本發(fā)明屬于發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法。
背景技術(shù)：
乳酸，有兩種立體異構(gòu)體，即L-(+)乳酸和D-(-)乳酸。L-乳酸作為一種重要的生物化工原料，在食品、醫(yī)藥、保健、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)和日用化工等領(lǐng)域中得到廣泛使用。近年來，隨著對生物新材料的深入研究，生物基聚合物尤其是以L-乳酸為單體聚合形成的聚乳酸備受關(guān)注。聚乳酸作為可生物降解材料，是最有發(fā)展前途的環(huán)保型生物塑料，有潛力解決石化塑料帶來的“白色污染”問題。
乳酸的生產(chǎn)方法有化學(xué)法和微生物發(fā)酵法，其中化學(xué)法以石油為原料合成，歷史較為悠久，但化學(xué)法直接合成的乳酸為DL-乳酸，且所用的原料一般具有毒性，不符合綠色化學(xué)要求，因此受到限制。生物發(fā)酵可以通過選擇不同的菌種輔以基因工程的方法更專一性地生產(chǎn)L-乳酸或者D-乳酸，且具有生產(chǎn)條件溫和、環(huán)境安全、副產(chǎn)物少和產(chǎn)物光學(xué)純度高等特點(diǎn)，因此發(fā)酵法得以最為廣泛的用于L-乳酸的生產(chǎn)。
目前工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸基本使用糧食基淀粉原料，將淀粉糖化降解為葡萄糖再發(fā)酵得到L-乳酸。然而，糧食原料的使用在兩方面上限制了聚乳酸生物塑料產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。首先，由于原料成本較高而推高了聚乳酸價格，使之不能與石化塑料在市場上競爭。其次，用糧食原料大量生產(chǎn)生物塑料存在與人爭糧的問題，也限制了其發(fā)展?jié)摿Α?/p>
因此，利用木質(zhì)纖維原料，特別是農(nóng)業(yè)廢棄秸稈，發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸便成為突破生物塑料產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)。解決這一技術(shù)不僅可以變廢為寶，增加農(nóng)民收入，而且可以減少秸稈焚燒引起的大氣污染。農(nóng)作物秸稈的基本組成為木質(zhì)纖維素，其中含量豐富的纖維素和半纖維素經(jīng)纖維素酶酶解生成葡萄糖和木糖，而葡萄糖和木糖均可被發(fā)酵生成L-乳酸。但是，由于存在各種技術(shù)難點(diǎn)，目前直接利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的方法較少，還沒有實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
CN 101736042 A公開了一種生產(chǎn)L-乳酸的方法：將農(nóng)作物秸稈粉碎后，采用酸、堿預(yù)處理，再利用纖維素酶酶解得到的糖化液，通過米根霉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。其預(yù)處理方法容易造成環(huán)境污染，而且發(fā)酵前需要對發(fā)酵液進(jìn)行中和，且酶解與發(fā)酵不同步進(jìn)行，工藝復(fù)雜。米根霉發(fā)酵溫度32℃-34℃，易被雜菌污染，發(fā)酵前需對發(fā)酵液進(jìn)行滅菌。CN 102174600 A公開了一種連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn) L- 乳酸的方法， CN 102134581 A 公開了一種乳酸菌發(fā)酵方法，均是將農(nóng)作物廢棄物或者植物秸稈經(jīng)過酸、堿預(yù)處理，用乳酸菌在40℃下進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵或同步糖化發(fā)酵，專利雖然通過優(yōu)化工藝縮短了發(fā)酵周期，但酸堿預(yù)處理仍然有污染環(huán)境和后期工藝復(fù)雜的問題。同時，發(fā)酵溫度與最適纖維素酶酶解溫度（48℃-50℃）不一致，從而在同步糖化過程中存在酶解效率偏低的問題。
因此，利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)L-乳酸的方法還存在預(yù)處理有環(huán)境污染、發(fā)酵周期長和生產(chǎn)成本高等問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，該方法工藝簡潔、發(fā)酵周期短、乳酸光學(xué)純度高、易于提純、整個生產(chǎn)過程無污染，便于產(chǎn)業(yè)化。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，包括以下步驟：
