本發(fā)明屬于海洋環(huán)保防污領(lǐng)域，尤其涉及一種阿維菌素類(lèi)衍生物的制備方法及其應(yīng)用，具體是一種來(lái)源于花柳珊瑚的天然阿維菌素類(lèi)衍生物在海洋防污漆方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

海洋污損生物的附著及累積限制了人們對(duì)海洋資源的開(kāi)發(fā)利用，如加速了金屬的腐蝕、影響海洋基礎(chǔ)設(shè)施的正常使用，會(huì)對(duì)海運(yùn)、水產(chǎn)養(yǎng)殖、海防、海濱發(fā)電廠等工業(yè)造成嚴(yán)重的技術(shù)性和操作性的麻煩。在海洋生態(tài)系統(tǒng)，生物污染是一個(gè)嚴(yán)重的全球性問(wèn)題，造成全球性材料和經(jīng)濟(jì)成本的增加。常用化學(xué)手段來(lái)防止污損有機(jī)物的積累，如各種有毒物質(zhì)(有機(jī)錫化合物)等是有效的防污損藥物，但由于它們?cè)谧匀画h(huán)境中不易降解且對(duì)目標(biāo)和非目標(biāo)的生物均有毒性導(dǎo)致對(duì)海洋環(huán)境的危害。這些化合物半衰期的毒性效應(yīng)導(dǎo)致其在海洋食物鏈永久存在，并使生物的生命周期在早期階段發(fā)生改變，不利于海洋環(huán)境保護(hù)。

由于有毒防污漆使用的不利影響，無(wú)毒或低毒涂料已成為研究者的發(fā)展目標(biāo)。生產(chǎn)環(huán)境友好型涂料的現(xiàn)代選擇之一是使用天然產(chǎn)物。由于海洋生物長(zhǎng)期生活在高鹽高壓低溫和光照的封閉體系中，因此海洋生物中蘊(yùn)藏著大量化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎，生物活性極其強(qiáng)烈的代謝產(chǎn)物。許多海洋生物次級(jí)代謝產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗海洋污損生物附著的作用，超過(guò)70％的有效的海洋防污天然產(chǎn)品來(lái)自海綿、藻類(lèi)和腔腸動(dòng)物的次生代謝產(chǎn)物，其對(duì)海洋污損生物具有生長(zhǎng)抑制、附著抑制及抑制幼蟲(chóng)變態(tài)的功能。因此，尋找讓固著海洋生物保持身體表面無(wú)污垢的化學(xué)防御化合物，并將其開(kāi)發(fā)用于抗污涂料中已成為海洋環(huán)保研究的熱點(diǎn)之一。迄今為止，還未見(jiàn)有將海洋生物的次生代謝產(chǎn)物中所獲得的阿維菌素類(lèi)衍生物應(yīng)用于海洋防污漆中的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種阿維菌素類(lèi)衍生物的制備方法及其應(yīng)用，該化合物能有效抑制典型的海洋污損生物藤壺附著，可用于制備海洋防污漆。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

阿維菌素類(lèi)衍生物在抑制藤壺附著方面的應(yīng)用。

阿維菌素類(lèi)衍生物在制備海洋防污漆中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用，每公斤船用防銹漆中加入1g阿維菌素類(lèi)衍生物并混合均勻。

上述阿維菌素類(lèi)衍生物具有以下結(jié)構(gòu)式：

上述阿維菌素類(lèi)衍生物為5-O-二甲基-25-二(1-甲基丙基)-25-[(1S)-1，4-二甲基戊基]阿維菌素A_1a

上述阿維菌素類(lèi)衍生物的制備方法，從花柳珊瑚中提取分離而得。

上述阿維菌素類(lèi)衍生物的制備方法，將新鮮的花柳珊瑚剪碎后用乙醇及二氯甲烷浸泡，減壓濃縮浸泡液得到提取物；用石油醚將該提取物萃取至石油醚相無(wú)色為止；棄置石油醚相，用乙酸乙酯將殘留相多次萃取，合并所得的乙酸乙酯相，減壓濃縮得乙酸乙酯相萃取相；將乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠柱層析，進(jìn)行梯度洗脫，收集流份，采用薄層色譜法檢測(cè)結(jié)果，合并成分相近的流份；通過(guò)高效液相色譜儀采用甲醇和水混合液進(jìn)行分離，即得。

