本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種含有羥肟酸基團(tuán)的氮芥類(lèi)化合物及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

氮芥類(lèi)藥物，如苯丁酸氮芥、鹽酸苯達(dá)莫司汀等，是最早用于臨床并取得突出療效的烷化劑類(lèi)抗腫瘤藥物。該類(lèi)藥物可直接破壞細(xì)胞DNA而殺死細(xì)胞。此類(lèi)藥物對(duì)癌細(xì)胞沒(méi)有選擇性，因此具有很強(qiáng)的毒副作用，限制了其臨床應(yīng)用。

組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase，HAT)為真核細(xì)胞中廣泛存在的的一類(lèi)相互拮抗的蛋白酶，它們共同調(diào)控著組蛋白末端氨基酸殘基的乙酰化，使之處于平衡狀態(tài)。組蛋白的乙?；腿ヒ阴；揎棡檎{(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的一種方式，組蛋白的乙?；潭韧ㄟ^(guò)影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響基因的表達(dá)。在腫瘤細(xì)胞中HDAC過(guò)量表達(dá)，從而抑制了某些抑癌基因的表達(dá)。近年來(lái)，HDAC抑制劑已成為重要的抗腫瘤作用的靶標(biāo)，其中有一類(lèi)具有苯甲酰胺結(jié)構(gòu)的HDAC抑制劑具有良好的口服生物活性和抗腫瘤活性而受到人們的關(guān)注。許多酰胺類(lèi)HDAC抑制劑正處于臨床研究階段，其中Tacedinaline(CI-994)對(duì)HDAC顯示出一定的抑制活性，具有廣譜的抗腫瘤活性，成為第一個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的酰胺類(lèi)HDAC抑制劑，CI-994目前在Ⅱ期臨床試驗(yàn)中與吉西他濱聯(lián)用治療非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌等實(shí)體瘤患者。

上式是本專(zhuān)利化合物結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)策略

目前，靶向治療已成為癌癥治療的重要方向，多采用一藥一靶點(diǎn)的治療模式。但是，腫瘤異于一般疾病，他的生長(zhǎng)和存活不僅依賴于一種受體或一種信號(hào)通路的傳導(dǎo)，這就使得單純作用于一個(gè)靶點(diǎn)的策略并不能徹底殺死腫瘤細(xì)胞，并容易產(chǎn)生抗藥性。于是，多種藥物聯(lián)合用藥成為癌癥臨床治療的主要手段，雖然在一定程度上能達(dá)到預(yù)期的治療效果，但由于多種藥物彼此間容易發(fā)生相互作用，如對(duì)藥物的吸收和代謝產(chǎn)生影響，即使沒(méi)有相互作用，這些藥物通常也不能以它們單獨(dú)應(yīng)用時(shí)的劑量聯(lián)用，為此，藥物研究者借鑒多種藥物聯(lián)合用藥的原理，采用藥效團(tuán)拼合的方法，將兩種或兩種以上的藥效團(tuán)拼合成一個(gè)分子，使這個(gè)分子本身或其代謝產(chǎn)物作用于兩個(gè)或更多的靶點(diǎn)，從而產(chǎn)生協(xié)同作用以提高療效。

本專(zhuān)利發(fā)明人創(chuàng)造性地將具有HDAC抑制活性的苯甲酰胺結(jié)構(gòu)引入到苯丁酸氮芥的結(jié)構(gòu)中，合成了含有苯甲酰胺基團(tuán)的氮芥類(lèi)化合物，該類(lèi)化合物兼具有氮芥基團(tuán)的抗腫瘤活性，又具有對(duì)HDAC的抑制活性。體外抗腫瘤細(xì)胞活性、對(duì)腫瘤細(xì)胞單克隆形成影響、對(duì)腫瘤細(xì)胞周期影響以及對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡影響進(jìn)行評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，本專(zhuān)利中的化合物出比母體藥物苯丁酸氮芥的抗腫瘤活性提高了4至20倍，比母體藥物鹽酸苯達(dá)莫司汀的藥效強(qiáng)9至46倍。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一類(lèi)化合物的設(shè)計(jì)與合成，為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，本發(fā)明提供一種抗腫瘤活性更好的含有羥肟酸基團(tuán)的氮芥類(lèi)化合物及其制備方法和用途。本發(fā)明之所以能夠解決上述問(wèn)題乃是通過(guò)以下技術(shù)方案給予實(shí)現(xiàn)：

