本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體是一種用于篩選、純化灰葡萄孢菌的改良培養(yǎng)基及其配制方法。

背景技術(shù)：

灰霉病是北方的保護(hù)地蔬菜非常重要的病害之一，茄科蔬菜以番茄、辣椒和茄子受害最重，20世紀(jì)70年代后期，灰霉病在我國(guó)發(fā)展迅速，危害日益嚴(yán)重，在早春造成大量爛果，造成減產(chǎn)普遍達(dá)20～30％，嚴(yán)重時(shí)甚至高達(dá)50％左右。農(nóng)業(yè)上對(duì)番茄灰霉病的防治投入較大但是效果均不理想，而灰霉病病原菌灰葡萄孢菌又易對(duì)殺菌劑產(chǎn)生抗藥性，而且還會(huì)帶來(lái)環(huán)境污染、食品安全、抗藥性等一系列問(wèn)題。因此對(duì)于番茄灰霉病的防治迫切需要一種低毒、高效的防治措施，將病害損失控制在經(jīng)濟(jì)閥值以下。在眾多防治方法中生物防治由于其低殘留、低污染的特性而凸顯出優(yōu)勢(shì)，成為目前研究的重點(diǎn)。

為了推進(jìn)微生物防治灰霉病工作的發(fā)展，快速準(zhǔn)確的獲取灰霉病病原菌灰葡萄孢菌成為一項(xiàng)非常重要的工作。

目前培養(yǎng)灰葡萄孢菌常用的培養(yǎng)基是馬鈴薯－蔗糖－瓊脂培養(yǎng)基或馬鈴薯－葡萄糖－麥芽汁－瓊脂培養(yǎng)基等(pda培養(yǎng)基)，這些培養(yǎng)基不但價(jià)格昂貴，培養(yǎng)菌種、孢子的效果還不穩(wěn)定，且配制使用不方便，篩選效果不明顯。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于解決上述技術(shù)問(wèn)題，提供一種用于篩選、純化灰葡萄孢菌的改良培養(yǎng)基，該改良培養(yǎng)基以易感染灰葡萄孢菌的番茄或圣女果為出發(fā)點(diǎn)，番茄中的果酸經(jīng)高溫煮沸后釋放，使培養(yǎng)基整體的ph維持在3～4(灰葡萄孢菌的最適宜生長(zhǎng)ph為3.5)，在促進(jìn)灰葡萄孢菌生長(zhǎng)的同時(shí)還能抑制雜菌的生長(zhǎng)，而且番茄中含的中、微量元素，也能加快灰葡萄孢菌的生長(zhǎng)，有利于灰葡萄孢菌的篩選和純化。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種用于篩選、純化灰葡萄孢菌的改良培養(yǎng)基，每1000ml培養(yǎng)基包含以下原料配方：番茄或圣女果300g、速效碳源20～30g、速效氮源20～30g、蒸餾水1000ml，其中速效碳源為葡萄糖，速效氮源為蛋白胨或玉米漿水解液。

優(yōu)選地，每1000ml培養(yǎng)基包含以下原料配方：番茄或圣女果300g、葡萄糖20g、蛋白胨25g、蒸餾水1000ml或每1000ml培養(yǎng)基包含以下原料配方：番茄或圣女果300g、葡萄糖25g、玉米漿水解液30g、蒸餾水1000ml。

當(dāng)需要配制固體培養(yǎng)基時(shí)需要添加瓊脂粉30～40g，而配制液體培養(yǎng)基不需要瓊脂粉。

為簡(jiǎn)單說(shuō)明問(wèn)題起見(jiàn)，以下對(duì)本發(fā)明所述的用于篩選、純化灰葡萄孢菌的改良培養(yǎng)基均簡(jiǎn)稱為本發(fā)明的改良培養(yǎng)基。