梯度洗脫分別使用體積比1∶0.1、1∶0.2、1∶0.4、1∶0.8的氯仿-丙酮混合液。

甲醇和水混合液體積比為40∶60。

發(fā)明人從花柳珊瑚(Anthogorgia caerulea)中提取分離得到一種阿維菌素類(lèi)衍生物B_1e，命名為5-O-二甲基-25-二(1-甲基丙基)-25-[(1S)-1，4-二甲基戊基]阿維菌素A_1a。試驗(yàn)表明，該阿維菌素類(lèi)衍生物B_1e對(duì)抑制典型的海洋污損生物藤壺附著的EC₅₀值(0.12±0.02μg/mL)遠(yuǎn)小于陽(yáng)性對(duì)照丁烯羥酸內(nèi)酯(4.37±1.22μg/mL)，具有良好的抑制海洋污損生物藤壺的活性。由于化合物B_1e為海洋天然活性成分，而且易溶于甲醇和乙醇，具有良好的親醇性，因此可單獨(dú)或組合應(yīng)用于制備高效的海洋防污漆。本發(fā)明為阿維菌素類(lèi)衍生物開(kāi)發(fā)了一種新的用途，為制備新型海洋防污漆提供了新的來(lái)源。

附圖說(shuō)明

圖1是野外實(shí)驗(yàn)鋼板附著污損生物形態(tài)圖。

圖中：A無(wú)阿維菌素B_1e的油漆鋼板，B 1g阿維菌素B_1e/100g油漆的鋼板。

具體實(shí)施方式

一、本發(fā)明阿維菌素類(lèi)衍生物B_1e的制備

將新鮮的花柳珊瑚(Anthogorgia caerulea)樣品(濕重約為5.0kg)剪碎后在室溫下依次用乙醇及二氯甲烷浸泡，采用真空濃縮(0.09MPa，43℃)得到濃縮浸膏。用等體積的石油醚將該花柳珊瑚濃縮浸膏進(jìn)行萃取，反復(fù)萃取至石油醚相無(wú)色為止。棄置石油醚相，將殘留相先用等體積乙酸乙酯進(jìn)行萃取，合并所得的乙酸乙酯相，減壓濃縮得乙酸乙酯相萃取物24.82g。

將乙酸乙酯萃取物24.82g，與硅膠粉末混合均勻，采用濕法裝柱裝入正相硅膠柱內(nèi)，采用CHCl₃-Me₂CO系統(tǒng)(CHCl₃∶Me₂CO＝1∶0.1，1∶0.2，1∶0.4，1∶0.8/V∶V)依次梯度洗脫，每個(gè)梯度段的洗脫液體積為4倍有效柱體積，每1000ml收集為1流份，一共收集了61個(gè)流份，每個(gè)流份真空濃縮(0.09MPa，43℃)后進(jìn)行薄層色譜檢測(cè)。根據(jù)TLC法檢測(cè)結(jié)果，將成分相近的流份進(jìn)行合并，初步分為4個(gè)組分Y1-Y4。

取組份Y4(253.6mg)先用HPLC分析柱確定分離條件，再用HPLC半制備柱進(jìn)行分離純化，在梯度MeOH∶H₂O＝40∶60/V∶V處，獲得阿維菌素B_1e(甲醇溶，3.2mg，制備程序出峰時(shí)間t＝9.84min)。

二、本發(fā)明阿維菌素類(lèi)衍生物B_1e的結(jié)構(gòu)解析

經(jīng)核磁共振檢測(cè)分析，確定本發(fā)明化合物B_1e的化學(xué)結(jié)構(gòu)為：

B_1e屬于阿維菌素類(lèi)衍生物，命名為5-O-二甲基-25-二(1-甲基丙基)-25-[(1S)-1，4-二甲基戊基]阿維菌素A_1a。

其理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)分別為：[α]²⁰_D＝-28.1°(c＝0.19，甲醇)，黃色粉末，C₅₁H₇₈O₁₄，HR-ESI-MS：m/z：915.5467([M+H]^十，C₅₁H₇₉O₁₄⁺，calc.915.5470)。¹H(CD₃OD，600MHz)和¹³C(CD₃OD，150MHz)NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1阿維菌素B_1e的¹H(600MHz)and¹³C NMR(150MHz)數(shù)據(jù)