在本發(fā)明的第一方面，提供了具有通式I所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或其溶劑合物或其前藥分子：

其中，

X₁、X₂、X₃、X₄各自獨(dú)立地選自氫、烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基、烯基、炔基、氨基、羥基、巰基、羧基、烷氧基、環(huán)烷氧基、鹵代芳基，烷氧基羰基、鹵素、氰基、酰胺基、硫氰基、異硫氰基、脲基、磺基；

Z選自烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基、烯基、炔基，上述烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基、烯基、炔基任選不取代或被一個(gè)或多個(gè)取代基所取代，所述取代基各自獨(dú)立地選自烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基、烯基、炔基、氨基、羥基、巰基、羧基、烷氧基、環(huán)烷氧基、鹵素、氰基、硝基、亞硝基、磺基；

X₅、X₆、X₇、X₈各自獨(dú)立地選自氫、烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基、烯基、炔基、氨基、羥基、巰基、羧基、烷氧基、環(huán)烷氧基、鹵代芳基，烷氧基羰基、鹵素、氰基、酰胺基、硫氰基、異硫氰基、脲基、磺基。

在本發(fā)明的第一方面的優(yōu)先實(shí)施方式中，所述的化合物優(yōu)先選自以下特征：

X₁、X₂、X₃、X₄各自獨(dú)立地選自氫、烷基、烷氧基、環(huán)烷氧基、烷氧基羰基、鹵素、氰基、硝基、亞硝基、酰胺基；

Z選自烷基、芳基、烯基、炔，上述烷基、芳基、烯基任選不取代或被一個(gè)或多個(gè)取代基所取代，所述取代基各自獨(dú)立地選自烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基、烯基、炔基、氨基、羥基、巰基、羧基、烷氧基、環(huán)烷氧基、鹵素、氰基、磺基；

X₅、X₆、X₇、X₈各自獨(dú)立地選自氫、烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基、氨基、羥基、巰基、烷氧基、環(huán)烷氧基、鹵素。

在本發(fā)明的第一方面的最優(yōu)選實(shí)施方式中，提供了以下具體化合物：

表1本發(fā)明合成其中一部分的化合物

在本發(fā)明的第二方面，提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含：本發(fā)明第一方面所述化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或其溶劑合物或其前藥分子。

在本發(fā)明的第三方面，提供了上述通式Ⅰ化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽或其溶劑合物或其前藥分子在制備用于治療或預(yù)防抗腫瘤、抗癌的藥物方面的用途。

在本發(fā)明的第三方面的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述腫瘤或癌癥選自于黑色素瘤、胃癌、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、結(jié)腸癌、直腸癌、淋巴癌、血癌、骨髓癌、腦癌、皮膚癌、骨癌、鼻咽癌、胰腺癌、腎癌、甲狀腺癌、前列腺癌，膀胱癌、食管癌、乳腺癌。

在本發(fā)明的第四方面，提供制備上述通式Ⅰ化合物的方法，該方法包括如下步驟：

(a)將化合物1的羧基變?yōu)轷Ｂ鹊玫交衔?；

(b)將化合物2與化合物3反應(yīng)得到化合物4

(c)將化合物4的硝基還原為氨基得到化合物5

其中Z、X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇和X₈為本發(fā)明的第一方面提供化合物的通式I中所定義。

