一種表達(dá)載體及其在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用的制作方法

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一種表達(dá)載體及其在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用的制作方法與工藝

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種表達(dá)載體及其在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

土壤鹽漬化是限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)全球性問(wèn)題，全世界鹽堿地的面積已達(dá)9.5億公頃，其中我國(guó)就有3665萬(wàn)公頃，而且由于耕地的次生鹽漬化，鹽漬土地面積還在不斷增加。我國(guó)鹽堿土壤的形成，大部分與土壤中碳酸鹽的積累有關(guān)，因此堿化程度普遍較高，嚴(yán)重的鹽堿土壤地區(qū)植物幾乎不能生存。隨著世界人口的急劇增加以及耕地面積的日益減少，開(kāi)發(fā)利用大面積存在的鹽堿地也變得愈發(fā)重要。

目前，人們主要通過(guò)以下兩種方式來(lái)開(kāi)發(fā)鹽堿地：一是通過(guò)合理灌溉、淡水沖洗、施用化學(xué)改良藥劑來(lái)改良土壤，為植物生長(zhǎng)創(chuàng)造適宜環(huán)境；二是培育耐鹽植物新品種以適應(yīng)鹽漬環(huán)境，達(dá)到開(kāi)發(fā)利用鹽堿地的目的。實(shí)踐證明，第一種方法成本高，效果也不理想，雖有一定進(jìn)展但也有其難以避免的缺點(diǎn)，比如土壤改良效果不持久、工程費(fèi)用昂貴、淡水沖洗同時(shí)流失土壤養(yǎng)分，以及淡水資源匱乏等。而培育耐鹽植物品種具有更為廣泛的應(yīng)用前景，也是開(kāi)發(fā)利用大面積的鹽漬土地資源的重要途徑之一。隨著植物耐鹽相關(guān)基因的發(fā)掘和植物基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)增強(qiáng)植物的耐鹽性越來(lái)越受到育種科研工作者的重視。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何培育抗逆性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了一種表達(dá)載體。

本發(fā)明所提供的表達(dá)載體，可包含表達(dá)盒甲和表達(dá)盒乙；所述表達(dá)盒甲依次可包括如下元件：?jiǎn)?dòng)子甲、編碼GhSOS1蛋白的核酸分子和終止序列甲；所述表達(dá)盒乙依次可包括如下元件：?jiǎn)?dòng)子乙、編碼GhNHX1蛋白的核酸分子和終止序列乙。

上述表達(dá)載體中，所述GhSOS1蛋白可為a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列5所示的蛋白質(zhì)；

a2)在a1)的N端和/或C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

a3)將序列表中序列5所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)；

上述表達(dá)載體中，所述GhNHX1蛋白可為b1)或b2)或b3)：

b1)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白質(zhì)；

b2)在b1)的N端和/或C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

b3)將序列表中序列4所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。

所述a3)或所述b3)中，所述“經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加”可為經(jīng)過(guò)10個(gè)以下氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

上述表達(dá)載體中，所述“編碼GhSOS1蛋白的核酸分子”可為如下c1)或c2)或c3)或c4)所示的DNA分子：

c1)編碼區(qū)如序列表中序列2所示的DNA分子；

c2)核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

c3)與c1)或(c2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述GhSOS1蛋白的DNA分子；

c4)在嚴(yán)格條件下與c1)或c2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述GhSOS1蛋白的DNA分子。

上述表達(dá)載體中，所述“編碼GhNHX1蛋白的核酸分子”可為如下d1)或d2)或d3)或d4)所示的DNA分子：

d1)編碼區(qū)如序列表中序列1所示的DNA分子；

d2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

d3)與d1)或(d2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述GhNHX1蛋白的DNA分子；

d4)在嚴(yán)格條件下與d1)或d2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述GhNHX1蛋白的DNA分子。

上述表達(dá)載體中，所述啟動(dòng)子甲或所述啟動(dòng)子乙可為CaMV 35S啟動(dòng)子。所述終止序列甲或所述終止序列乙可為NOS終止子。所述CaMV 35S啟動(dòng)子的核苷酸序列具體可如序列表中序列3自5’末端第1至835位所示。所述NOS終止子的核苷酸序列具體可如序列表中序列3自5’末端第2502至2754位所示。

上述表達(dá)載體中，所述表達(dá)盒甲的核苷酸序列具體可如序列表中序列6所示。所述表達(dá)盒乙的核苷酸序列具體可如序列表中序列3所示。

上述表達(dá)載體中，所述表達(dá)載體自5’末端至3’末端依次可包括所述表達(dá)盒甲和所述表達(dá)盒乙。

上述任一所述表達(dá)載體具體可為重組質(zhì)粒pBI121-GhNHX1-GhSOS1。所述重組質(zhì)粒pBI121-GhNHX1-GhSOS1是向載體pBI 121的限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI酶切位點(diǎn)之間插入核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子，限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切位點(diǎn)之間插入核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子得到的。

上述任一所述表達(dá)載體在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。

本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，可包括如下步驟：將上述任一所述的表達(dá)載體導(dǎo)入受體植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物；與所述受體植物相比，所述轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性增強(qiáng)。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了一種植物育種方法。

本發(fā)明所提供的植物育種方法，可包括如下步驟：增加植物中所述GhSOS1蛋白和所述GhNHX1蛋白的含量或活性，從而增強(qiáng)抗逆性。

上文中，所述抗逆性具體可為抗鹽性。

上文中，所述植物可為如下e1)至e5)中的任一種：e1)雙子葉植物；e2)單子葉植物；e3)十字花科植物；e4)擬南芥；e5)哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。

