本發(fā)明屬于工業(yè)微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種PF1022A的分離純化方法。
背景技術(shù)：
：寄生蟲病是目前最為嚴(yán)重的人畜共患病之一，嚴(yán)重影響著畜牧業(yè)的健康發(fā)展與人類的生命安全。艾默德斯（Emodepside），是一種環(huán)八縮酚酸肽類新型驅(qū)蟲藥物，對(duì)動(dòng)物胃腸道線蟲非常有效。當(dāng)艾默德斯用到線蟲，被證明能可抑制寄生線蟲的肌肉蠕動(dòng)，抑制線蟲頭部運(yùn)動(dòng)和咽部運(yùn)動(dòng)，除此之外還對(duì)其它組織有影響，如抑制產(chǎn)卵。艾默德斯是PF1022A的半合成衍生物，PF1022A（結(jié)構(gòu)式如式1所示）為半知菌無孢霉（Myceliasterilia）產(chǎn)生的活性成分，是一個(gè)對(duì)動(dòng)物低毒、防治譜廣、效果好的驅(qū)蟲劑。該24元環(huán)縮肽化合物最早由Sasaki等人從天然產(chǎn)物中分離得到，之后通過不同的方法進(jìn)行了人工合成。最近的一系列科學(xué)研究表明，PF1022A可以與七螺旋狀類latrophilin跨膜受體的氨基位點(diǎn)相結(jié)合，該受體分離自捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(HaemonchuscontortusRudolphi)，其作用是誘導(dǎo)外部鈣流入細(xì)胞。這種抗線蟲藥物的作用模式與已知的驅(qū)蟲劑，如苯并咪唑類、咪唑并噻唑類、大環(huán)內(nèi)酯類的作用機(jī)理大不相同。式1，PF1022A目前，關(guān)于PF1022A提取分離的文獻(xiàn)報(bào)道極少，中國專利CN1080932A公開了一種通過化學(xué)合成的方法制備PF1022A后，用硅膠層析分離純化的方法。另外兩篇專利CN1189159A和CN1232446A公開了采用不同的化學(xué)合成方法制備PF1022A后，同樣也是通過硅膠層析得到產(chǎn)品的方法。專利CN1046940A公開了采用發(fā)酵培養(yǎng)方法制備PF1022A，以及分離純化方法，其中分離純化方法主要通過采用混合溶劑進(jìn)行萃取，上柱HP20樹脂進(jìn)行粗提后，再通過硅膠或凝膠介質(zhì)進(jìn)行層析，最后通過高效液相制備柱（ODS柱）進(jìn)行精制，以得到更高純度的產(chǎn)品。現(xiàn)有技術(shù)中，大多數(shù)純化方法均需要用到硅膠柱層析或用到色譜柱（如高效液相色譜）分離，工業(yè)化生產(chǎn)過程中需要用到大量溶劑，導(dǎo)致大量廢液需要處理，環(huán)境污染大，生產(chǎn)成本高，長期大量有機(jī)溶劑的接觸對(duì)操作人員的身體健康構(gòu)成威脅，面對(duì)日益提高的市場(chǎng)需求量和產(chǎn)品質(zhì)量要求，本領(lǐng)域急需找到一種能提高產(chǎn)品收率和純度的同時(shí)，降低生產(chǎn)成本、簡(jiǎn)化操作步的方法，以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種環(huán)境污染小，純化方法簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，適合工業(yè)化生產(chǎn)的PF1022A的分離純化方法。具體，本發(fā)明提供了一種PF1022A的分離純化方法，包括以下步驟：1）向發(fā)酵液中加入助濾劑、攪拌，板框壓濾得到菌絲渣；2）用極性溶劑浸提菌絲渣，過濾，得到浸提液；3）將浸提液濃縮至無極性溶劑流出，加入萃取溶劑進(jìn)行萃?。?）將得到的萃取有機(jī)相進(jìn)行濃縮，得到濃縮浸膏粗品A；5）將粗品A用極性溶劑結(jié)晶得到PF1022A晶體。其中，步驟1）中所述的助濾劑為珍珠巖或硅藻土；更進(jìn)一步的優(yōu)選所述助濾劑的用量為每升發(fā)酵液使用30-60g，更優(yōu)選為每升發(fā)酵液使用30-40g助濾劑；步驟2）中所述的極性溶劑為甲醇、乙醇、乙酸乙酯或其中任意混合溶劑，加入量為每千克菌絲渣使用2~5L極性溶劑；其中浸提時(shí)間可根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)的方法確定，優(yōu)選浸提6~15小時(shí)。