（1）凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵種子培養(yǎng)：將凝結(jié)芽孢桿菌接種于培養(yǎng)基平板，置于45℃-55℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h -24h，將長好的凝結(jié)芽孢桿菌接到液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為溫度45℃-55℃，轉(zhuǎn)速150rpm-250rpm，培養(yǎng)時間12 h -24h，通氣速率 1vvm；
（2）農(nóng)作物秸稈或能源植物預(yù)處理：將農(nóng)作物秸稈或能源植物粗粉碎至5mm左右，與自來水混合，攪拌均勻后加入到蒸汽爆破罐中，通飽和蒸汽加熱到180℃-210℃，維持2 min -30min，泄壓，收集蒸汽爆破后的物料，烘干備用；
（3）同步糖化發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸：在發(fā)酵罐中加入發(fā)酵培養(yǎng)基成分，加入步驟（1）培養(yǎng)的凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵種子液和步驟（2）中經(jīng)過蒸汽爆破預(yù)處理后的農(nóng)作物秸稈或能源植物，每克預(yù)處理底物添加20FPU的纖維素酶，然后在45℃-55℃，100rpm-200rpm轉(zhuǎn)速條件下糖化發(fā)酵48 h -72h，發(fā)酵過程中利用氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH，定時取樣測定發(fā)酵液中乳酸濃度。
步驟（1）中使用的液體培養(yǎng)基組成為：葡萄糖 20g/L，酵母粉10 g/L，氯化鈉 2 g/L，磷酸二氫鉀 2 g/L，七水合硫酸鎂0.2 g/L，一水合硫酸錳0.05 g/L，七水合硫酸亞鐵0.01 g/L。
步驟（2）中使用的農(nóng)作物秸稈包括玉米秸稈、油菜秸稈等，能源植物包括芒草。
步驟（3）中預(yù)處理后農(nóng)作物秸稈添加量為150g/L-200g/L，凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵種子液接種量為10%（v/v）。
步驟（3）中發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：玉米漿10 g/L，硫酸銨 2g/L，磷酸二氫鉀 2 g/L，七水合硫酸鎂0.2 g/L，一水合硫酸錳0.05 g/L，七水合硫酸亞鐵0.01 g/L。
步驟（3）中乳酸濃度的測定方法是取發(fā)酵液離心，離心后的上清液稀釋一定倍數(shù)后用微孔濾膜過濾，濾液進(jìn)高效液相色譜檢測。
本發(fā)明的有益效果是：（1）以農(nóng)作物秸稈或能源植物取代淀粉質(zhì)原料制備L-乳酸，原料易得，成本低廉，同時解決了農(nóng)作物秸稈焚燒污染問題，增加農(nóng)民收入，具有廣泛的環(huán)境和社會效益。
（2）采用蒸汽爆破預(yù)處理農(nóng)作物秸稈，耗水少，過程中不需要添加酸堿等化學(xué)試劑，對環(huán)境污染少，纖維素和半纖維素回收率高，成本低。
（3）利用凝結(jié)芽孢桿菌高溫發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，溫度達(dá)到45℃以上，可以進(jìn)行不滅菌的發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，整個發(fā)酵過程一步完成，節(jié)約能量，降低了工業(yè)化的成本；用氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH，后續(xù)易去除，降低了乳酸提純成本。該菌能同時利用葡萄糖和木糖發(fā)酵生產(chǎn)高光純度（99%以上）的L-乳酸，提高了L-乳酸產(chǎn)率，減少了后續(xù)提純的困難。
（4）實(shí)現(xiàn)了木質(zhì)纖維素同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，避免了高濃度糖對纖維素酶的反饋抑制作用。整個發(fā)酵過程簡單，發(fā)酵周期短、連續(xù)性強(qiáng)，乳酸光學(xué)純度高、具有易于提純和整個生產(chǎn)過程無污染等綜合優(yōu)勢，有效控制了生產(chǎn)成本，便于產(chǎn)業(yè)化。
