本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種快速鑒定光皮梾木種群的分子檢測方法。

背景技術(shù)：

光皮梾木(cornuswilsonianawanger)又名光皮樹、油樹、狗骨木、斑皮抽水樹等，屬山茱萸科梾木屬，是我國特有的多用途鄉(xiāng)土木本油料樹種。光皮梾木果油作為食用油已有100年歷史,1981年經(jīng)國家糧食部鑒定，光皮梾木油為一級食用油；2013年12月，國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會批準(zhǔn)光皮梾木果實(shí)油為我國的新食品原料。動物和臨床試驗(yàn)結(jié)果表明光皮梾木油可顯著降低體內(nèi)膽固醇，防治高血脂癥，尤其是老年高血脂癥，同時(shí)具有減肥功效。光皮梾木是一種兼有經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會效益的重要油料樹種。

但是，一般從表型特征很難區(qū)分光皮梾木的種群，尤其是在上個(gè)世紀(jì)70-80年代，曾經(jīng)在一定的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行過人為的廣泛傳播，對于收集、選擇和建立基因庫帶來一定的難度。因此，急需解決判定種群起源的準(zhǔn)確方法，為開展光皮梾木的育種提供必要的技術(shù)支持。

植物的基因組具有很好的穩(wěn)定性，基本上不受環(huán)境影響，且取材方便。因此，通過對植株在基因組差異性的檢測來追蹤其起源是完全可行的。

dna分子標(biāo)記是快速鑒定生物基因組差異的重要方法之一，其中微衛(wèi)星標(biāo)記具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、操作便捷等諸多優(yōu)點(diǎn)，通過對目標(biāo)植物種群進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記的檢測，不僅可以區(qū)分在性狀上存在明顯差異的個(gè)體，而且能夠有效判別種群水平上的相似性。

目前國內(nèi)外尚無對光皮梾木種群分子快速鑒定的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種非破壞性取樣下快速鑒定光皮梾木種群的分子檢測方法及其引物對，該鑒定方法準(zhǔn)確、省時(shí)、省力。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：

一種快速鑒定光皮梾木種群的分子檢測方法，包括以下步驟：

(1)、以光皮梾木的dna為模板，分別以seqidno:1～2、seqidno:3～4、seqidno:5～6、seqidno:7～8、seqidno:9～10、seqidno:11～12、seqidno:13～14、seqidno:15～16、seqidno:17～18、seqidno:19～20、seqidno:21～22、seqidno:23～24、seqidno:25～26、seqidno:27～28、以及seqidno:29～30作為引物對，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得微衛(wèi)星分子標(biāo)記數(shù)據(jù)；

(2)、對上述微衛(wèi)星分子標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，鑒定歸類光皮梾木種群。

在其中一些實(shí)施例中，步驟(1)中所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

步驟s1，94℃下預(yù)變性5min；

步驟s2，94℃下變性30s；

步驟s3，57℃下退火30s；

步驟s4，72℃下延伸20s；

步驟s5，將所述步驟s2至所述步驟s4重復(fù)35次，且最后一次的所述步驟s4持續(xù)10min。

在其中一些實(shí)施例中，步驟(1)中所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：dna模板1.0μl、引物對0.2μl、mix10μl，加ddh2o至20μl。

本發(fā)明還提供了快速鑒定光皮梾木種群的引物對，采取了以下技術(shù)方案：

一種快速鑒定光皮梾木種群的引物對，所述引物對包括seqidno:1～2、seqidno:3～4、seqidno:5～6、seqidno:7～8、seqidno:9～10、seqidno:11～12、seqidno:13～14、seqidno:15～16、seqidno:17～18、seqidno:19～20、seqidno:21～22、seqidno:23～24、seqidno:25～26、seqidno:27～28、以及seqidno:29～30。

本發(fā)明通過對目標(biāo)參試植株進(jìn)行dna提取，根據(jù)光皮梾木15個(gè)穩(wěn)定性好、多態(tài)性強(qiáng)的微衛(wèi)星標(biāo)記引物對進(jìn)行dna擴(kuò)增，獲得分子標(biāo)記數(shù)據(jù)后，采用統(tǒng)計(jì)分析軟件對分子數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從而對光皮梾木種群進(jìn)行歸類。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

1、本發(fā)明的快速鑒定光皮梾木種群的分子檢測方法在非破壞性取樣的前提下快速獲得基因組信息，工作量少且效率高，同時(shí)判別準(zhǔn)確率高達(dá)95％，具有準(zhǔn)確、省時(shí)和省力的優(yōu)勢；