實(shí)驗(yàn)證明，將本發(fā)明構(gòu)建的重組質(zhì)粒pBI121-GhNHX1、重組質(zhì)粒pBI 121-GhSOS1、重組質(zhì)粒pBI121-GhNHX1-GhSOS1和載體pBI 121分別導(dǎo)入野生型擬南芥中，經(jīng)過(guò)篩選，依次得到T₃代純合轉(zhuǎn)GhNHX1基因擬南芥、T₃代純合轉(zhuǎn)GhSOS1基因擬南芥、T₃代純合轉(zhuǎn)GhNHX1基因和GhSOS1基因擬南芥、和、T₃代純合轉(zhuǎn)空載體擬南芥，然后播種于含250mM NaCl的MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行耐鹽性鑒定。結(jié)果表明，T₃代純合轉(zhuǎn)GhNHX1基因和GhSOS1基因擬南芥的發(fā)芽率顯著高于T₃代純合轉(zhuǎn)GhNHX1基因擬南芥和T₃代純合轉(zhuǎn)GhSOS1基因擬南芥，T₃代純合轉(zhuǎn)GhNHX1基因擬南芥和T₃代純合轉(zhuǎn)GhSOS1基因擬南芥的發(fā)芽率均顯著高于野生型擬南芥，野生型擬南芥和T₃代純合轉(zhuǎn)空載體擬南芥的發(fā)芽率無(wú)顯著差異。因此，采用本發(fā)明提供的表達(dá)載體可培育抗逆性顯著增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為重組質(zhì)粒pBI 121-GhNHX1的酶切鑒定結(jié)果。

圖2為重組質(zhì)粒pBI 121-GhSOS1的酶切鑒定結(jié)果。

圖3為重組質(zhì)粒pBI121-GhNHX1-GhSOS1的酶切鑒定結(jié)果。

圖4為擬南芥種子在MS固體培養(yǎng)基上的發(fā)芽率統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

圖5為擬南芥種子在含250mM NaCl的MS固體培養(yǎng)基上的發(fā)芽率統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

棉花品種中9807記載于如下文獻(xiàn)中：Wang X，Lu X，Wang J，Wang D，Yin Z，F(xiàn)an W，Wang S，Ye W.Mining and Analysis of SNP in Response to Sal inity Stress in Upland Cotton(Gossypium hirsutum L.).PLoS One.2016Jun 29；11(6)：e0158142.棉花品種中9807以下簡(jiǎn)稱中9807。

載體pBI 121記載于如下文獻(xiàn)中：Chen PY，Wang CK，Soong SC，To KY.Complete sequence of the binary vector pBI121and its appl ication in cloning T-DNA insertion from transgenic plants.Molecular Breeding.2003，17(4):287-293.

實(shí)施例1、表達(dá)載體的構(gòu)建

一、重組質(zhì)粒pBI 121-GhNHX1的構(gòu)建

1、提取中9807的葉片組織的總RNA，然后將該總RNA用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cDNA，即得到中9807葉片組織的cDNA。

2、以中9807葉片組織的cDNA為模板，以F1：

5’-CACGGGGGACTCTAGAATGGTGGCTCCGCAGTTAGC-3’和R1：

5’-GATCGGGGAAATTCGAGCTCTCATTGCCATTGAGGCAGAT-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1670bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1。

3、用限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI雙酶切載體pBI 121，回收約12.9kb的載體骨架1。

4、采用In-fusion HD Cloning Kit將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1和載體骨架1進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pBI 121-GhNHX1。

用限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI雙酶切重組質(zhì)粒pBI 121-GhNHX1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1(M為DNA Marker，泳道1-4均為重組質(zhì)粒pBI 121-GhNHX1)。結(jié)果表明，用限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI雙酶切重組質(zhì)粒pBI 121-GhNHX1，可獲得大小為1642bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果完全一致。

對(duì)重組質(zhì)粒pBI 121-GhNHX1進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pBI 121-GhNHX1進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：向載體pBI 121的限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI酶切位點(diǎn)之間插入核苷酸序列是序列表中的序列1所示的DNA分子。序列表中的序列1所示的DNA分子即為GhNHX1基因(Genebank號(hào)為：AF515632.2)的核苷酸序列，編碼序列表中序列4所示的GhNHX1蛋白。

二、重組質(zhì)粒pBI 121-GhSOS1的構(gòu)建

1、提取中9807的葉片組織的總RNA，然后將該總RNA用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cDNA，即得到中9807葉片組織的cDNA。

2、以中9807葉片組織的cDNA為模板，以F2：

5’-GGACTCTAGAGGATCCATGGAGGAAGTGAAAGAGT-3’和R2：

5’-GATCGGGGAAATTCGAGCTCTTAAGAAGCCTGGTGGAAT-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約3500bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2。

3、用限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI雙酶切載體pBI 121，回收約12.9kb的載體骨架1。

4、采用In-fusion HD Cloning Kit將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2和載體骨架1進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pBI 121-GhSOS1。

用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XbaI雙酶切重組質(zhì)粒pBI 121-GhSOS1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2(M為DNA Marker，泳道1-4均為重組質(zhì)粒pBI 121-GhSOS1)。結(jié)果表明，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XbaI雙酶切重組質(zhì)粒pBI 121-GhSOS1，可獲得大小為3742bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果完全一致。

對(duì)重組質(zhì)粒pBI 121-GhSOS1進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pBI 121-GhSOS1進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：向載體pBI 121的限制性內(nèi)切酶BamHI和Sac I酶切位點(diǎn)之間插入核苷酸序列是序列表中的序列2所示的DNA分子。序列表中的序列2所示的DNA分子即為GhSOS1基因(Genebank號(hào)為：KU994886.1)的核苷酸序列，編碼序列表中序列5所示的GhSOS1蛋白。

三、重組質(zhì)粒pBI121-GhNHX1-GhSOS1的構(gòu)建

1、以重組質(zhì)粒pBI 121-GhNHX1為模板，以F3：

5’-TATGTTACTAGATCGGGAATTCCCAGATTAGCCTTTTCAA-3’和R3：5’

-AAACGACGGCCAGTGAATTCCGATCTAGTAACATAG-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約2780bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3。

2、用限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切重組質(zhì)粒pBI 121-GhSOS1，回收約16.3kb的載體骨架2。

3、采用In-fusion HD Cloning Kit將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3和載體骨架2進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pBI121-GhNHX1-GhSOS1。

用限制性內(nèi)切酶HindⅢ酶切重組質(zhì)粒pBI121-GhNHX1-GhSOS1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3(M為DNA Marker，泳道1-7均為重組質(zhì)粒pBI121-GhNHX1-GhSOS1)。結(jié)果表明，用限制性內(nèi)切酶HindⅢ酶切重組質(zhì)粒pBI121-GhNHX1-GhSOS1，可獲得大小為2362bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果完全一致。