具體實(shí)施方式
為了加深對本發(fā)明的理解，下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，該實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。
實(shí)施例1：
（1）凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵種子液的制備：將凝結(jié)芽孢桿菌劃線接種至培養(yǎng)基平板，置于50℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，用接種針挑多環(huán)接于7L液體培養(yǎng)基中，在溫度為50℃，轉(zhuǎn)速180rpm的10L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐中培養(yǎng)一定時間，通氣速率 1vvm。種子培養(yǎng)基組成：葡萄糖 20g/L，酵母粉10 g/L，氯化鈉 2 g/L，磷酸二氫鉀 2 g/L，七水合硫酸鎂0.2 g/L，一水合硫酸錳0.05 g/L，七水合硫酸亞鐵0.01 g/L，種子培養(yǎng)過程中利用氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH；
（2）將玉米秸稈粗粉碎至5mm左右，與自來水按照質(zhì)量比1:1混合，攪拌均勻后加入到蒸汽爆破罐中，通飽和蒸汽加熱到200℃，維持10min，泄壓，收集蒸汽爆破后的物料，烘干備用；
（3）同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乳酸：10L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐裝液量為7L，加入發(fā)酵培養(yǎng)基成分：玉米漿10 g/L，硫酸銨 2g/L，磷酸二氫鉀 2 g/L，七水合硫酸鎂0.2 g/L，一水合硫酸錳0.05 g/L，七水合硫酸亞鐵0.01 g/L，加入步驟（1）所示的凝結(jié)芽孢桿菌種子液和步驟（2）所示的預(yù)處理玉米秸稈，其中凝結(jié)芽孢桿菌種子液接種量為10%（v/v），預(yù)處理玉米秸稈底物濃度為200g/L，纖維素酶的添加量為20FPU/g底物，溫度50℃，轉(zhuǎn)速150rpm下同步糖化發(fā)酵72h結(jié)束，發(fā)酵過程中利用氫氧化鈣作為中和劑。發(fā)酵結(jié)束測得乳酸濃度為64.75g/L。
實(shí)施例2：
（1）凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵罐種子液的制備：將凝結(jié)芽孢桿菌劃線接種至培養(yǎng)基平板，置于50℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，用接種針挑多環(huán)接于7L液體培養(yǎng)基中，在溫度為50℃，轉(zhuǎn)速180rpm的10L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐中培養(yǎng)一定時間，通氣速率 1vvm。種子培養(yǎng)基組成：葡萄糖 20g/L，酵母粉10 g/L，氯化鈉 2 g/L，磷酸二氫鉀 2 g/L，七水合硫酸鎂0.2 g/L，一水合硫酸錳0.05 g/L，七水合硫酸亞鐵0.01 g/L，種子培養(yǎng)過程中利用氫氧化鈣作為pH中和劑；
（2）將油菜秸稈粗粉碎至5mm，與自來水按照質(zhì)量比1:1混合，攪拌均勻后加入到蒸汽爆破罐中，通飽和蒸汽加熱到200℃，維持10min，泄壓，收集蒸汽爆破后的物料，烘干備用；
（3）同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乳酸：10L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐裝液量為7L，加入發(fā)酵培養(yǎng)基成分：玉米漿10 g/L，硫酸銨 2g/L，磷酸二氫鉀 2 g/L，七水合硫酸鎂0.2 g/L，一水合硫酸錳0.05 g/L，七水合硫酸亞鐵0.01 g/L，加入步驟（1）所示的凝結(jié)芽孢桿菌種子液和步驟（2）所示的預(yù)處理油菜秸稈，其中凝結(jié)芽孢桿菌種子液接種量為10%（v/v），預(yù)處理油菜秸稈底物濃度為200g/L，纖維素酶的添加量為20FPU/g底物，溫度50℃，轉(zhuǎn)速150rpm下同步糖化發(fā)酵69h結(jié)束，發(fā)酵過程中利用氫氧化鈣作為中和劑。發(fā)酵結(jié)束測得乳酸濃度61.58g/L。
