本發(fā)明涉及分子生物學(xué)試劑領(lǐng)域，更特別的，涉及一種核酸蛋白提取試劑以及提取核酸和/或蛋白的方法。

背景技術(shù)：

從生物樣品中提取核酸是基因工程學(xué)或臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域中的重要過(guò)程。例如，從人體等中采集血液或組織并對(duì)其進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)，需要從血液等生物試樣中只對(duì)核酸進(jìn)行提取、純化。為了從其它成分中分離蛋白質(zhì)或核酸，對(duì)生物試樣進(jìn)行物理和化學(xué)的溶解處理后，通過(guò)提取操作來(lái)降解蛋白質(zhì)或脂質(zhì)并使核酸產(chǎn)生游離。此時(shí)，在分離純化蛋白質(zhì)或核酸的過(guò)程中，容易造成試樣的污染。作為提取的標(biāo)準(zhǔn)方法普遍使用有機(jī)溶劑，但其毒性、廢棄物處理要費(fèi)工夫，并且離心分離操作也要費(fèi)工夫以及對(duì)試樣的污染或來(lái)自試樣的感染成為問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決以上問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種核酸蛋白提取試劑，其包含0.1-0.8m的氯化鈉，0.3-1.0m的硫酸銨，0.7-1.5m的鹽酸胍以及體積分?jǐn)?shù)為10-50％的苯酚。

本發(fā)明還提供了上述核酸蛋白提取試劑在核酸和/或蛋白質(zhì)提取中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種從組織細(xì)胞樣品中提取核酸和/或蛋白質(zhì)的方法，其包括以下步驟：

s1：將所述組織細(xì)胞樣品破碎成勻漿；

s2：向所述勻漿中加入權(quán)利要求1所述的核酸蛋白提取試劑的有機(jī)溶劑稀釋液，混勻，得到提取混合液；

s3：離心所述提取混合液，分層得到水相、中層和有機(jī)相；

s4：從相應(yīng)的層中提取所述組織細(xì)胞樣品的核酸和/或蛋白質(zhì)。

優(yōu)選地，所述組織細(xì)胞樣品與所述核酸蛋白提取試劑的量的比為每50-100mg組織細(xì)胞樣品添加1ml所述核酸蛋白提取試劑。

優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑是氯仿，并且所述核酸蛋白試劑與氯仿的體積比為1：0.1-0.5。

進(jìn)一步地，所要提取的為rna，從所述水相中提取，并且s4具體包括：

s411：取s3中的水相，加入異丙醇使rna析出；

s412：離心后得到沉淀，用體積分?jǐn)?shù)75％乙醇洗滌離心，得到的沉淀即所述組織細(xì)胞樣品的總rna。

優(yōu)選地，當(dāng)所述組織細(xì)胞樣品的量比較少時(shí)，加入糖原促進(jìn)rna析出。

進(jìn)一步地，所要提取的為dna，從所述中層和有機(jī)相中提取，并且s4具體包括：

s421：取所述中層和有機(jī)相，去除其中的水分，并向其中添加純乙醇，使dna析出；

s422：離心后得到沉淀，依次用0.1m檸檬酸鈉溶液和純乙醇洗滌離心,得到的沉淀即為所述組織細(xì)胞樣品中的dna，所述檸檬酸鈉溶液中含有體積分?jǐn)?shù)為10％的乙醇，并且ph為8.5。

進(jìn)一步地，所要提取的是蛋白質(zhì)，并且s4具體包括：

s431：取所述中層和有機(jī)相，去除其中的水分，并向其中添加純乙醇，使dna析出；

s432：離心后，取上清液，向其中加入異丙醇，使蛋白質(zhì)析出；

s433：離心得到沉淀，依次用0.3m的鹽酸胍溶液和純乙醇洗滌離心，得到的沉淀即為所述組織細(xì)胞樣品中的蛋白質(zhì)，所述鹽酸胍溶液的溶劑為體積分?jǐn)?shù)為95％的乙醇溶液。

本發(fā)明的核酸蛋白提取試劑和方法提取效率高，得到核酸和蛋白質(zhì)的完整性好，并且提取方法簡(jiǎn)單方便，不易污染樣品，也不會(huì)對(duì)人體發(fā)生危害。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的核酸蛋白提取試劑和trizol提取的小鼠肺的總rna的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道1為trizol提取的rna，泳道2為核酸蛋白提取試劑提取的rna；

圖2為本發(fā)明的核酸蛋白提取試劑和trizol提取的小鼠腎的總rna的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道1為trizol提取的rna，泳道2為核酸蛋白提取試劑提取的rna；

圖3為本發(fā)明的核酸蛋白提取試劑和trizol提取的小鼠肌肉的總rna的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道1為trizol提取的rna，泳道2為核酸蛋白提取試劑提取的rna。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

使用本發(fā)明的核酸蛋白提取試劑提取核酸蛋白的方法：

1.核酸蛋白提取試劑處理樣品

1)每50～100mg的樣品組織加入1ml的核酸蛋白提取試劑，用組織細(xì)胞破碎儀破碎后，室溫靜置5～6分鐘；

2)按每毫升核酸蛋白提取試劑加入200ul氯仿的比例加入氯仿至上述已勻漿樣品中；

3)上下劇烈顛倒樣品管，混勻樣品，持續(xù)15秒；

4)室溫靜置混勻的樣品2-3分鐘；

5)樣品4℃以12000g離心15分鐘；

6)將上層水相(含rna)取至新的離心管，進(jìn)行rna的進(jìn)一步分離；注意不要觸動(dòng)中間層和下層有機(jī)相。

7)中間層和有機(jī)相進(jìn)行dna和蛋白質(zhì)的進(jìn)一步分離。

2.rna的提取

1)當(dāng)處理的樣品量比較小(少于1×10⁶細(xì)胞或少于10mg組織)時(shí)，將上清中將入5-10μg的無(wú)rnase糖原幫助rna沉淀；