對(duì)重組質(zhì)粒pBI121-GhNHX1-GhSOS1進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pBI121-GhNHX1-GhSOS1進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：向載體pBI 121的限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI酶切位點(diǎn)之間插入核苷酸序列是序列表中的序列2所示的DNA分子，限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切位點(diǎn)之間插入核苷酸序列是序列表中的序列3所示的DNA分子。

重組質(zhì)粒pBI121-GhNHX1-GhSOS1具有兩個(gè)表達(dá)盒，分別命名為表達(dá)盒甲和表達(dá)盒乙。

表達(dá)盒甲的核苷酸序列如序列表中序列6所示，其中序列表中序列6的自5’末端第1至835位為CaMV 35S啟動(dòng)子的核苷酸序列，第854至4312位為GhSOS1基因的核苷酸序列，第4329至4581位為NOS終止子的核苷酸序列(用于終止轉(zhuǎn)錄)。

表達(dá)盒乙的核苷酸序列如序列表中序列3所示，其中序列表中序列3的自5’末端第1至835位為CaMV 35S啟動(dòng)子的核苷酸序列，第854至2485位為GhNHX1基因的核苷酸序列，第2502至2754位為NOS終止子的核苷酸序列(用于終止轉(zhuǎn)錄)。

實(shí)施例2、實(shí)施例1構(gòu)建的表達(dá)載體在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用

一、重組農(nóng)桿菌的獲得

1、將實(shí)施例1中步驟一制備的重組質(zhì)粒pBI 121-GhNHX1導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，得到重組農(nóng)桿菌，命名為L(zhǎng)BA4404/pBI 121-GhNHX1。

2、將實(shí)施例1中步驟二制備的重組質(zhì)粒pBI 121-GhSOS1導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，得到重組農(nóng)桿菌，命名為L(zhǎng)BA4404/pBI 121-GhSOS1。

3、將實(shí)施例1中步驟三制備的重組質(zhì)粒pBI121-GhNHX1-GhSOS1導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，得到重組農(nóng)桿菌，命名為L(zhǎng)BA4404/pBI121-GhNHX1-GhSOS1。

4、將載體pBI 121導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，得到重組農(nóng)桿菌，命名為L(zhǎng)BA4404/pBI121。

二、轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得

哥倫比亞生態(tài)型擬南芥為Arabidopsis Biological Resource Center的產(chǎn)品，詳見(jiàn)網(wǎng)址http://abrc.osu.edu/。在下文中，哥倫比亞生態(tài)型擬南芥簡(jiǎn)稱為野生型擬南芥。

1、采用擬南芥花序浸花轉(zhuǎn)化法(Clough SJ,Bent AF(1998)Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J 16:735–743.)，將步驟一中1制備的LBA4404/pBI 121-GhNHX1轉(zhuǎn)至野生型擬南芥中，獲得T₁代擬轉(zhuǎn)GhNHX1基因擬南芥的種子。

2、將T₁代擬轉(zhuǎn)GhNHX1基因擬南芥的種子種植于含50mg/L卡那霉素的MS固體培養(yǎng)基，能夠正常生長(zhǎng)的擬南芥(抗性苗)即為T₁代轉(zhuǎn)GhNHX1基因陽(yáng)性苗。T₁代轉(zhuǎn)GhNHX1基因陽(yáng)性苗收到的種子即為T₂代轉(zhuǎn)GhNHX1基因擬南芥的種子。

3、將步驟2篩選出的不同株系的T₂代轉(zhuǎn)GhNHX1基因擬南芥的種子播種于含50mg/L卡那霉素的MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，如果某株系中能夠正常生長(zhǎng)的擬南芥(抗性苗)的數(shù)目與不能夠正常生長(zhǎng)的擬南芥(非抗性苗)的數(shù)目比例為3：1，則該株系為GhNHX1基因插入一個(gè)拷貝的株系，該株系中的抗性苗收到的種子即為T₃代轉(zhuǎn)GhNHX1基因擬南芥的種子。

4、將步驟3篩選出的T₃代轉(zhuǎn)GhNHX1基因擬南芥的種子再次播種于含50mg/L卡那霉素的MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，均為抗性苗的即為T₃代純合轉(zhuǎn)GhNHX1基因擬南芥。隨機(jī)選擇一個(gè)T₃代純合轉(zhuǎn)GhNHX1基因擬南芥的株系命名為N，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

按照上述方法，將LBA4404/pBI 121-GhNHX1替換為L(zhǎng)BA4404/pBI 121-GhSOS1，其它步驟均相同，得到T₃代純合轉(zhuǎn)GhSOS1基因擬南芥。隨機(jī)選擇一個(gè)T₃代純合轉(zhuǎn)GhSOS1基因擬南芥的株系命名為S。

按照上述方法，將LBA4404/pBI 121-GhNHX1替換為L(zhǎng)BA4404/pBI121-GhNHX1-GhSOS1，其它步驟均相同，得到T₃代純合轉(zhuǎn)GhNHX1基因和GhSOS1基因的擬南芥。隨機(jī)選擇一個(gè)T₃代純合轉(zhuǎn)GhNHX1基因和GhSOS1基因擬南芥的株系命名為NS。

按照上述方法，將LBA4404/pBI 121-GhNHX1替換為L(zhǎng)BA4404/pBI121，其它步驟均相同，得到T₃代純合轉(zhuǎn)空載體擬南芥的植株，簡(jiǎn)稱轉(zhuǎn)空載體擬南芥。

三、RT-PCR檢測(cè)

1、采用TRIzol試劑提取擬南芥幼苗(野生型擬南芥幼苗、轉(zhuǎn)空載體擬南芥幼苗、N的幼苗、S的幼苗或NS的幼苗)的總RNA，將該總RNA用M-MLV反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cDNA，得到擬南芥幼苗的cDNA。擬南芥幼苗的cDNA中，DNA濃度為50ng/μL。

2、通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)擬南芥幼苗的cDNA中GhNHX1基因和GhSOS1基因的相對(duì)表達(dá)量(以Actin基因作為內(nèi)參基因)。