步驟3）中所述的萃取溶劑為乙酸乙酯、乙酸丁酯或二氯甲烷；優(yōu)選其加入量為濃縮液提交的50%~100%（v/v）；萃取所需要時(shí)間是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過常規(guī)方法可以確定的，在本發(fā)明中，優(yōu)選1~4小時(shí)。步驟3）4）中所述的濃縮優(yōu)選為減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)方式進(jìn)行濃縮。步驟5）所述的極性溶劑為甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、異丙醇或其中任意的混合溶劑，優(yōu)選，所述極性溶劑用量為每克粗品A使用1~60ml極性溶劑，優(yōu)選每克粗品A使用2-30ml極性溶劑；優(yōu)選，步驟5）的具體操作為，將合適用量的上述極性有機(jī)溶劑加入到粗品A種，于合適的溫度（如30~45℃）下攪拌一定時(shí)間（如1~2小時(shí)），然后自然降溫結(jié)晶，優(yōu)選結(jié)晶時(shí)的溫度控制在2~10℃，更優(yōu)選4~8℃，結(jié)晶時(shí)間為2~16h，優(yōu)選8~12h。進(jìn)一步的，優(yōu)選將所得晶體用冰的結(jié)晶溶劑淋洗，其使用量優(yōu)選為結(jié)晶母液的1%~50%（v/v），優(yōu)選10%（v/v）。其中結(jié)晶所用的極性溶劑優(yōu)選含水量不超過20%（v/v），更優(yōu)選所述極性溶劑含水量不超過10%，最優(yōu)選所述極性溶劑含水量不超過5%，或基本不含水。上述方法中，優(yōu)選，進(jìn)一步還包括步驟6）：將步驟5）得到的晶體干燥，得到PF1022A精粉；所述的干燥為包括但不限于真空干燥，其中選擇真空干燥時(shí)，優(yōu)選溫度控制在30~40℃，干燥時(shí)間為2~16h。為達(dá)到特定或追求更高純度，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇將上述方法中步驟5）和步驟6）重復(fù)操作一次或多次。本發(fā)明技術(shù)人員通過大量的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明技術(shù)方案步驟2）中浸提溶劑的選擇對(duì)步驟5）的能否順利實(shí)現(xiàn)結(jié)晶影響非常大；例如當(dāng)步驟2）的浸提溶劑為甲醇、乙醇、乙酸乙酯或其中任意混合溶劑時(shí)，步驟5）結(jié)晶溶劑采用甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、異丙醇或其中任意的混合溶劑時(shí)，均能夠較好的完成結(jié)晶；而當(dāng)步驟2）中采用其他溶劑，如丙酮作為浸提溶劑時(shí)，經(jīng)過步驟4）濃縮得到浸膏粗品A，在下一步結(jié)晶過程中，發(fā)明人嘗試了采用各種溶劑，如甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、異丙醇或其中任意的混合溶劑以及調(diào)整結(jié)晶溫度、溶劑用量等，均難以析出晶體。雖然CN1189159A中也提到采用甲醇結(jié)晶的方法純化PF1022A，但該專利公開的方法需要在甲醇中加入大量的水，而發(fā)明人通過多次重復(fù)該方法發(fā)現(xiàn)，該專利公開的方法無法實(shí)現(xiàn)PF1022A分離純化的目的，實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)采用甲醇結(jié)晶PF1022A過程中，加入水30%或以上，甚至水含量超過20%時(shí)會(huì)直接產(chǎn)生固體沉淀，而非結(jié)晶。與CN1189159A中公開的技術(shù)方案不同的是，本發(fā)明采用含水量不超過20%的極性有機(jī)溶劑進(jìn)行結(jié)晶，特別優(yōu)選的是基本不含水的極性有機(jī)溶劑進(jìn)行結(jié)晶，結(jié)晶后通過冰的結(jié)晶溶劑淋洗晶體，純化得到的PF1022A純度好，收率高。