2、本發(fā)明的快速鑒定光皮梾木種群的分子檢測方法對于物種種群的快速分子檢測具有重要價(jià)值和應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明快速鑒定光皮梾木種群的分子檢測方法的流程圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中20個(gè)光皮梾木植株種群判別二維圖，其中l(wèi)c：廣東樂昌種群；jx：江西贛州種群。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步敘述本發(fā)明，本發(fā)明未述及之處適用于現(xiàn)有技術(shù)。下面給出本發(fā)明的具體實(shí)施例，但實(shí)施例僅是為了進(jìn)一步詳細(xì)敘述本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的權(quán)利要求。

實(shí)施例1一種快速鑒定光皮梾木種群的分子檢測方法

請參閱圖1，為一種快速鑒定光皮梾木種群的分子檢測方法的流程圖，檢測方法包括以下步驟：

(1)、按本領(lǐng)域常規(guī)方法對來自江西和廣東2個(gè)種群共20個(gè)光皮梾木植株的葉片樣品進(jìn)行dna提?。?/p>

(2)、分別以步驟(1)提取的dna為模板，分別以seqidno:1～2、seqidno:3～4、seqidno:5～6、seqidno:7～8、seqidno:9～10、seqidno:11～12、seqidno:13～14、seqidno:15～16、seqidno:17～18、seqidno:19～20、seqidno:21～22、seqidno:23～24、seqidno:25～26、seqidno:27～28、以及seqidno:29～30作為引物對，分別進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得微衛(wèi)星分子標(biāo)記數(shù)據(jù)；

其中，引物對的序列如下：

每個(gè)pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系(20μl)為：

pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

步驟s1，將所述全基因組dna依次在94℃下預(yù)變性5min；

步驟s2，將預(yù)變性產(chǎn)物在94℃下變性30s，得到變性產(chǎn)物；

步驟s3，將所述變性產(chǎn)物在57℃下退火30s，得到退火產(chǎn)物；

步驟s4，將所述退火產(chǎn)物在72℃下延伸20s；

步驟s5，將所述步驟s2至所述步驟s4重復(fù)35次，且最后一次的所述步驟s4持續(xù)10min。

(3)、統(tǒng)計(jì)分析鑒定歸類光皮梾木種群。

采用非商業(yè)化genalex6.503軟件對上述微衛(wèi)星分子標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)分析的基本運(yùn)算原理：根據(jù)同類性質(zhì)的基因組信息(本實(shí)施例中為微衛(wèi)星標(biāo)記的dna片段大小)具有相似性的原理，也就是植株的相似度越高，標(biāo)記的相似性就大，軟件根據(jù)每個(gè)植株的微衛(wèi)星標(biāo)記的特征，計(jì)算出植株與植株之間在標(biāo)記信息上的相似度，根據(jù)相似度的大小進(jìn)行歸類；得到植株的種群判別與歸類。

江西和廣東2個(gè)種群共20個(gè)植株葉片樣品的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明，20個(gè)植株中7株來自廣東種群，13株來自江西種群。

以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。

序列表

＜110＞廣東省林業(yè)科學(xué)研究院

＜120＞快速鑒定光皮梾木種群的分子檢測方法

＜130＞30

＜170＞patentinversion3.1

＜210＞1

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞1

catcgattaaggcagataagaa22

＜210＞2

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞2

tcaaatttcagagtctccacaa22

＜210＞3

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞3

gtggtggtgattaggaagctat22

＜210＞4

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞4

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＜210＞5

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞5

aacgaaattgaaaccctagaaa22

＜210＞6

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞6

cagagacaaaattcaaaaagca22

＜210＞7

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞7

atggctatgatccaagttcttt22

＜210＞8

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞8

tcaaactgatcataaaacaggc22

＜210＞9

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＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞9

ggcggaagaactctatctttgt22

＜210＞10

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞19

tcagaacaacgtacgtacaaca22

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＜213＞人工序列

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ggggtttatgttcttcagtagc22

＜210＞12

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞12

taccaccatcaatttctaaccc22

＜210＞13

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞13

tgtttcaagttaaggtcgattg22

＜210＞14

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞14

cttcaggtagaagtacccaagg22

＜210＞15

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

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taaacaaaactgctgctgctat22

＜210＞16

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＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞16

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＜210＞17

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＜213＞人工序列

＜400＞17

caggctggtgtaactcataaaa22

＜210＞18

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＜212＞dna

＜213＞人工序列

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cactctcactacattgccctaa22

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＜213＞人工序列

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agaagtattcctgtcctcatgc22

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＜213＞人工序列

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cggtttgtaatagcactccac21

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＜212＞dna

＜213＞人工序列

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＜213＞人工序列

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gttttcacagtgatcaaacgac22