檢測(cè)GhNHX1基因的引物為F4：5’-CAGCCAGCATGCTCTCAGAC-3’和R4：5’-ACATAGGGCGCATGAAGGCA-3’。

檢測(cè)GhSOS1基因的引物為F5：5’-TGGGAAGGATTGGTGATGGC-3’和R5：5’-GGACCAGCAAGCAGAACCAT-3’。

檢測(cè)Actin基因的引物為F6：5’-ATCCTCCGTCTTGACCTTG-3’和R6：5’-TGTCCGTCAGGCAACTCAT-3’。

結(jié)果表明，與野生型擬南芥相比，N和NS中GhNHX1基因的表達(dá)量顯著增加，S和NS中GhSOS1基因的表達(dá)量顯著增加；野生型擬南芥和轉(zhuǎn)空載體擬南芥中GhNHX1基因和GhSOS1基因不表達(dá)。

因此，N為轉(zhuǎn)GhNHX1基因擬南芥；S為轉(zhuǎn)GhSOS1基因擬南芥；NS為轉(zhuǎn)GhNHX1基因和GhSOS1基因的擬南芥。

四、耐鹽性鑒定

待測(cè)擬南芥種子為野生型擬南芥種子、轉(zhuǎn)空載體擬南芥種子、N的T₃代種子、S的T₃代種子或NS的T₃代種子。

實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值，每次重復(fù)的步驟如下：

1、向EP管中加入待測(cè)擬南芥種子，先用超純水清洗一次，再用75％(v/v)乙醇水溶液浸泡30s，最后用超純水清洗三次，在無(wú)菌濾紙上晾干，得到無(wú)菌的待測(cè)擬南芥種子。

2、完成步驟1后，將50粒無(wú)菌的待測(cè)擬南芥種子播種于MS固體培養(yǎng)基或含250mMNaCl的MS固體培養(yǎng)基，然后正常培養(yǎng)7d，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率(發(fā)芽率＝已發(fā)芽的待測(cè)擬南芥種子的粒數(shù)/50?！?00％)。正常培養(yǎng)的條件為：25℃。光暗交替培養(yǎng)的周期具體為：16h光照培養(yǎng)/8h黑暗培養(yǎng)。光照培養(yǎng)時(shí)的光照強(qiáng)度為5000Lx。

部分?jǐn)M南芥種子在MS固體培養(yǎng)基上的發(fā)芽率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖4(WT為野生型擬南芥)。部分?jǐn)M南芥種子在含250mM NaCl的MS固體培養(yǎng)基上的發(fā)芽率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖5(WT為野生型擬南芥)。結(jié)果表明，在MS固體培養(yǎng)基上，待測(cè)擬南芥種子的長(zhǎng)勢(shì)基本一致，發(fā)芽率也無(wú)顯著差異；在含250mM NaCl的MS固體培養(yǎng)基上，NS的發(fā)芽率均顯著高于S和N，S和N的發(fā)芽率均顯著高于野生型擬南芥，野生型擬南芥和轉(zhuǎn)空載體擬南芥基本沒(méi)有萌發(fā)、發(fā)芽率無(wú)顯著差異。因此，與野生型擬南芥、N和S相比，NS的抗鹽性顯著增強(qiáng)。

<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所

<120>一種表達(dá)載體及其在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用

<160>6

<170>PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1632

<212> DNA

<213> 棉花（Gossypium hirsutum L.)