灰霉病高發(fā)于果蔬果實(shí)體上，故本發(fā)明選取容易感染灰葡萄孢菌的番茄或圣女果作為改良培養(yǎng)基的出發(fā)點(diǎn)，每100g新鮮的番茄中含有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如下：鈣8mg～10mg；脂肪0.2g～0.3g；碳水化合物2g～4g；磷22mg～26mg；鐵0.6mg～0.9mg；鎂15mg～18mg；鉀240mg～270mg；鈉8mg～10mg；胡蘿卜素0.3mg～0.5mg；維生素b0.04mg；硫胺素0.3mg～0.4mg；核黃素0.01mg～0.02mg；煙酸0.5mg～0.7mg；維生素c10mg～25mg；蛋白質(zhì)含量為0.7g～0.9g，所含的糖主要是葡萄糖和果糖，果酸主要是檸檬酸和蘋果酸。圣女果作為番茄的一個(gè)品種，其營(yíng)養(yǎng)組分與番茄大體一樣，但是圣女果果實(shí)較小，可避免在配制較小量培養(yǎng)基時(shí)因切取其中的某一部分造成的營(yíng)養(yǎng)成分與整個(gè)果實(shí)有差別，所以本發(fā)明優(yōu)選圣女果作為改良培養(yǎng)基的原料。

番茄(或圣女果)中豐富的中、微量元素能促進(jìn)灰葡萄孢菌的孢子生長(zhǎng)，使菌株生長(zhǎng)成熟；豐富的果酸(其中主要為檸檬酸和蘋果酸)配合滅菌時(shí)產(chǎn)生的高溫能在一定程度上促進(jìn)玉米漿水解液中不完全分解的多肽進(jìn)一步分解為氨基酸，提高氮源的利用率；番茄堿是一種高效抗菌物，在篩選灰葡萄孢菌的過(guò)程中能抑制雜菌的生長(zhǎng)，同時(shí)，高溫煮沸后，番茄中的大量果酸得以釋放，使培養(yǎng)基整體的ph維持在3～4(灰葡萄孢菌的最適宜生長(zhǎng)ph為3.5)，在促進(jìn)灰葡萄孢菌快速生長(zhǎng)的同時(shí)，也能抑制雜菌的生長(zhǎng)，有利于灰葡萄孢菌的篩選、純化。

本發(fā)明的改良培養(yǎng)基中含有的中、微量元素能最大限度的促進(jìn)灰葡萄孢菌孢子的生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)觀察后發(fā)現(xiàn)，相同實(shí)驗(yàn)條件下，本發(fā)明的改良培養(yǎng)基上灰葡萄孢菌經(jīng)過(guò)7天生長(zhǎng)后即呈現(xiàn)深褐色(生長(zhǎng)完全成熟)，但pda培養(yǎng)基上的灰葡萄孢菌，培養(yǎng)10天后，仍表現(xiàn)為灰綠色，無(wú)法生長(zhǎng)成熟。本發(fā)明的改良培養(yǎng)基還具有良好的抑制雜菌生長(zhǎng)的功能，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相同培養(yǎng)條件下，本發(fā)明的改良培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)均一，無(wú)雜菌生長(zhǎng)，但在對(duì)照組pda培養(yǎng)基上上發(fā)現(xiàn)有白色菌株，為雜菌。使用本改良培養(yǎng)基，能夠加快灰葡萄孢菌的生長(zhǎng)，普通pda培養(yǎng)基須培養(yǎng)到第5天左右才能長(zhǎng)出孢子，但本發(fā)明的改良培養(yǎng)基在第3～4天就能長(zhǎng)出孢子。

本發(fā)明還提供了這種用于篩選、純化灰葡萄孢菌的改良培養(yǎng)基的配制方法，包括以下步驟：

(1)、選取成熟的番茄或圣女果300g，洗凈后切成塊，榨汁，取榨汁過(guò)后的汁液，加300～500ml蒸餾水煮10～15min，然后用8層紗布過(guò)濾，取濾液；

(2)、依次向?yàn)V液中加入速效碳源20～30g和速效氮源20～30g，加熱并攪拌至溶解；

(3)、冷卻到室溫后補(bǔ)加蒸餾水到1000ml；

(4)、分裝到試管或錐形瓶中，加塞、包扎，放入高壓蒸汽滅菌鍋中，115℃滅菌30min，滅菌結(jié)束后，取出試管或錐形瓶擺斜面或者搖勻，冷卻后貯存；

所述的速效碳源為葡萄糖，速效氮源為蛋白胨或玉米漿水解液。

如果需要配制固體培養(yǎng)基，則還需在步驟(2)向?yàn)V液中加入瓊脂粉30～40g，并加熱攪拌使其融化。

本發(fā)明的改良培養(yǎng)基的配制方法簡(jiǎn)單易操作、環(huán)境要求低、制作成本低，本發(fā)明配制的改良培養(yǎng)基能最大限度的促進(jìn)灰葡萄孢菌生長(zhǎng)，并能抑制雜菌的生長(zhǎng)，有利于灰葡萄孢菌的篩選和純化。