在本發(fā)明的第四方面的優(yōu)選實(shí)施方式中，反應(yīng)步驟(a)中將化合物1的羧基變?yōu)轷Ｂ人玫脑噭┻x自氯化試劑和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的組合，其中氯化試劑選自:二氯亞砜、草酰氯、三氯氧磷、三氯化磷、五氯化磷、磺酰氯、五氯化磷；反應(yīng)步驟(c)所用硝基還原試劑選自活潑金屬與酸的組合，其中活潑金屬選自：鋅、鐵和錫，酸選自：鹽酸、硫酸、丙酸、乙酸、甲酸、磷酸；

在本發(fā)明的第五方面，提供制備上述通式Ⅰ化合物的另一種方法，該方法包括如下步驟：

將化合物P與化合物Q在肽縮合劑作用下反應(yīng)得到化合物M

其中Z、X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇和X₈為本發(fā)明的第一方面提供化合物的通式I中所定義。

在本發(fā)明的第五方面的優(yōu)選實(shí)施方式中，反應(yīng)中所用肽縮合劑選自:

苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸鹽、

六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、

N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺、

O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸。

附圖說(shuō)明

圖1：化合物對(duì)HeLa細(xì)胞核HDAC酶的抑制活性

圖2：化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞單克隆形成能力的影響

具體實(shí)施方式

本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“烷基”是指僅由碳原子和氫原子組成、且不具有不飽和度(例如雙鍵、三鍵或環(huán))的基團(tuán)，其涵蓋了各種可能的幾何異構(gòu)基團(tuán)與立體異構(gòu)基團(tuán)。該基團(tuán)通過(guò)單間與分子的其余部分向連。作為烷基的非限制性實(shí)例，可以列舉以下直鏈或支鏈的基團(tuán)：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基及其另外七種異構(gòu)體、正己基及其另外十六種異構(gòu)體、正庚基及其各自異構(gòu)體、正辛基及其各種異構(gòu)體、正壬基及其各種異構(gòu)體。

本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“環(huán)烷基”是指至少3個(gè)碳原子組成的飽和非芳基環(huán)系，該環(huán)系可以是單環(huán)、雙環(huán)、多環(huán)，也可以是稠環(huán)、橋環(huán)、螺環(huán)。作為環(huán)烷基的非限制性實(shí)例，可以列舉以下基團(tuán)：環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、環(huán)壬基；以及由兩個(gè)或多個(gè)上述單環(huán)通過(guò)公共邊和公共碳原子形成的稠環(huán)、橋環(huán)、或螺環(huán)基團(tuán)。

本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“烯基”是指在上述烷基基團(tuán)中(除甲基外)存在一個(gè)或多個(gè)雙鍵的情況下所形成的基團(tuán)。

本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“炔基”是指在上述烷基基團(tuán)中(除甲基外)存在一個(gè)或多個(gè)叁鍵的情況下所形成的基團(tuán)。

本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“烷氧基”是指氧原子與上述烷基相連、并且通過(guò)該氧原子以單鍵連接至分子其余部分的基團(tuán)，其涵蓋了各種可能的幾何異構(gòu)基團(tuán)與立體異構(gòu)基團(tuán)。作為烷氧基的非限制性實(shí)例，可以列舉以下直連或支鏈的基團(tuán)：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基以及另外七種異構(gòu)體、正己氧基以及另外十六種異構(gòu)體、正庚氧基以及各種異構(gòu)體、正辛氧基以及各種異構(gòu)體、正壬氧基以及各種異構(gòu)體。

本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“芳基”是指由至少6個(gè)碳原子組成的芳香環(huán)系，該環(huán)系可以是單環(huán)、雙環(huán)、多環(huán)，其中雙環(huán)和多環(huán)可以由單環(huán)通過(guò)單鍵連接方式或稠合方式形成。作為芳基的非限制性實(shí)例，可以列舉以下基團(tuán)：苯基、萘基、蒽基、菲基、茚基、芘基、苝基、戊搭烯基、庚搭烯基、三亞苯基、并四苯基、戊芬基、并五苯基、四鄰亞苯基、己芬基、并六苯基、蔻基、三亞萘基、庚芬基、并七苯基、卵苯基、聯(lián)苯基、聯(lián)萘基。

