻藍蛋白的方法進行詳細的描述，但是不能將它們理解為對本申請保護范圍的限定。

實施例1

螺旋藻的培養(yǎng)和收集：

1)制備用于螺旋藻培養(yǎng)的人工海水培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的組成：12.0g/L NaHCO₃，4.03g/L Na₂CO₃，0.4g/L K₂HPO₄，2.5g/L NaNO₃，1.25g/L K₂SO₄，1.25g/L NaCl，0.25g/L MgSO₄·2H₂O，0.05g/L CaCl₂·2H₂O，0.01g/L FeSO₄·7H₂O，0.08g/L EDTA。將螺旋藻接種培養(yǎng)在100L鼓泡管式光照反應器中，培養(yǎng)基pH值維持在9.0，培養(yǎng)溫度控制在30℃，持續(xù)通入濃度2.0％CO₂，采用LED光源光照強度控制在100lux，光照和暗培養(yǎng)時間分別為12小時交替培養(yǎng)8天，螺旋藻密度可達20g/L。收獲菌體。

2)高密度培養(yǎng)的螺旋藻培養(yǎng)液通過連續(xù)分離的管式陶瓷膜(膜孔徑為0.1μm)將菌體和培養(yǎng)液分離，除去菌體的培養(yǎng)液繼續(xù)回流到光照反應器中，添加1/4新鮮培養(yǎng)基同時接種螺旋藻藻種，按照步驟1)的培養(yǎng)條件進行重復培養(yǎng)。收集濃縮含螺旋藻的菌液待進行破壁處理。

螺旋藻的酶解破壁：

1)向收集合55％的螺旋藻的菌液中加入0.03％的1500U/g纖維素酶，1000U/g果膠酶和1500U/g溶菌酶的混合物(質(zhì)量比為1∶2∶1)。在35℃溫度下攪拌處理4hr，轉(zhuǎn)速控制在65rpm，待螺旋藻破壁率達到98％以上，得到破壁螺旋藻，備用。

氯化銨溶液萃取藻藍蛋白：

在破壁的螺旋藻中加入2倍體積0.08M氯化氨溶液(pH7.2)，在提取罐中常溫下攪拌處理5hr，轉(zhuǎn)速控制在55rpm，藻藍蛋白萃取到含有氯化氨溶液的上清液中，然后通過0.1um超濾膜分離，得到藻藍蛋白上清液，提取收率可達98％以上，藻藍蛋白的純度可達(A₆₂₀/A₂₈₀)可達2.0以上；

藻藍蛋白鹽析沉淀純化：

提取液加入2倍體積的0.2M的磷酸銨(pH＝4)溶液緩慢攪拌處理1.5h，轉(zhuǎn)速控制在20-30rpm之間，溫度控制在25℃，獲得藻藍蛋白的鹽析沉淀，4500rpm離心收集藻藍蛋白的沉淀，使用0.1M氯化銨溶液(pH＝7)重新溶解沉淀，再經(jīng)過100,000-300,000分子量的超濾膜除去磷酸鹽和銨鹽離子。

藻藍蛋白的濃縮和干燥

將所得脫鹽溶液進一步經(jīng)過300,000分子量的超濾膜濃縮后，得到高濃度的藻藍蛋白液態(tài)產(chǎn)品，藻藍蛋白純度可達3.8以上。為了得到固態(tài)粉末藻藍蛋白，在液態(tài)藻藍蛋白中加入0.3％的β-環(huán)糊精和多孔淀粉(質(zhì)量比為1.5∶1)作為保護劑經(jīng)過噴霧干燥處理獲得藻藍蛋白的粉劑產(chǎn)品。獲得高純度的藥用級藻藍蛋白。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術(shù)領域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。