附圖說(shuō)明

圖1是培養(yǎng)第3天時(shí)，改良培養(yǎng)基與pda培養(yǎng)基上灰葡萄孢菌的生長(zhǎng)情況對(duì)照?qǐng)D。

圖2是培養(yǎng)第4天時(shí)，改良培養(yǎng)基與pda培養(yǎng)基上灰葡萄孢菌的生長(zhǎng)情況對(duì)照?qǐng)D。

圖3是培養(yǎng)第5天時(shí)，改良培養(yǎng)基與pda培養(yǎng)基上灰葡萄孢菌的生長(zhǎng)情況對(duì)照?qǐng)D。

圖4是培養(yǎng)第6天時(shí)，改良培養(yǎng)基與pda培養(yǎng)基上灰葡萄孢菌的生長(zhǎng)情況對(duì)照?qǐng)D。

圖5是培養(yǎng)第7天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組1上生長(zhǎng)的灰葡萄孢菌的鏡檢圖。

圖6是培養(yǎng)第7天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組2上生長(zhǎng)的灰葡萄孢菌的鏡檢圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

(1)、選取成熟的圣女果300g，洗凈后切成塊，用榨汁機(jī)榨汁，取榨汁過(guò)后的汁液，加500ml蒸餾水煮15分鐘，然后用8層紗布過(guò)濾，取濾液；

(2)、依次向?yàn)V液中加入葡萄糖20g、蛋白胨25g和瓊脂粉40g，加熱并不停用玻璃棒攪拌至溶解；

(3)、冷卻到室溫后補(bǔ)加蒸餾水到1000ml；

(4)、分裝到錐形瓶中，加塞、包扎，放入高壓蒸汽滅菌鍋中，115℃滅菌30min，滅菌結(jié)束后，取出錐形瓶適當(dāng)冷卻后倒入平板中，平板放置冷卻凝固后備用。

實(shí)施例2

按照實(shí)施例1的配制方法，僅改變碳源和氮源的種類，配制了12種固體培養(yǎng)基，在每個(gè)平板培養(yǎng)基的表面放置一塊圓形玻璃紙，確保其能覆蓋住整個(gè)培養(yǎng)基，每個(gè)玻璃紙做上標(biāo)記，稱量并記下重量。然后在超凈工作臺(tái)上用移液槍移取100μl適宜濃度的灰葡萄孢菌孢子懸浮液滴加在玻璃紙上面，進(jìn)行平板涂布，接種好后，放在霉菌培養(yǎng)箱中25℃、80％濕度條件下培養(yǎng)7天，7天后揭取玻璃紙放置烘箱里，80～100℃烘至恒重，然后使用電子天平準(zhǔn)確稱量，所稱量的結(jié)果減去玻璃紙本身的重量即為菌種生長(zhǎng)7天的生物量，結(jié)果如表1所示：

表1不同碳源和氮源配制的改良培養(yǎng)基對(duì)灰葡萄孢菌的培養(yǎng)情況：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：培養(yǎng)灰葡萄孢菌最適宜的碳源為葡萄糖，最合適的氮源為蛋白胨或玉米漿水解液。葡萄糖為速效碳源，為糖的最基本單位，玉米漿水解液和蛋白胨均為速效氮源，其絕大部分組成為小分子氨基酸和多肽，相較于其它大分子碳、氮源，葡萄糖、蛋白胨和玉米漿水解液可被微生物充分利用，更適合灰葡萄孢菌的生長(zhǎng)。