實(shí)施例3：
（1）凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵罐種子液的制備：將凝結(jié)芽孢桿菌劃線接種至培養(yǎng)基平板，置于50℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，用接種針挑多環(huán)接于7L液體培養(yǎng)基中，在溫度為50℃，轉(zhuǎn)速180rpm的10L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐中培養(yǎng)一定時間，通氣速率 1vvm。種子培養(yǎng)基組成：葡萄糖 20g/L，酵母粉10 g/L，氯化鈉 2 g/L，磷酸二氫鉀 2 g/L，七水合硫酸鎂0.2 g/L，一水合硫酸錳0.05 g/L，七水合硫酸亞鐵0.01 g/L，種子培養(yǎng)過程中利用氫氧化鈣作為pH中和劑；
（2）將芒草莖干粗粉碎至5mm，與自來水按照質(zhì)量比1:1混合，攪拌均勻后加入到蒸汽爆破罐中，通飽和蒸汽加熱到200℃，維持10min，泄壓，收集蒸汽爆破后的物料，烘干備用；
（3）同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乳酸：10L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐裝液量為7L，加入發(fā)酵培養(yǎng)基成分：玉米漿10 g/L，硫酸銨 2g/L，磷酸二氫鉀 2 g/L，七水合硫酸鎂0.2 g/L，一水合硫酸錳0.05 g/L，七水合硫酸亞鐵0.01 g/L，加入步驟（1）所示的凝結(jié)芽孢桿菌種子液和步驟（2）所示的預(yù)處理芒草，其中凝結(jié)芽孢桿菌種子液接種量為10%（v/v），預(yù)處理芒草底物濃度為200g/L，纖維素酶的添加量為20FPU/g底物，溫度50℃，轉(zhuǎn)速150rpm下同步糖化發(fā)酵72h結(jié)束，發(fā)酵過程中利用氫氧化鈣作為中和劑。發(fā)酵結(jié)束測得乳酸濃度62.70g/L。
實(shí)施例4：
（1）凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵罐種子液的制備：將凝結(jié)芽孢桿菌劃線接種至培養(yǎng)基平板，置于50℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，用接種針挑多環(huán)接于7L液體培養(yǎng)基中，在溫度為50℃，轉(zhuǎn)速180rpm的10L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐中培養(yǎng)一定時間，通氣速率 1vvm。種子培養(yǎng)基組成：葡萄糖 20g/L，酵母粉10 g/L，氯化鈉 2 g/L，磷酸二氫鉀 2 g/L，七水合硫酸鎂0.2 g/L，一水合硫酸錳0.05 g/L，七水合硫酸亞鐵0.01 g/L，種子培養(yǎng)過程中利用氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH；
（2）將玉米秸稈粗粉碎至5mm，與自來水按照質(zhì)量比1:1混合，攪拌均勻后加入到蒸汽爆破罐中，通飽和蒸汽加熱到200℃，維持10min，泄壓，收集蒸汽爆破后的物料，烘干備用；
（3）同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乳酸：10L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐裝液量為7L，加入發(fā)酵培養(yǎng)基成分：玉米漿10 g/L，硫酸銨 2g/L，磷酸二氫鉀 2 g/L，七水合硫酸鎂0.2 g/L，一水合硫酸錳0.05 g/L，七水合硫酸亞鐵0.01 g/L，加入步驟（1）所示凝結(jié)芽孢桿菌種子液和步驟（2）所示的預(yù)處理玉米秸稈，其中凝結(jié)芽孢桿菌種子液接種量為10%（v/v），預(yù)處理玉米秸稈底物濃度為150g/L，纖維素酶的添加量為20FPU/g底物，溫度50℃，轉(zhuǎn)速150rpm下同步糖化發(fā)酵48h結(jié)束，發(fā)酵過程中利用氫氧化鈣作為中和劑。發(fā)酵結(jié)束后測得乳酸濃度53.76g/L。
實(shí)施例5：