<400> 1

atggtggctc cgcagttagc tgctgtcttt actaagttgc agacactatc tacttcagac 60

catgcgtctg tggtctccat gaacatattt gtagcgcttc tttgtgcttg cattgtgatt 120

ggtcatcttt tggaggagaa tagatggatg aacgaatcaa ttactgccct tatcattggt 180

gtttttactg gggtcattat tttgttgaca agtgggggta aaagctctca tcttttagtc 240

ttcagtgaag atctgttctt tatctatctt ctgcccccta ttatattcaa tgctgggttt 300

caggtgaaaa agaagcaatt tttccgtaac tttatcacca tcatgctgtt tggggctgtt 360

ggtacactaa tatcttgtac aattatctct ttaggtgtaa ttaacttctt caaggaaatg 420

gacattggct ccttagacat tggagatttt ctagcaattg gtgcaatatt tgctgcgaca 480

gattctgttt gcacactgca ggtgcttaat caggatgaga ctccattact ctacagtttg 540

gttttcggag agggtgttgt aaatgatgca acatctgtgg tgcttttcaa tgcaatccag 600

agttttgacc tcgttaatac cagtcctaga attcttctgg agtttattgg cagctttttg 660

tatttatttt tagcaagcac tatgctggga gtgattgttg ggttggttag tgcttacatc 720

atcaaaaagt tgtactttgg aaggcactca acagatcgtg aatttgctct tatgatgctt 780

atggcatacc tttcgtatat catggctgaa ctgttctatt tgagtggcat tcttacagta 840

ttcttttgtg ggattgtgat gtcacattat acctggcaca atgtaactga gagttcaaga 900

gtaactacaa agcatgcctt tgctaccttg tcatttgttg ctgagacttt tctctttctt 960

tatgtcggga tggatgcttt ggacatggag aagtggagat ttgtcagtga tagccctgga 1020

acgtcagttg ctgttagtgc tgtgctgatg ggtcttgtta tggttggaag agcggctttt 1080

gtgtttcccc tgtcattttt atccaacttg gcaaagaaat caactagtga gaaaatcagc 1140

ttcagggaac aaattataat atggtgggct gggctcatga gaggcgctgt atctatggca 1200

cttgcatata atcagtttac aagggggggc catactcagt tgcgaggaaa tgcaattatg 1260

attacaagca ccataaccat tgttctattc agcactgtgg tttttggttt aatgactaaa 1320

cctctaataa ggttcttgct gcctcatccc aaaccaacag ccagcatgct ctcagaccaa 1380

tccactccaa aatcaatgga ggcaccattt ctcggaagcg gccaggactc ttttgatgat 1440

agtttaattg gagttcatcg accaaacagc attcgtgcac ttcttacaac tccagcacac 1500

actgttcatt actattggcg aaagtttgat aatgccttca tgcgccctat gtttggtggc 1560

cggggttttg tgcccttcgt tcctggctcc ccaacagaaa ggagtgaacc taatctgcct 1620

caatggcaat ga 1632

<210> 2

<211> 3459

<212> DNA

<213> 棉花（Gossypium hirsutum L.）

<400> 2

atggaggaag tgaaagagta tctatacgtg ttaccttcga gaatgctaga ggaaattagc 60

tccggtgaat cggagccagt ggatgcggtc atctttgttg ggatttcttt ggtattagga 120

atcgcttcca ggcatcttct tcgcggcacc agagttcctt acactgtcgc tttgctcatc 180

attggccttg gtctcggctc tctcgaatat ggtacaagtc ataaattggg aaggattggt 240

gatggcattc gactttggaa caacattgat cctgaccttc tattagctgt ttttctaccc 300

gcattacttt ttgagagtgc attttctatg gaagtgcacc agataaagag gtgtatggca 360

caaatggttc tgcttgctgg tcctggagtt attatttcaa ccttctgtct tggatttgct 420

ctgaagatca cttttccata tgagtggaac tggaaaacat cgctgttgct tgggggactt 480

ctgagtgcta ctgatcctgt tgctgttgtg gctttgttga aggagcttgg tgctagcaaa 540

aaactgagca ccataattga aggagaatcc ttaatgaatg atgggacagc aattgtggtc 600

tatcagttat tctttaaaat ggtaaatgga gagagcttta gttgggatgc cattgttgga 660

tttctggcca aagtcgctct tggagctgtt ggccttggaa ttgcttttgg gatagcatct 720

gttttgtggc ttggatttat tttcaatgat acagtgattg agattacatt gacagttgct 780

gtgagctacg ttgtttactt cactggtcaa gaaggtattg aagtttctgg tgttttggca 840

gtgatgactt taggaatgtt ttatgctgct tttgcgaaga cagcctttaa gggtgatggt 900

cagcagagtt tgcatcactt ttgggaaatg gttgcttata ttgcaaatac attaattttc 960

atcttgagtg gagttgttat agctgaaggc attcttggca atgataagat atttcagaac 1020

aatggaaatt catggggtta tctgattctt ctgtacatct ttgtccaagt atcacgttgc 1080

attgttgttg gagtattgta tccattctta cgatattttg gatatggttt ggatttaaag 1140

gaggccgcca tcctaatatg gtcggggctt cggggagctg ttgcattatc actttctctc 1200

tctgttaagc gttccagtgg tggctcattt aatctcagct ctgaaactgg aagccggttc 1260

attttcttca ccggtggaat tgtattcctg acacttattg tgaatggatc aactacacag 1320

ttcattttac attttctggg tctggataaa ctatcagcag ccaagaagcg tatactagac 1380

tacacaaagt atgaaatgtt gaacaaagca ttcgaggctt ttgaagacct cgtagatgat 1440

gaggaacttg gacctgccga ttggcctaca gtaaagagat acattacaag cttacacgat 1500

ttggaggggg accgtgtgca tcctcatact gaatctgaag ctgataatga cctggaccct 1560

tcaaacttga aagatataag aatacgactt ctaaatggta tccaggcagc atactgggaa 1620

atgcttgatg aagggagaat tgcacaaagc acagctaatc tgttgatgca atctgtagat 1680

gaagctattg atacggcatc tcatgaacct ttatgtgatt ggaagggctt aaaatctaat 1740

gtgcagttcc cgaattatta caagtttctt cagacaagca tgttcccaca aaaattgatt 1800

acatttttca ctgtggaaag gctggaaaat gggtgttgta tttgtgctgc atttcttcga 1860

gctcatagaa tagcacgacg gcaacttcat gaatttatag gtgacagtgt agttgcttct 1920

actgtaattg ctgaaagtga agctgaagga gaagaggcga ggaagtttct ggaagatgtc 1980

cgtataactt ttcatcaggt tttacgtgtt gtgaaaacaa gacaagtgac ctactcagta 2040

ctgaaccatc tgattgatta tttacataac ctcgagaagg cggggttact ggaagaaaaa 2100

gaaatgcttc atcttcatga tgctgtccag actgacttga agaggctttt aaggaatcct 2160

ccattagtaa agattccaaa aataaatgat attataagtg ctcatccttt tctaggcgcc 2220

tttccttcta gtgtccgcga atcattagaa tgttctacaa aagaaaaaat gaaaacacgt 2280

ggtatgacac tttacaaaga gggctctaaa ccaaatggta tttggcttat ttcaaatggt 2340

gttgtcaagt ggaagagtaa gagcatacga aacaagcact caatgcatcc aacttttact 2400

catgggagta cgttgggctt gtatgaagta ttggttggaa aaccatacat ctgtgacatg 2460

atctcagatt ccgtggttct ctgttttttt attgaaagtg acagaatact ttcaatgcta 2520

aggtcggatc ctgcactaga agattttctg tggcaggaaa gtgctattgt acttgccaaa 2580

ctcttgtttc ctcaaatatt tgagaaaata gcgctgcatg atttgagagc tcttgtggca 2640

gaaaggtcat caatgaaaac atacattaca ggggaaacaa tagaagtgtc tcaccaatct 2700