由于本發(fā)明的技術(shù)方案不需要經(jīng)過硅膠柱層析，也不用色譜柱（HPLC制備柱）進(jìn)行分離，與現(xiàn)有技術(shù)相比，溶劑用量少，產(chǎn)生的廢液少，對(duì)環(huán)境污染小，同時(shí)也降低了生產(chǎn)成本，非常適合工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。附圖說明圖1顯示實(shí)施例1中PF1022A發(fā)酵浸提液的HPLC圖譜；圖2顯示為實(shí)施例1中PF1022A精粉的HPLC圖譜。具體實(shí)施例下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不意味著對(duì)本發(fā)明有任何限制。實(shí)施例1PF1022A發(fā)酵液放罐32L，發(fā)酵單位為320ug/ml（10.24g）。向其中加入2000g硅藻土，攪拌均勻后進(jìn)行板框壓濾，得到9.3kg濕菌絲渣，將其置于45℃烘箱中烘干至水分含量為20%，得到6.5kg的塊狀干菌絲渣。將菌絲渣用20L乙酸乙酯浸提，攪拌10小時(shí)后過濾，得到21L浸提液（純度：80.2%，HPLC的圖譜見圖1），單位為454ug/ml（9.54g）。將浸提液于50℃下濃縮至無溶劑流出，加入與濃縮液體積相等的乙酸乙酯萃取液，室溫下攪拌十分鐘后靜置1h，分液，得到萃取有機(jī)相3650ml，單位為2438ug/ml（8.90g），向其中加入一定量的無水硫酸鈉進(jìn)行有機(jī)相脫水后濃縮至膏狀，得到105g濃縮浸膏粗品A，向浸膏粗品A種，加入少量丙酮攪拌溶解完全后，置于4℃冰箱中攪拌結(jié)晶10h，抽濾并用少量的冰丙酮淋洗，得到白色的結(jié)晶體6.14g，含量為92%（5.65g），最后將濕晶體在真空度-0.9MPa，30℃下，真空加熱干燥8h，得到高純度的白色PF1022A精粉6.00g，含量為94%(5.60g)，純度為99.76%（HPLC的圖譜見圖2）。PF1022A的HPLC檢測(cè)方法：反相HPLC分析采用的色譜柱為XB-C18（5um，4.6*250mm），保持溫度在40℃。以乙腈︰水=80:20(v/v)作流動(dòng)相，流速為1.0ml/min，并在220nm下UV檢測(cè)，運(yùn)行30min。樣品用乙腈溶解成單位約500ug/ml，進(jìn)樣量為20ul。實(shí)施例2PF1022A發(fā)酵液放罐30L，發(fā)酵單位為404ug/ml(12.00g)。向其中加入1500g硅藻土，攪拌均勻后進(jìn)行減壓抽濾，得到9.1kg濕菌絲渣，向其中加入27L甲醇浸提，攪拌8小時(shí)后過濾，得到28L浸提液(HPLC的圖譜與圖1類似)，單位為401ug/ml(11.20g)。將浸提液于55℃下減壓濃縮至無溶劑流出，加入與濃縮液體積相等的二氯甲烷萃取液，室溫下攪拌十分鐘后靜置2h，分液，得到萃取有機(jī)相3730ml，單位為2560ug/ml(9.50g)，向其中加入一定量的無水硫酸鈉進(jìn)行有機(jī)相脫水后濃縮至膏狀，得到96g濃縮浸膏粗品A，向浸膏粗品A中加入少量甲醇攪拌溶解完全后，置于4℃冰箱中攪拌結(jié)晶10h，抽濾并用少量的冰甲醇淋洗，得到白色的結(jié)晶體6.82g，含量為93％(6.35g)，最后將濕晶體在真空度-0.9MPa，30℃下，真空加熱干燥6h，得到高純度的白色PF1022A精粉6.67g，含量為94.5％(6.30g)，純度為99.65％，總收率為52.50％。實(shí)施例3PF1022A發(fā)酵液放罐32L，發(fā)酵單位為368ug/ml(11.77g)。向其中加入1500g硅藻土，攪拌均勻后進(jìn)行減壓抽濾，得到8.8kg濕菌絲渣，向其中加入26L乙醇浸提，攪拌10小時(shí)后過濾，得到27L浸提液(HPLC的圖譜與圖1類似)，單位為405ug/ml(10.95g)。將浸提液于55℃下減壓濃縮至無溶劑流出，加入與濃縮液體積相等的乙酸乙酯萃取液，室溫下攪拌十分鐘后靜置2h，分液，得到萃取有機(jī)相4320ml，單位為2165ug/ml(9.34g)，向其中加入一定量的無水硫酸鎂進(jìn)行有機(jī)相脫水后濃縮至膏狀，得到105g濃縮浸膏粗品A，向浸膏粗品A中，加入少量乙醇攪拌溶解完全后，置于4℃冰箱中攪拌結(jié)晶10h，抽濾并用少量的冰乙醇淋洗，得到白色的結(jié)晶體6.86g，含量為91％(6.25g)，最后將濕晶體在真空度-0.9MPa，30℃下，真空加熱干燥6h，得到高純度的白色PF1022A精粉6.59g，含量為94％(6.20g)，純度為99.58％。實(shí)施例4PF1022A發(fā)酵液放罐33L，發(fā)酵單位為420ug/ml（13.86g）。