（1）凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵罐種子液的制備：將凝結(jié)芽孢桿菌劃線接種至培養(yǎng)基平板，置于50℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，用接種針挑多環(huán)接于7L液體培養(yǎng)基中，在溫度為50℃，轉(zhuǎn)速180rpm的10L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐中培養(yǎng)一定時間，通氣速率 1vvm。種子培養(yǎng)基組成：萄糖 20g/L，酵母粉10 g/L，氯化鈉 2 g/L，磷酸二氫鉀 2 g/L，七水合硫酸鎂0.2 g/L，一水合硫酸錳0.05 g/L，七水合硫酸亞鐵0.01 g/L，種子培養(yǎng)過程中利用氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH；
（2）將油菜秸稈粗粉碎至5mm，與自來水按照質(zhì)量比1:1混合，攪拌均勻后加入到蒸汽爆破罐中，通飽和蒸汽加熱到200℃，維持10min，泄壓，收集蒸汽爆破后的物料，烘干備用；
（3）同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乳酸：10L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐裝液量為7L，加入發(fā)酵培養(yǎng)基成分：玉米漿10 g/L，硫酸銨 2g/L，磷酸二氫鉀 2 g/L，七水合硫酸鎂0.2 g/L，一水合硫酸錳0.05 g/L，七水合硫酸亞鐵0.01 g/L，加入步驟（1）所示的凝結(jié)芽孢桿菌種子液和步驟（2）所示的預(yù)處理油菜秸稈，其中凝結(jié)芽孢桿菌種子液接種量為10%（v/v），預(yù)處理油菜秸稈底物濃度為150g/L。纖維素酶的添加量為20FPU/g底物。溫度50℃，轉(zhuǎn)速150rpm下同步糖化發(fā)酵52h結(jié)束，發(fā)酵過程中利用氫氧化鈣作為中和劑。發(fā)酵結(jié)束后測得乳酸濃度51.64g/L。
實(shí)施例6：
（1）凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵罐種子液的制備：將凝結(jié)芽孢桿菌劃線接種至培養(yǎng)基平板，置于50℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，用接種針挑多環(huán)接于7L液體培養(yǎng)基中，在溫度為50℃，轉(zhuǎn)速180rpm的10L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐中培養(yǎng)一定時間，通氣速率 1vvm。種子培養(yǎng)基組成：葡萄糖 20g/L，酵母粉10 g/L，氯化鈉 2 g/L，磷酸二氫鉀 2 g/L，七水合硫酸鎂0.2 g/L，一水合硫酸錳0.05 g/L，七水合硫酸亞鐵0.01 g/L，種子培養(yǎng)過程中利用氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH；
（2）將芒草莖稈粗粉碎至5mm，與自來水按照質(zhì)量比1:1混合，攪拌均勻后加入到蒸汽爆破罐中，通飽和蒸汽加熱到200℃，維持10min，泄壓，收集蒸汽爆破后的物料，烘干備用；
（3）同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乳酸：10L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐裝液量為7L，加入發(fā)酵培養(yǎng)基成分：玉米漿10 g/L，硫酸銨 2g/L，磷酸二氫鉀 2 g/L，七水合硫酸鎂0.2 g/L，一水合硫酸錳0.05 g/L，七水合硫酸亞鐵0.01 g/L，加入步驟（1）所示的凝結(jié)芽孢桿菌種子液和步驟（2）所示的預(yù)處理芒草，其中凝結(jié)芽孢桿菌種子液接種量為10%（v/v），預(yù)處理芒草底物濃度為150g/L。纖維素酶的添加量為20FPU/g底物。溫度50℃，轉(zhuǎn)速150rpm下同步糖化發(fā)酵62h結(jié)束，發(fā)酵過程中利用氫氧化鈣作為中和劑。發(fā)酵結(jié)束后測得乳酸濃度55.36g/L。
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對本發(fā)明作任何其他形式的限制，而依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)所作的任何修改或等同變化，仍屬于本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。