本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“雜芳基”是指具有一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自N、O或S的雜原子的5-14元芳香族雜環(huán)環(huán)系，該環(huán)系可以是單環(huán)、雙環(huán)、多環(huán)，其中雙環(huán)和多環(huán)可以由單環(huán)通過(guò)單鍵連接方式或稠合方式形成。作為雜芳基的非限制性實(shí)例，可以列舉以下基團(tuán)：噁唑基、異噁唑基、咪唑基、呋喃基、吲哚基、異吲哚基、吡咯基、三唑基、三嗪基、四唑基、噻吩基、噻唑基、異噻唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、咔唑基、異喹啉基、喹唑啉基、萘啶基、嘌呤基、噻二唑基、吲哚嗪基、吩嗪基、香豆素基、吡啶并吡啶基、吡啶并噠嗪基、咪唑并吡啶基、咪唑并噠嗪基；以及由上述雜芳基通過(guò)單鍵連接方式或稠合方式形成的基團(tuán)。

本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)基”是指由碳原子和獨(dú)立選自N、O或S的雜原子組成的非芳香族3-18元環(huán)系，該環(huán)系可以是單環(huán)、雙環(huán)、或多環(huán)，也可以是稠環(huán)、橋環(huán)、螺環(huán)，并且可以任選地包含一個(gè)或多個(gè)雙鍵。作為雜環(huán)基的非限制性實(shí)例，可以列舉以下基團(tuán)：吖啶基、苯并二氧雜環(huán)己基、苯并吡喃基、苯并二氫吡喃基、二氧戊環(huán)基、十氫異喹啉基、茚滿基、吲哚啉基、異吲哚啉基、異苯并二氫吡喃基、嗎啉基、哌嗪基、2-氧代哌嗪基、八氫吲哚基、八氫異吲哚基、4-哌啶酮基、二氫喹啉基、二氫異喹啉基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、1-(二苯基甲基)哌嗪基、四氫呋喃基、四氫吡喃基、四氫吡咯基、哌啶基。

本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“鹵素”或“鹵代”是指氟、氯、溴或碘。

通過(guò)以下的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)解釋及展述，使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠更加容易地理解本發(fā)明，但不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明所述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例及限制本發(fā)明的任何或所有權(quán)利，更不應(yīng)該背離本發(fā)明的精神。

實(shí)施例1：合成本發(fā)明中的一部分化合物

N-(2-氨基苯基)-4-{4-[雙(2-氯乙基)氨基]苯基}丁酰胺(H104)的制備。

步驟(1)：稱量苯丁酸氮芥(0.30g，1mmol)和N，N-二甲基甲酰胺(0.1ml)于50ml單口圓底燒瓶中在冰浴下攪拌，用恒壓滴液漏斗滴加2ml草酰氯，撤冰常溫?cái)嚢?小時(shí)后，將反應(yīng)體系旋干得油狀物；另取一個(gè)100ml三口圓底燒瓶，向其中加入鄰硝基苯胺(0.14g，1mmol)、四氫呋喃(10ml)、三乙胺(0.15g，1.5mmol)，將反應(yīng)體系置于冰浴中攪拌，將此前旋干獲得的油狀物用10ml四氫呋喃溶解后使用恒壓滴液漏斗滴加入反應(yīng)體系中，30min滴加完全后撤冰，繼續(xù)常溫?cái)嚢?，薄層層析點(diǎn)板確認(rèn)反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液滴加入攪拌中的冰水中，析出大量固體，過(guò)濾得黃色固體0.39g(產(chǎn)率93％)