gtcggcttca tgttggaagg gttcattaaa ccctcacatg ctgaaggcga actcattaag 2760

tcaccagcag ttcttttgcc ttcacaaggg aatcaaagtt tcttgcatgc agataagtca 2820

ggttctacaa cagccagttt ttctcatcag cgatccgggt atctacttga gacaagagga 2880

agcataatat accaagttga gaccagagca agagtaatta tatttgatat ttcaacactt 2940

gaaggcaata gggttttgcg gaataattca tcttcattta acctttcaca tagatcttta 3000

actagagaac atggaggtct tatgagttgg cccgaacatt tctttagggg aagacaacat 3060

acacaaaatc atgacgcaac tgatcaacaa gtaaacagat tgtcagcgag agccatgcag 3120

ttaagcatat ttggcagtaa ggtaaatttg ccacagcgta gctggagttt atcaaggatg 3180

aatcagtctc agccaataaa caacccgtca tataatagat ttctttcatt ccctggccat 3240

ctactggtct ctgccggatc agaaggagct tctactatga ggaagaatca caaagaagct 3300

ggaaagataa caaggcgagt tccctcagca caagcgaaca agatggacac gaaagagggt 3360

cacgtaaatg atgattcaag tgatgaatct ggtggtgagg atgagatcct ggtaagaatc 3420

gattcgccta gtgtactatc attccaccag gcttcttaa 3459

<210> 3

<211> 2754

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

agattagcct tttcaatttc agaaagaatg ctaacccaca gatggttaga gaggcttacg 60

cagcaggtct catcaagacg atctacccga gcaataatct ccaggaaatc aaataccttc 120

ccaagaaggt taaagatgca gtcaaaagat tcaggactaa ctgcatcaag aacacagaga 180

aagatatatt tctcaagatc agaagtacta ttccagtatg gacgattcaa ggcttgcttc 240

acaaaccaag gcaagtaata gagattggag tctctaaaaa ggtagttccc actgaatcaa 300

aggccatgga gtcaaagatt caaatagagg acctaacaga actcgccgta aagactggcg 360

aacagttcat acagagtctc ttacgactca atgacaagaa gaaaatcttc gtcaacatgg 420

tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca gaagaccaaa 480

gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc 540

cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc 600

atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag 660

atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa 720

agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc 780

cttcgcaaga cccttcctct atataaggaa gttcatttca tttggagaga acacggggga 840

ctctagagga tccatggtgg ctccgcagtt agctgctgtc tttactaagt tgcagacact 900

atctacttca gaccatgcgt ctgtggtctc catgaacata tttgtagcgc ttctttgtgc 960

ttgcattgtg attggtcatc ttttggagga gaatagatgg atgaacgaat caattactgc 1020

ccttatcatt ggtgttttta ctggggtcat tattttgttg acaagtgggg gtaaaagctc 1080

tcatctttta gtcttcagtg aagatctgtt ctttatctat cttctgcccc ctattatatt 1140

caatgctggg tttcaggtga aaaagaagca atttttccgt aactttatca ccatcatgct 1200

gtttggggct gttggtacac taatatcttg tacaattatc tctttaggtg taattaactt 1260

cttcaaggaa atggacattg gctccttaga cattggagat tttctagcaa ttggtgcaat 1320

atttgctgcg acagattctg tttgcacact gcaggtgctt aatcaggatg agactccatt 1380

actctacagt ttggttttcg gagagggtgt tgtaaatgat gcaacatctg tggtgctttt 1440

caatgcaatc cagagttttg acctcgttaa taccagtcct agaattcttc tggagtttat 1500

tggcagcttt ttgtatttat ttttagcaag cactatgctg ggagtgattg ttgggttggt 1560

tagtgcttac atcatcaaaa agttgtactt tggaaggcac tcaacagatc gtgaatttgc 1620

tcttatgatg cttatggcat acctttcgta tatcatggct gaactgttct atttgagtgg 1680

cattcttaca gtattctttt gtgggattgt gatgtcacat tatacctggc acaatgtaac 1740

tgagagttca agagtaacta caaagcatgc ctttgctacc ttgtcatttg ttgctgagac 1800

ttttctcttt ctttatgtcg ggatggatgc tttggacatg gagaagtgga gatttgtcag 1860

tgatagccct ggaacgtcag ttgctgttag tgctgtgctg atgggtcttg ttatggttgg 1920

aagagcggct tttgtgtttc ccctgtcatt tttatccaac ttggcaaaga aatcaactag 1980

tgagaaaatc agcttcaggg aacaaattat aatatggtgg gctgggctca tgagaggcgc 2040

tgtatctatg gcacttgcat ataatcagtt tacaaggggg ggccatactc agttgcgagg 2100

aaatgcaatt atgattacaa gcaccataac cattgttcta ttcagcactg tggtttttgg 2160

tttaatgact aaacctctaa taaggttctt gctgcctcat cccaaaccaa cagccagcat 2220

gctctcagac caatccactc caaaatcaat ggaggcacca tttctcggaa gcggccagga 2280

ctcttttgat gatagtttaa ttggagttca tcgaccaaac agcattcgtg cacttcttac 2340

aactccagca cacactgttc attactattg gcgaaagttt gataatgcct tcatgcgccc 2400

tatgtttggt ggccggggtt ttgtgccctt cgttcctggc tccccaacag aaaggagtga 2460

acctaatctg cctcaatggc aatgagagct cgaatttccc cgatcgttca aacatttggc 2520

aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc atataatttc 2580

tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta tttatgagat 2640

gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa aacaaaatat 2700

agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta gatc 2754

<210> 4

<211> 543

<212> PRT

<213> 棉花（Gossypium hirsutum L.）

<400> 4

Met Val Ala Pro Gln Leu Ala Ala Val Phe Thr Lys Leu Gln Thr Leu

1 5 10 15

Ser Thr Ser Asp His Ala Ser Val Val Ser Met Asn Ile Phe Val Ala

20 25 30

Leu Leu Cys Ala Cys Ile Val Ile Gly His Leu Leu Glu Glu Asn Arg

35 40 45

Trp Met Asn Glu Ser Ile Thr Ala Leu Ile Ile Gly Val Phe Thr Gly

50 55 60

Val Ile Ile Leu Leu Thr Ser Gly Gly Lys Ser Ser His Leu Leu Val

65 70 75 80

Phe Ser Glu Asp Leu Phe Phe Ile Tyr Leu Leu Pro Pro Ile Ile Phe

85 90 95

Asn Ala Gly Phe Gln Val Lys Lys Lys Gln Phe Phe Arg Asn Phe Ile

100 105 110

Thr Ile Met Leu Phe Gly Ala Val Gly Thr Leu Ile Ser Cys Thr Ile

115 120 125

Ile Ser Leu Gly Val Ile Asn Phe Phe Lys Glu Met Asp Ile Gly Ser

130 135 140

Leu Asp Ile Gly Asp Phe Leu Ala Ile Gly Ala Ile Phe Ala Ala Thr

145 150 155 160

Asp Ser Val Cys Thr Leu Gln Val Leu Asn Gln Asp Glu Thr Pro Leu

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Val Phe Gly Glu Gly Val Val Asn Asp Ala Thr Ser