三、本發(fā)明阿維菌素類(lèi)衍生物B_1e抑制污損生物藤壺幼蟲(chóng)附著生物試驗(yàn)

藤壺成蟲(chóng)采集自欽州港碼頭的巖石上。收集釋放出來(lái)的藤壺?zé)o節(jié)幼蟲(chóng)放置在過(guò)濾海水中培養(yǎng)。無(wú)節(jié)幼蟲(chóng)大約培養(yǎng)10d后發(fā)育至金星幼蟲(chóng)階段。過(guò)濾得到金星幼蟲(chóng)，保存在4℃冰箱中待用。

將阿維菌素B_1e用生物級(jí)DMSO配制成50mg.mL^-1的母液，隨后在活性測(cè)試中配制成不同濃度使用。

將化合物母液用無(wú)菌過(guò)濾海水稀釋成不同的濃度，在24孔培養(yǎng)板的每個(gè)孔中加入1.0mL測(cè)試液和15±5個(gè)金星幼蟲(chóng)，每個(gè)濃度均設(shè)3個(gè)重復(fù)。等體積無(wú)菌過(guò)濾海水和配置測(cè)試液時(shí)加入化合物溶劑等體積的DMSO做空白對(duì)照。通過(guò)在體式顯微鏡下觀察活的幼蟲(chóng)定居數(shù)量算出幼蟲(chóng)定居百分比，用占孔中全部幼蟲(chóng)的比率表達(dá)。利用SPSS19.0軟件求出阿維菌素B_1e抑制藤壺幼蟲(chóng)附著的EC₅₀半數(shù)有效濃度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示阿維菌素B_le具有較強(qiáng)的抑制典型的海洋污損生物藤壺附著的活性，其EC₅₀為0.12±0.02μg/mL。陽(yáng)性對(duì)照丁烯羥酸內(nèi)酯抑制藤壺附著的EC₅₀為4.37±1.22μg/mL。該阿維菌素B_1e對(duì)海洋污損生物藤壺附著抑制能力為丁烯羥酸內(nèi)酯的36.42倍。

四、本發(fā)明阿維菌素類(lèi)衍生物B_1e的野外掛板抗污損生物附著實(shí)驗(yàn)

采用材料是38mm(長(zhǎng))×25mm(寬)×1mm(厚度)船用鋼板。船用防銹漆油漆和從花柳珊瑚中提取得到的阿維菌素B_1e按10g阿維菌素B_1e/1000g油漆的配比用攪拌機(jī)混合1小時(shí)以充分分散均勻。采用壓縮空氣將調(diào)和好的油漆噴涂在鋼板上并產(chǎn)生約160微米厚度干膜，鋼板兩面均需噴涂，陰干待用。

將噴涂好的鋼板，掛于欽州港輸油管路橋的橋墩上，浸泡于海水中。浸泡60天后取出鋼板。通過(guò)測(cè)定掛板前和取板后的碳鋼板重量的增加得到污損生物附著在不同油漆標(biāo)本表面的質(zhì)量(取平均值)，以檢測(cè)阿維菌素對(duì)污損生物的抵抗效果及測(cè)試其防污性能。結(jié)果顯示掛板時(shí)間60天時(shí)，含量為10g阿維菌素B_1e/1000g油漆的鋼板上污損生物的附著量為0.28g，而無(wú)阿維菌素衍生物B_1e的油漆鋼板上污損生物的附著量為2.93g，阿維菌素B_1e可使污損生物附著減少90.44％。

采用體式顯微鏡對(duì)野外掛板實(shí)驗(yàn)前后的鋼板進(jìn)行了微觀拍照(如圖1所示)，無(wú)阿維菌素B_1e的油漆鋼板上污損生物藤壺附著量多且形態(tài)較大，含量為10g阿維菌素B_1e/1000g油漆的鋼板上的藤壺附著量較少，形態(tài)更為細(xì)小，且有少部分藤壺附著后脫落。上述研究說(shuō)明該阿維菌素衍生物B_1e可明顯抑制藤壺等污損生物在海洋建筑物及船只設(shè)備上的附著與生長(zhǎng)。