實(shí)施例3

按照實(shí)施例1的配制方法，僅改變葡萄糖和蛋白胨的用量，配制了一系列固體培養(yǎng)基，在每個(gè)平板培養(yǎng)基表面放置一塊圓形玻璃紙，確保其能覆蓋住整個(gè)培養(yǎng)基，每個(gè)玻璃紙做上標(biāo)記，稱量并記下重量。然后在超凈工作臺(tái)上用移液槍移取100μl灰葡萄孢菌孢子懸浮液滴加在玻璃紙上面，進(jìn)行平板涂布，接種好后，放在霉菌培養(yǎng)箱中25℃、80％濕度條件下培養(yǎng)7天，7天后揭取玻璃紙放置烘箱里，80～100℃烘至恒重，然后使用電子天平準(zhǔn)確稱量，所稱量的結(jié)果減去玻璃紙本身的重量即為菌種生長(zhǎng)7天的生物量，結(jié)果如表2所示：

表2不同葡萄糖及蛋白胨用量配制的系列培養(yǎng)基對(duì)灰葡萄孢菌的培養(yǎng)情況：

結(jié)果表明，當(dāng)葡萄糖加入量為20～30g、蛋白胨的加入量是20～30g時(shí)，配制的培養(yǎng)基上灰葡萄孢菌的生長(zhǎng)情況均優(yōu)于其他用量配制的培養(yǎng)基，而且當(dāng)葡萄糖加入量為20g、蛋白胨的加入量為25g時(shí)菌種的生長(zhǎng)情況最好。

實(shí)施例4

(1)、選取成熟的圣女果300g，洗凈后切成塊，用榨汁機(jī)榨汁，取榨汁過(guò)后的汁液，加300ml蒸餾水煮10分鐘，然后用8層紗布過(guò)濾，取濾液；

(2)、依次向?yàn)V液中加入葡萄糖25g、玉米漿水解液30g和瓊脂粉30g，加熱并不停用玻璃棒攪拌至溶解；

(3)、冷卻到室溫后補(bǔ)加蒸餾水到1000ml；

(4)、分裝到錐形瓶中，加塞、包扎，放入高壓蒸汽滅菌鍋中，115℃滅菌30min，滅菌結(jié)束后，取出錐形瓶適當(dāng)冷卻后倒入平板中，平板放置冷卻凝固后備用。

其中，玉米漿水解液可按照下述方法制備：取1只500ml的三角瓶，按照料酸比1:2的比例依次添加100ml玉米漿(總氮3％～4％)和200ml濃度為25％硫酸，添加硫酸時(shí)一邊添加一邊用玻璃棒攪拌，攪拌均勻后，采用耐酸板框?yàn)V布封口，置于立式壓力蒸汽滅菌器，設(shè)定工作溫度為105℃，進(jìn)行高溫高壓水解過(guò)程，當(dāng)滅菌器工作時(shí)間達(dá)到其上限后重新設(shè)定工作溫度并啟動(dòng)，循環(huán)工作使水解總時(shí)間達(dá)到10h，水解結(jié)束后取出水解液，自然冷卻后，經(jīng)板框過(guò)濾，濾液即為玉米漿水解液。

實(shí)施例5

按照實(shí)施例4的配制方法，僅改變葡萄糖和玉米漿水解液的用量，配制了一系列固體培養(yǎng)基，在每個(gè)平板培養(yǎng)基表面放置一塊圓形玻璃紙，確保其能覆蓋住整個(gè)培養(yǎng)基，每個(gè)玻璃紙做上標(biāo)記，稱量并記下重量。然后在超凈工作臺(tái)上用移液槍移取100μl灰葡萄孢菌孢子懸浮液滴加在玻璃紙上面，進(jìn)行平板涂布，接種好后，放在霉菌培養(yǎng)箱中25℃、80％濕度條件下培養(yǎng)7天，7天后揭取玻璃紙放置烘箱里，80～100℃烘至恒重，然后使用電子天平準(zhǔn)確稱量，所稱量的結(jié)果減去玻璃紙本身的重量即為菌種生長(zhǎng)7天的生物量，結(jié)果如表3所示：

表3不同葡萄糖及玉米漿水解液用量配制的系列培養(yǎng)基對(duì)灰葡萄孢菌的培養(yǎng)情況：

結(jié)果表明，當(dāng)葡萄糖加入量為20～30g、玉米漿水解液的加入量是20～30g時(shí)，配制的培養(yǎng)基上灰葡萄孢菌的生長(zhǎng)情況均優(yōu)于其他用量配制的培養(yǎng)基，而且當(dāng)葡萄糖加入量為25g、蛋白胨的加入量為30g時(shí)菌種的生長(zhǎng)情況最好。