步驟(2)：稱量步驟(1)中得到的黃色固體(0.3g，0.7mmol)、鋅粉(0.09g，1.4mmol)、甲醇(10ml)和水(2ml)置于50ml三口圓底燒瓶中，常溫下，用恒壓滴液漏斗滴加稀鹽酸(3.5ml，1mol/L)，滴加完后繼續(xù)常溫?cái)嚢?，薄層層析點(diǎn)板確認(rèn)反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液過(guò)濾，濾液旋干后，用乙酸乙酯萃取，氨水洗三次，無(wú)水碳酸鉀干燥，過(guò)濾，旋干，得油狀物，使用硅膠柱層析純化后得固體0.13g(產(chǎn)率46％)；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝9.12(s,1H),7.17(d,J＝7.8Hz,1H),7.07(d,J＝8.2Hz,2H),6.91(t,J＝7.5Hz,1H),6.74(d,J＝8.0Hz,1H),6.69(d,J＝8.2Hz,2H),6.56(t,J＝7.5Hz,1H),5.04(s,2H),3.71(s,8H),2.53(t,J＝7.9Hz,2H),2.33(t,J＝7.2Hz,2H),1.85(m,2H)；¹³C NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝27.3,33.6,35.2,25.6,52.2,111.9,115.9,116.2,123.6,125.3,125.6,129.3,129.9,141.7,144.4,170.9ppm；C₂₀H₂₅Cl₂N₃O,MS(ES+)m/z:394.15(M+H)⁺.

N-(2-氨基苯基)-4-{4-[雙(2-氯乙基)氨基]苯基}丁酰胺(H104)的另一種制備方法。

取100ml單口圓底燒瓶，加入苯丁酸氮芥(0.50g，1.64mmol)、N,N-二甲基甲酰胺(10ml)，加入BOP(苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸鹽)0.87g(1.97mmol)，三乙胺0.67g(6.6mmol)，常溫?cái)嚢?0min后加入鄰苯二胺0.213g(1.97mmol)，繼續(xù)常溫磁力攪拌，用薄層層析板跟蹤反應(yīng)進(jìn)度，最終反應(yīng)時(shí)間為2h。反應(yīng)完成后，向反應(yīng)液中加入350ml乙酸乙酯萃取，倒入分液漏斗中，加入飽和碳酸鈉水溶液洗3次，飽和氯化鈉洗2次，有機(jī)相用無(wú)水硫鎂干燥，過(guò)濾，旋蒸得固體，用甲醇重結(jié)晶后得灰白色固體0.53g(產(chǎn)率82％)。

實(shí)施例2：化合物抗腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

(1)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系，選用五種癌細(xì)胞：人皮膚黑色素瘤A375、人肝癌細(xì)胞HepG2、人肝癌細(xì)胞SMMC7721、人肺癌細(xì)胞A549和人肺癌細(xì)胞H1299。實(shí)驗(yàn)前，五種癌細(xì)胞被保藏在液氮中，首先取出癌細(xì)胞，在37攝氏度的水浴鍋中使其快速升溫到37攝氏度，將細(xì)胞液離心去除上層凍存液，細(xì)胞用培養(yǎng)基重新懸浮后，轉(zhuǎn)移到24mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶加入6ml培養(yǎng)基于37攝氏度，含5％CO₂的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，(其中人皮膚黑色素瘤A375、肝癌細(xì)胞HepG2和人肝癌細(xì)胞SMMC7721，在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，用0.25％胰蛋白酶常規(guī)消化后傳代培養(yǎng)。人肺癌細(xì)胞A549和人肺癌細(xì)胞H1299在含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，用0.25％胰蛋白酶常規(guī)消化后傳代培養(yǎng)。)等細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到培養(yǎng)瓶70％-80％左右時(shí)，先用PBS洗去培養(yǎng)基，用0.25％胰蛋白酶消化將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中脫落下來(lái)，加入新鮮培養(yǎng)基離心后，去除上層培養(yǎng)基，再加入新鮮培養(yǎng)基重懸后1：2～3傳代。