180 185 190

Val Val Leu Phe Asn Ala Ile Gln Ser Phe Asp Leu Val Asn Thr Ser

195 200 205

Pro Arg Ile Leu Leu Glu Phe Ile Gly Ser Phe Leu Tyr Leu Phe Leu

210 215 220

Ala Ser Thr Met Leu Gly Val Ile Val Gly Leu Val Ser Ala Tyr Ile

225 230 235 240

Ile Lys Lys Leu Tyr Phe Gly Arg His Ser Thr Asp Arg Glu Phe Ala

245 250 255

Leu Met Met Leu Met Ala Tyr Leu Ser Tyr Ile Met Ala Glu Leu Phe

260 265 270

Tyr Leu Ser Gly Ile Leu Thr Val Phe Phe Cys Gly Ile Val Met Ser

275 280 285

His Tyr Thr Trp His Asn Val Thr Glu Ser Ser Arg Val Thr Thr Lys

290 295 300

His Ala Phe Ala Thr Leu Ser Phe Val Ala Glu Thr Phe Leu Phe Leu

305 310 315 320

Tyr Val Gly Met Asp Ala Leu Asp Met Glu Lys Trp Arg Phe Val Ser

325 330 335

Asp Ser Pro Gly Thr Ser Val Ala Val Ser Ala Val Leu Met Gly Leu

340 345 350

Val Met Val Gly Arg Ala Ala Phe Val Phe Pro Leu Ser Phe Leu Ser

355 360 365

Asn Leu Ala Lys Lys Ser Thr Ser Glu Lys Ile Ser Phe Arg Glu Gln

370 375 380

Ile Ile Ile Trp Trp Ala Gly Leu Met Arg Gly Ala Val Ser Met Ala

385 390 395 400

Leu Ala Tyr Asn Gln Phe Thr Arg Gly Gly His Thr Gln Leu Arg Gly

405 410 415

Asn Ala Ile Met Ile Thr Ser Thr Ile Thr Ile Val Leu Phe Ser Thr

420 425 430

Val Val Phe Gly Leu Met Thr Lys Pro Leu Ile Arg Phe Leu Leu Pro

435 440 445

His Pro Lys Pro Thr Ala Ser Met Leu Ser Asp Gln Ser Thr Pro Lys

450 455 460

Ser Met Glu Ala Pro Phe Leu Gly Ser Gly Gln Asp Ser Phe Asp Asp

465 470 475 480

Ser Leu Ile Gly Val His Arg Pro Asn Ser Ile Arg Ala Leu Leu Thr

485 490 495

Thr Pro Ala His Thr Val His Tyr Tyr Trp Arg Lys Phe Asp Asn Ala

500 505 510

Phe Met Arg Pro Met Phe Gly Gly Arg Gly Phe Val Pro Phe Val Pro

515 520 525

Gly Ser Pro Thr Glu Arg Ser Glu Pro Asn Leu Pro Gln Trp Gln

530 535 540

<210> 5

<211> 1152

<212> PRT

<213> 棉花（Gossypium hirsutum L.）

<400> 5

Met Glu Glu Val Lys Glu Tyr Leu Tyr Val Leu Pro Ser Arg Met Leu

1 5 10 15

Glu Glu Ile Ser Ser Gly Glu Ser Glu Pro Val Asp Ala Val Ile Phe

20 25 30

Val Gly Ile Ser Leu Val Leu Gly Ile Ala Ser Arg His Leu Leu Arg

35 40 45

Gly Thr Arg Val Pro Tyr Thr Val Ala Leu Leu Ile Ile Gly Leu Gly

50 55 60

Leu Gly Ser Leu Glu Tyr Gly Thr Ser His Lys Leu Gly Arg Ile Gly

65 70 75 80

Asp Gly Ile Arg Leu Trp Asn Asn Ile Asp Pro Asp Leu Leu Leu Ala

85 90 95

Val Phe Leu Pro Ala Leu Leu Phe Glu Ser Ala Phe Ser Met Glu Val

100 105 110

His Gln Ile Lys Arg Cys Met Ala Gln Met Val Leu Leu Ala Gly Pro

115 120 125

Gly Val Ile Ile Ser Thr Phe Cys Leu Gly Phe Ala Leu Lys Ile Thr

130 135 140

Phe Pro Tyr Glu Trp Asn Trp Lys Thr Ser Leu Leu Leu Gly Gly Leu

145 150 155 160

Leu Ser Ala Thr Asp Pro Val Ala Val Val Ala Leu Leu Lys Glu Leu

165 170 175

Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Thr Ile Ile Glu Gly Glu Ser Leu Met