按照實(shí)施例2的方法進(jìn)行操作得到73g濃縮浸膏粗品A，向浸膏中加入20ml甲醇溶解完全后，置于4℃冰箱中攪拌結(jié)晶10h，抽濾并用少量的冰甲醇淋洗，得到12.10g白色的結(jié)晶體B，含量為80%（9.68g），純度為89.60%（其中RRT=0.50雜質(zhì)峰面積為5.60%，RRT=0.60雜質(zhì)峰面積為3.30%）。稱取晶體B各10份于結(jié)晶瓶中，每份0.5g，編號(hào)1-10，分別加入不同的極性溶劑，45℃下攪拌溶解，晶體溶解完全后自然降溫，然后置于4℃冰箱中過夜攪拌結(jié)晶。最后過濾，用1-2ml冰甲醇淋洗，得到濕晶體C，檢測(cè)各項(xiàng)純度結(jié)果如下：表1：不同極性溶劑對(duì)晶體B的結(jié)晶效果序號(hào)不同極性溶劑或混合溶劑潮晶C純度雜質(zhì)RRT=0.50雜質(zhì)RRT=0.60結(jié)晶前——89.60%5.60%3.30%18ml甲醇+1ml水92.27%5.26%2.20%28ml甲醇94.00%4.47%1.40%35ml甲醇+5ml乙酸乙酯91.38%5.27%2.69%45ml乙醇91.53%4.50%3.60%515ml異丙醇+10ml水91.12%7.20%0.76%65ml甲醇+5mlDMSO93.00%3.67%3.04%76ml甲醇+6ml乙腈+1ml水91.37%5.24%1.84%85ml乙醇+2ml水90.02%5.05%1.78%95ml甲醇+5ml乙腈+2ml水92.08%5.34%1.72%1010mlDMF+1ml水92.07%4.10%2.46%實(shí)施例5結(jié)晶過程中極性溶劑中含水量對(duì)結(jié)晶純度的影響PF1022A發(fā)酵液放罐30L，發(fā)酵單位為404ug/ml（12.00g）。向其中加入1500g硅藻土，攪拌均勻后進(jìn)行減壓抽濾，得到9.1kg濕菌絲渣，向其中加入27L甲醇浸提，攪拌8小時(shí)后過濾，得到28L浸提液（HPLC的圖譜與圖1類似），單位為401ug/ml（11.20g）。將浸提液于55℃下減壓濃縮至無溶劑流出，加入與濃縮液體積相等的二氯甲烷萃取液，室溫下攪拌十分鐘后靜置2h，分液，得到萃取有機(jī)相3730ml，單位為2560ug/ml（9.50g），向其中加入一定量的無水硫酸鈉進(jìn)行有機(jī)相脫水后濃縮至膏狀，得到96g濃縮浸膏粗品A；向浸膏粗品A中加入如下表2中不同結(jié)晶溶劑攪拌溶解后，置于4℃冰箱中攪拌結(jié)晶10h，抽濾并用少量的冰甲醇淋洗，得到結(jié)晶體B，最后將濕晶體B在真空度-0.9MPa，30℃下，真空加熱干燥6h，得到高純度的白色PF1022A精粉，其中所采用的結(jié)晶溶劑及得到的PF1022A精粉純度如下表2所示：表2，不同含水量的極性溶劑結(jié)晶時(shí)，對(duì)PF1022A純度影響：序號(hào)結(jié)晶溶劑PF1022A精粉純度浸膏粗品A——80.78%1192ml甲醇94.00%21296ml甲醇+144ml水93.24%32160ml甲醇+720ml水產(chǎn)品直接從溶液中沉淀析出，無結(jié)晶效果4134ml甲醇+58ml水產(chǎn)品直接從溶液中沉淀析出，無結(jié)晶效果5480ml乙醇92.05%6432ml乙醇+48ml水91.65%7336ml乙醇+144ml水91.27%對(duì)比實(shí)施例1以丙酮作為浸提溶劑純化PF1022APF1022A發(fā)酵液放罐33L，發(fā)酵單位為592ug/ml（19.50g）。向其中加入2000g硅藻土，攪拌均勻后進(jìn)行減壓抽濾，得到9.7kg濕菌絲渣，向其中加入30L丙酮浸提，攪拌8小時(shí)后過濾，得到32L浸提液，單位為532ug/ml（17.02g）。將浸提液于55℃下減壓濃縮至無溶劑流出，加入與濃縮液體積相等的乙酸乙酯萃取液，室溫下攪拌十分鐘后靜置2h，分液，得到萃取有機(jī)相4260ml，單位為3361ug/ml（14.32g），向其中加入一定量的無水硫酸鈉進(jìn)行有機(jī)相脫水后濃縮至膏狀，得到134g濃縮浸膏粗品A。向浸膏粗品A中加入結(jié)晶溶劑（甲醇或丙酮或乙醇）攪拌溶解后，置于4℃冰箱中攪拌結(jié)晶10h，次日發(fā)現(xiàn)燒杯中出現(xiàn)凝結(jié)的塊狀，燒杯置于室溫條件下，塊狀固體慢慢溶解，無晶體出現(xiàn)。當(dāng)前第1頁1 2 3