(2)當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后，將處于對(duì)數(shù)期的癌細(xì)胞用胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞后，用新鮮培養(yǎng)基稀釋到(3～4)×10⁴個(gè)/ml的細(xì)胞密度，在96孔板中，每孔加入90μL的細(xì)胞液，在37攝氏度，含5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，加藥(把合成的化合物事先稀釋到一系列不同的濃度，將不同濃度的化合物溶液加入到96孔板中，每個(gè)濃度重復(fù)3個(gè)復(fù)孔)，72小時(shí)后，96孔板中每孔加入10μL CCK-8溶液，再培養(yǎng)1小時(shí)后，用BIO-RAD酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)處的吸光度值，通過(guò)Graphpad Prism 5軟件擬合得到抑制曲線，最終得到IC₅₀值。

表2：本發(fā)明所合成的化合物對(duì)五種不同癌細(xì)胞的抑制效果

表2的結(jié)果表明：本發(fā)明合成的含有苯甲酰胺基團(tuán)的氮芥類(lèi)化合物對(duì)五種癌細(xì)胞均具有強(qiáng)的抑制活性，而且本發(fā)明合成的化合物明顯具有比母體藥物苯丁酸氮芥和鹽酸苯達(dá)莫司汀以及CI994更強(qiáng)的抗腫瘤效果。本專(zhuān)利中合成的含有羥肟酸基團(tuán)的氮芥類(lèi)化合物藥效強(qiáng)于母體藥物苯丁酸氮芥4至40倍，比母體藥物鹽酸苯達(dá)莫司汀的藥效強(qiáng)9至64倍。

實(shí)施例3：化合物對(duì)HDAC酶的抑制實(shí)驗(yàn)

使用瑞士Life Sciences公司生產(chǎn)的HDAC綠色熒光測(cè)試試劑盒(產(chǎn)品序號(hào)：BML-AK530)進(jìn)行HeLa細(xì)胞核提取物的HDAC酶活性抑制實(shí)驗(yàn)，使用產(chǎn)品序號(hào)為BML-AK511的試劑盒進(jìn)行HDAC1酶活性抑制實(shí)驗(yàn)，使用產(chǎn)品序號(hào)為BML-AK512的試劑盒進(jìn)行HDAC2酶活性抑制實(shí)驗(yàn)，使用產(chǎn)品序號(hào)為BML-AK516的試劑盒進(jìn)行HDAC6酶活性抑制實(shí)驗(yàn)。操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，15μL的HDAC酶與10μL的待測(cè)化合物充分混合，將底物和上述混合物在37攝氏度放置5分鐘以使底物和酶獲得相同的起始溫度，然后每孔快速加入25μL底物，將整個(gè)96孔板放置于37攝氏度孵育30-60分鐘，然后向每孔中加入50μL終止液。此后將96孔板放置常溫10分鐘，用酶標(biāo)儀測(cè)熒光強(qiáng)度。得到不同濃度化合物對(duì)HDAC酶抑制率后，通過(guò)Graphpad Prism 5軟件擬合得到抑制曲線，最終得到IC₅₀值。

圖1的結(jié)果表明：本發(fā)明合成的含有羥肟酸基團(tuán)的氮芥類(lèi)化合物對(duì)HeLa細(xì)胞核提取物的HDAC酶具有抑制活性，而母體化合物苯丁酸氮芥對(duì)HeLa細(xì)胞核提取物的HDAC酶沒(méi)有抑制活性。

表3：本發(fā)明所合成的化合物對(duì)HDAC酶的抑制效果

表4的結(jié)果表明：本發(fā)明合成的含有羥肟酸基團(tuán)的氮芥類(lèi)化合物對(duì)HDAC2具有選擇性抑制活性，其HDAC1/HDAC2以及HDAC6/HDAC2的選擇性系數(shù)均大于4.9