180 185 190

Asn Asp Gly Thr Ala Ile Val Val Tyr Gln Leu Phe Phe Lys Met Val

195 200 205

Asn Gly Glu Ser Phe Ser Trp Asp Ala Ile Val Gly Phe Leu Ala Lys

210 215 220

Val Ala Leu Gly Ala Val Gly Leu Gly Ile Ala Phe Gly Ile Ala Ser

225 230 235 240

Val Leu Trp Leu Gly Phe Ile Phe Asn Asp Thr Val Ile Glu Ile Thr

245 250 255

Leu Thr Val Ala Val Ser Tyr Val Val Tyr Phe Thr Gly Gln Glu Gly

260 265 270

Ile Glu Val Ser Gly Val Leu Ala Val Met Thr Leu Gly Met Phe Tyr

275 280 285

Ala Ala Phe Ala Lys Thr Ala Phe Lys Gly Asp Gly Gln Gln Ser Leu

290 295 300

His His Phe Trp Glu Met Val Ala Tyr Ile Ala Asn Thr Leu Ile Phe

305 310 315 320

Ile Leu Ser Gly Val Val Ile Ala Glu Gly Ile Leu Gly Asn Asp Lys

325 330 335

Ile Phe Gln Asn Asn Gly Asn Ser Trp Gly Tyr Leu Ile Leu Leu Tyr

340 345 350

Ile Phe Val Gln Val Ser Arg Cys Ile Val Val Gly Val Leu Tyr Pro

355 360 365

Phe Leu Arg Tyr Phe Gly Tyr Gly Leu Asp Leu Lys Glu Ala Ala Ile

370 375 380

Leu Ile Trp Ser Gly Leu Arg Gly Ala Val Ala Leu Ser Leu Ser Leu

385 390 395 400

Ser Val Lys Arg Ser Ser Gly Gly Ser Phe Asn Leu Ser Ser Glu Thr

405 410 415

Gly Ser Arg Phe Ile Phe Phe Thr Gly Gly Ile Val Phe Leu Thr Leu

420 425 430

Ile Val Asn Gly Ser Thr Thr Gln Phe Ile Leu His Phe Leu Gly Leu

435 440 445

Asp Lys Leu Ser Ala Ala Lys Lys Arg Ile Leu Asp Tyr Thr Lys Tyr

450 455 460

Glu Met Leu Asn Lys Ala Phe Glu Ala Phe Glu Asp Leu Val Asp Asp

465 470 475 480

Glu Glu Leu Gly Pro Ala Asp Trp Pro Thr Val Lys Arg Tyr Ile Thr

485 490 495

Ser Leu His Asp Leu Glu Gly Asp Arg Val His Pro His Thr Glu Ser

500 505 510

Glu Ala Asp Asn Asp Leu Asp Pro Ser Asn Leu Lys Asp Ile Arg Ile

515 520 525

Arg Leu Leu Asn Gly Ile Gln Ala Ala Tyr Trp Glu Met Leu Asp Glu

530 535 540

Gly Arg Ile Ala Gln Ser Thr Ala Asn Leu Leu Met Gln Ser Val Asp

545 550 555 560

Glu Ala Ile Asp Thr Ala Ser His Glu Pro Leu Cys Asp Trp Lys Gly

565 570 575

Leu Lys Ser Asn Val Gln Phe Pro Asn Tyr Tyr Lys Phe Leu Gln Thr

580 585 590

Ser Met Phe Pro Gln Lys Leu Ile Thr Phe Phe Thr Val Glu Arg Leu

595 600 605

Glu Asn Gly Cys Cys Ile Cys Ala Ala Phe Leu Arg Ala His Arg Ile

610 615 620

Ala Arg Arg Gln Leu His Glu Phe Ile Gly Asp Ser Val Val Ala Ser

625 630 635 640

Thr Val Ile Ala Glu Ser Glu Ala Glu Gly Glu Glu Ala Arg Lys Phe

645 650 655

Leu Glu Asp Val Arg Ile Thr Phe His Gln Val Leu Arg Val Val Lys

660 665 670

Thr Arg Gln Val Thr Tyr Ser Val Leu Asn His Leu Ile Asp Tyr Leu

675 680 685

His Asn Leu Glu Lys Ala Gly Leu Leu Glu Glu Lys Glu Met Leu His

690 695 700

Leu His Asp Ala Val Gln Thr Asp Leu Lys Arg Leu Leu Arg Asn Pro

705 710 715 720

Pro Leu Val Lys Ile Pro Lys Ile Asn Asp Ile Ile Ser Ala His Pro

725 730 735

Phe Leu Gly Ala Phe Pro Ser Ser Val Arg Glu Ser Leu Glu Cys Ser

740 745 750

Thr Lys Glu Lys Met Lys Thr Arg Gly Met Thr Leu Tyr Lys Glu Gly

755 760 765

Ser Lys Pro Asn Gly Ile Trp Leu Ile Ser Asn Gly Val Val Lys Trp

770 775 780

Lys Ser Lys Ser Ile Arg Asn Lys His Ser Met His Pro Thr Phe Thr

785 790 795 800

His Gly Ser Thr Leu Gly Leu Tyr Glu Val Leu Val Gly Lys Pro Tyr

805 810 815

Ile Cys Asp Met Ile Ser Asp Ser Val Val Leu Cys Phe Phe Ile Glu

820 825 830

Ser Asp Arg Ile Leu Ser Met Leu Arg Ser Asp Pro Ala Leu Glu Asp

835 840 845

Phe Leu Trp Gln Glu Ser Ala Ile Val Leu Ala Lys Leu Leu Phe Pro

850 855 860

Gln Ile Phe Glu Lys Ile Ala Leu His Asp Leu Arg Ala Leu Val Ala

865 870 875 880

Glu Arg Ser Ser Met Lys Thr Tyr Ile Thr Gly Glu Thr Ile Glu Val

885 890 895

Ser His Gln Ser Val Gly Phe Met Leu Glu Gly Phe Ile Lys Pro Ser

900 905 910

His Ala Glu Gly Glu Leu Ile Lys Ser Pro Ala Val Leu Leu Pro Ser

915 920 925

Gln Gly Asn Gln Ser Phe Leu His Ala Asp Lys Ser Gly Ser Thr Thr

930 935 940

Ala Ser Phe Ser His Gln Arg Ser Gly Tyr Leu Leu Glu Thr Arg Gly

945 950 955 960

Ser Ile Ile Tyr Gln Val Glu Thr Arg Ala Arg Val Ile Ile Phe Asp

965 970 975

Ile Ser Thr Leu Glu Gly Asn Arg Val Leu Arg Asn Asn Ser Ser Ser

980 985 990

Phe Asn Leu Ser His Arg Ser Leu Thr Arg Glu His Gly Gly Leu Met

995 1000 1005

Ser Trp Pro Glu His Phe Phe Arg Gly Arg Gln His Thr Gln Asn

1010 1015 1020

His Asp Ala Thr Asp Gln Gln Val Asn Arg Leu Ser Ala Arg Ala

1025 1030 1035

Met Gln Leu Ser Ile Phe Gly Ser Lys Val Asn Leu Pro Gln Arg

1040 1045 1050

Ser Trp Ser Leu Ser Arg Met Asn Gln Ser Gln Pro Ile Asn Asn

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Pro Ser Tyr Asn Arg Phe Leu Ser Phe Pro Gly His Leu Leu Val

1070 1075 1080

Ser Ala Gly Ser Glu Gly Ala Ser Thr Met Arg Lys Asn His Lys

1085 1090 1095

Glu Ala Gly Lys Ile Thr Arg Arg Val Pro Ser Ala Gln Ala Asn

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Lys Met Asp Thr Lys Glu Gly His Val Asn Asp Asp Ser Ser Asp

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Glu Ser Gly Gly Glu Asp Glu Ile Leu Val Arg Ile Asp Ser Pro

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Ser Val Leu Ser Phe His Gln Ala Ser

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<210> 6

<211> 4581

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6