2)按照每毫升核酸蛋白提取試劑加入500ul的比例加入100％的異丙醇在上述的水相中；

3)室溫作用10分鐘；

4)樣品4℃以12000g離心10分鐘；

5)去除上清；

6)按照每毫升核酸蛋白提取試劑加入1ml的比例加入75％的乙醇；

7)將離心管顛倒兩次，4℃以7,500g離心5分鐘；

8)將沉淀適當(dāng)吹干；

9)用20-50μl的無(wú)rnase水或0.5％sds溶液重懸沉淀；

10)水浴或加熱塊于55-60℃作用10-15分鐘；

11)樣品可進(jìn)行后續(xù)應(yīng)用或保存于-70℃.

3.dna的提?。?/p>

1)充分去掉中間層和有機(jī)相上的水分；

2)按照每毫升核酸蛋白提取試劑加入300ul的比例加入100％乙醇在上述樣品管中；

3)上下顛倒混勻樣品；

4)混勻后的樣品室溫放置2-3分鐘；

5)4℃以2000g離心5分鐘沉淀dna；

6)將酚-乙醇上清取出到新的離心管中，進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離；

7)沉淀按照每毫升核酸蛋白提取試劑加入1ml的比例加入0.1m檸檬酸鈉(10％乙醇配制，ph8.5)；

8)室溫作用30分鐘，期間適當(dāng)溫和顛倒離心管以混合樣品；

9)4℃以2000g離心5分鐘，去除上清；

10)重復(fù)步驟7-9過(guò)程1次，當(dāng)dna樣品量大于200μg時(shí)重復(fù)2次；

11)按照每毫升核酸蛋白提取試劑加入1.5-2ml的比例加入75％乙醇；

12)室溫作用10-20分鐘，期間適當(dāng)溫和顛倒離心管以混合樣品；

13)4℃以2000g離心5分鐘，去除上清；

14)適當(dāng)吹干dna樣品；

15)按照每50-70mg組織樣品或1×10⁷細(xì)胞量加入300-600μl的比例加入8mm的naoh，重懸dna；

16)4℃以12000g離心10分鐘，上清移至新的離心管，去除不溶物；

17)上清根據(jù)后續(xù)應(yīng)用進(jìn)行處理或保存。

3.蛋白質(zhì)的提?。?/p>

上述dna分離過(guò)程中取出的酚-乙醇上清進(jìn)行蛋白質(zhì)分離。

1)按照每毫升核酸蛋白提取試劑加入1.5毫升異丙醇的比例在酚-乙醇上清中加入異丙醇；

2)混勻后室溫靜置10分鐘；

3)樣品4℃以12000g離心10分鐘沉淀蛋白質(zhì)，去除上清；

4)沉淀的蛋白質(zhì)進(jìn)行洗滌步驟；

5)按照每毫升核酸蛋白提取試劑加入2毫升的比例，加入0.3m鹽酸胍(95％乙醇配制)；

6)室溫作用20分鐘；

7)樣品4℃以7500g離心5分鐘，去除洗滌上清；

8)重復(fù)5-7步驟，2次或更多；

9)加入2ml的100％乙醇在最后一次洗滌的蛋白沉淀中并振蕩；

10)室溫作用20分鐘；

11)樣品4℃以7500g離心5分鐘，去除乙醇上清；

12)將沉淀樣品風(fēng)干，但不用完全干；

13)加入1％的sds溶液200ul將蛋白質(zhì)重懸，完全溶解蛋白質(zhì)需將樣品進(jìn)行50℃水??；

14)樣品4℃以10000g離心10分鐘，去除不溶物質(zhì)；

15)將上清移至新的管子進(jìn)行后續(xù)所需的應(yīng)用。

4.rna的定量：

1)樣品用無(wú)rnase水適當(dāng)稀釋?zhuān)y(cè)量260nm和280nm吸收值。

2)利用公式a260×稀釋度×40＝ugrna/ml得出濃度

5.dna的定量：

1)樣品用水或ph>7.5緩沖液適當(dāng)稀釋?zhuān)y(cè)量260nm和280nm的吸收值

2)利用公式a260×稀釋度×50＝ugrna/ml得出濃度

6.蛋白質(zhì)的定量：

可根據(jù)bradford法，注該法測(cè)量時(shí)樣品中的sds濃度不能超過(guò)0.1％。

7.與市場(chǎng)上的在售商品的比較

用本發(fā)明的核酸蛋白提取試劑和市場(chǎng)上在售的trizol分別對(duì)小鼠的肺、腎和肌肉組織提取rna，其比較結(jié)果如表1和圖1、2和3所示，從瓊脂糖凝膠電泳圖可知，兩種試劑提取的rna都很完整，測(cè)量rna濃度，本發(fā)明的核酸蛋白提取試劑提取得到的rna濃度比trizol高。

表1本發(fā)明的核酸蛋白提取試劑和trizol提取的rna的比較

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。