實(shí)施例4：化合物抗腫瘤細(xì)胞單克隆形成實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人皮膚黑色素瘤細(xì)胞A375鋪于6孔板，每孔鋪3500個(gè)細(xì)胞，立即用2μmol/L、8μmol/L和16μmol/L的苯丁酸氮芥、CI994和H104處理細(xì)胞，以DMSO處理組為空白對(duì)照，7天后，移去每孔的培養(yǎng)基，加入PBS(磷酸鹽緩沖液)輕輕洗2遍，加入3.7％甲醛水溶液固定20min，再用PBS輕輕洗兩遍，0.1％結(jié)晶紫水溶液染色30min，PBS洗3遍，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并拍照。

由圖2可看出本發(fā)明合成的化合物H104比母體藥物苯丁酸氮芥和CI994具有更強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞單克隆形成的能力。

實(shí)施例5：化合物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人皮膚黑色素瘤細(xì)胞A375鋪于6孔板，每孔鋪16萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，12h后加入苯丁酸氮芥和H101(濃度為2μmol/L、8μmol/L和16μmol/L)處理細(xì)胞，以DMSO處理為對(duì)照組，72h后收集每孔的培養(yǎng)基，用胰酶消化收集各孔細(xì)胞，1000rpm離心5min，去除離心后的上清，再用PBS洗兩遍，然后加入100μL1×binding buffer緩沖液，5μL of Alexa Fluor 488annexin和1μL的碘化丙錠(100μg/ml)，避光室溫孵育15min，以Alexa Fluor 488annexin和碘化丙錠單染的組別作為對(duì)照組，樣品用MoFlo XDP流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示：本發(fā)明合成的化合物H104在2μmol/L、8μmol/L和16μmol/L濃度下能夠分別誘導(dǎo)20.2％、62.0％和64.8％的人皮膚黑色素瘤細(xì)胞A375發(fā)生凋亡，而母體藥物苯丁酸氮芥在2μmol/L、8μmol/L和16μmol/L濃度下僅能夠誘導(dǎo)9.9％、12.9％和28.9％的人皮膚黑色素瘤細(xì)胞A375凋亡，CI994在2μmol/L、8μmol/L和16μmol/L濃度下僅能夠誘導(dǎo)21.6％、29.6％和64.0％的人皮膚黑色素瘤細(xì)胞A375凋亡。由此可見(jiàn)本發(fā)明所合成的化合物具有比母體藥物苯丁酸氮芥和CI994明顯更強(qiáng)的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力。

實(shí)施例6：化合物阻斷腫瘤細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375人皮膚黑色素瘤細(xì)胞鋪于6孔板，每孔鋪16萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，12h后加入苯丁酸氮芥、CI994和H104(濃度為8μmol/L)處理細(xì)胞，以DMSO處理為對(duì)照組，72h后收集每孔的培養(yǎng)基，用胰酶消化收集各孔細(xì)胞，1000rpm離心5min，去除離心后的上清，再用PBS洗兩遍，細(xì)胞用70％乙醇固定，PBS洗兩遍，加入RNA酶37℃避光孵育30min，樣品用MoFlo XDP流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

結(jié)果顯示本發(fā)明合成的化合物H104在8μmol/L濃度下能顯著將人皮膚黑色素瘤細(xì)胞A375抑制在G2/M期，(加DMSO處理的對(duì)照組癌細(xì)胞處于G2/M期的比例為12.6％，經(jīng)過(guò)8μmol/L化合物H104處理后，處于G2/M期癌細(xì)胞的比例增加到79.5％，而使用苯丁酸氮芥處理后，人皮膚黑色素瘤細(xì)胞A375處于G2/M期的比例僅增加到47.7％，使用CI994處理后，人皮膚黑色素瘤細(xì)胞A375處于G2/M期的比例為10.8％，沒(méi)未發(fā)生明顯變化)。