對(duì)比實(shí)驗(yàn)：

實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)的pda培養(yǎng)基(顏色為乳白色)作為對(duì)照組，實(shí)施例1配制的改良培養(yǎng)基(顏色為棕黃色)為實(shí)驗(yàn)組1，實(shí)施例4配制的為改良培養(yǎng)基(顏色為深棕黃色)為實(shí)驗(yàn)組2，菌種篩選樣本為感染了灰霉病的番茄。

(1)、實(shí)試驗(yàn)流程：

按照本發(fā)明實(shí)施例1和實(shí)施例4的配制方法配制的改良培養(yǎng)基分別作為實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2，再按照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》第4版上關(guān)于pda培養(yǎng)基的配制方法配制100mlpda培養(yǎng)基作為對(duì)照組。配制好后，均115℃滅菌30min后，分別倒入12個(gè)平板中備用。

用移液槍吸取100μl事先配制好的適宜濃度的灰葡萄孢菌孢子懸浮液滴加至上述12個(gè)平板中，涂布，再置于霉菌培養(yǎng)箱中，25℃、80％濕度條件下培養(yǎng)。

(2)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

培養(yǎng)7天后，改良培養(yǎng)基上的灰葡萄孢菌基本已經(jīng)生長(zhǎng)成熟，鏡檢后初步認(rèn)定為灰葡萄孢菌(鏡檢結(jié)果如圖5、圖6所示)，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示：

表4：對(duì)比實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(3)、對(duì)比結(jié)果：

從表4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，灰葡萄孢菌在改良培養(yǎng)基(實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2)上生長(zhǎng)成熟所需時(shí)間較短(7天左右)，且不生長(zhǎng)雜菌，使用改良培養(yǎng)基，能快速準(zhǔn)確的篩選出目標(biāo)菌種灰葡萄孢菌；培養(yǎng)到第2天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組1(圖1中b1、b2)和實(shí)驗(yàn)組2的菌種都開(kāi)始生長(zhǎng)，而且都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)雜菌的出現(xiàn)，此時(shí)對(duì)照組沒(méi)有生長(zhǎng)。培養(yǎng)到第3天時(shí)，對(duì)照組(圖1中a1、a2)也開(kāi)始生長(zhǎng)，如圖1所示。在培養(yǎng)到第4天時(shí)，對(duì)照組(圖2中a1、a2)與實(shí)驗(yàn)組1(圖2中b1、b2)和實(shí)驗(yàn)組2中菌落顏色開(kāi)始發(fā)生差別，實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2因?yàn)殚_(kāi)始產(chǎn)生大量孢子使菌落呈現(xiàn)出灰綠色，而對(duì)照組只有少量孢子產(chǎn)生呈現(xiàn)菌絲特有的白色，并且對(duì)照組有雜菌出現(xiàn)(圖2中圓圈內(nèi))。培養(yǎng)到第五天時(shí)，對(duì)照組(圖3中a1、a2)出現(xiàn)灰綠色，因?yàn)閷?duì)照組也開(kāi)始產(chǎn)生較多孢子，隨著培養(yǎng)時(shí)間的加長(zhǎng)，灰葡萄孢菌的孢子數(shù)量越來(lái)越多，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中菌落的顏色逐漸加深，菌落直徑慢慢變大，但總體上，實(shí)驗(yàn)組1、2中菌落直徑增長(zhǎng)更快。培養(yǎng)第7天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組1、2和對(duì)照組的菌落均已不再變大，實(shí)驗(yàn)組菌落已經(jīng)變成褐色，表現(xiàn)為生長(zhǎng)成熟，但對(duì)照組菌落依然為灰綠色(繼續(xù)觀察至第10天，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的菌株依然為灰綠色)，據(jù)此推斷傳統(tǒng)的pda培養(yǎng)基無(wú)法使灰葡萄孢菌生長(zhǎng)成熟，不利于灰葡萄孢菌的篩選、純化。

上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的僅為本發(fā)明的優(yōu)選例，并不用來(lái)限制本發(fā)明，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。