本發(fā)明屬于生化分析領(lǐng)域，具體涉及一種檢測巨細胞病毒巢式PCR產(chǎn)物的可視化方法，可低成本、高效率的檢測出人血清中是否含有巨細胞病毒的方法。為今后臨床上巨細胞病毒的特異性檢測提供了方法，尤其是對發(fā)展中國家及第三世界人群的巨細胞病毒大規(guī)模篩查工作提高了一種簡便、快捷、靈敏、低成本的可推廣方法，因而本發(fā)明具有巨大的潛在應(yīng)用價值和深遠的影響意義。

背景技術(shù)：

巨細胞病毒感染在人群中是普遍存在的，通常情況下巨細胞病毒感染并不會引起嚴重的后果。但是當巨細胞病毒感染免疫力低下的人群時，可能會威脅到患者生命，尤其當孕婦受巨細胞病毒感染時，常常會導(dǎo)致新生兒生理缺陷。因此及時、準確的診斷巨細胞感染在臨床上顯得尤為重要。

目前臨床常用酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA）和聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）來檢測巨細胞病毒感染。ELISA是通過檢測患者血清內(nèi)的巨細胞病毒抗體IgG、IgM來判斷是否感染，IgG陽性往往意味著既往感染，IgM陽性常意味著現(xiàn)癥感染，但是有些免疫力低下的患者或兒童卻不會產(chǎn)生抗體，因此常影響檢驗結(jié)果的準確性。目前由于qPCR比普通PCR敏感性更高、特異性更強，且能對巨病毒進行定量檢測的優(yōu)點，而被廣泛運用于臨床檢測。有學(xué)者認為發(fā)展中國家不需要進行巨細胞病毒的篩查，因為其血清陽性率高，孕婦產(chǎn)下患病新生兒的概率很低，但是目前也有為研究表明高血清陽性率的人群其新生兒的患病率與低血清陽性率的人群其新生兒患病率并無顯著差別，因此發(fā)展中國家也需要進行病毒篩查。但是qPCR因其昂貴的設(shè)備和試劑限制了其用于巨細胞病毒的篩查，使用qPCR法對巨細胞進行篩查是不符合成本效益的因此，普通PCR因其敏感性低又限制了其在巨細胞檢測上的使用。

針對這些問題，在本研究中我們使用巢式PCR（Nest PCR）來檢測巨細胞病毒，巢式PCR擁有兩對引物，可對目標DNA進行兩次擴增，因此具有非常高的特異性和敏感性。巢式PCR的固有缺陷是因為其兩次擴增而導(dǎo)致產(chǎn)物無法定量而必須使用凝膠電泳來檢測產(chǎn)物，本實驗將使用G四鏈體模擬過氧化物酶活性代替凝膠電泳來檢測產(chǎn)物以解決這個問題。同時，借助具有過氧化物酶活性的G四鏈體-hemin復(fù)合物來檢測PCR產(chǎn)物，實現(xiàn)可視化檢測巨細胞病毒的設(shè)想。

下面所述的為本發(fā)明人設(shè)計的將G-四鏈體結(jié)構(gòu)結(jié)合Nest PCR可視化檢測巨細胞病毒的新方法，通過將目的DNA進行兩次擴增，提高檢測靈敏度。繼而設(shè)計一段特定的分子信標DNA序列，該DNA序列的發(fā)夾部分可被引物特異性打開，極大的提高了檢測特異性。在打開發(fā)夾結(jié)構(gòu)后分子信標會形成G四鏈體結(jié)構(gòu)，與hemin結(jié)合從而催化底物使其變色，實現(xiàn)對目標物的可視化檢測。經(jīng)臨床標本驗證，該方法具有較高的檢出效率，為今后臨床上巨細胞病毒的特異性檢測提供了新方法，尤其是對發(fā)展中國家及第三世界人群的巨細胞病毒大規(guī)模篩查工作提高了一種簡便、快捷、靈敏、低成本的可推廣方法，因而本發(fā)明具有巨大的潛在應(yīng)用價值和深遠的影響意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于通過G四鏈體結(jié)構(gòu)模擬過氧化物酶活性檢測巨細胞病毒巢式PCR產(chǎn)物的可視化方法，從而實現(xiàn)低成本、高效率的檢測出人血清中是否含有巨細胞病毒的方法。

臨床上對人血清中是否含有巨細胞病毒的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA）和聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）。其中ELISA法的假陰性率較高，常會影響檢驗結(jié)果的準確性；PCR尤其是qPCR方法靈敏度較高，但是檢測成本過高，限制了在發(fā)展中國家以及第三世界人群的大規(guī)模篩查中的應(yīng)用。

為了解決以上的問題，本發(fā)明借助巢式PCR技術(shù)對目標DNA進行兩次擴增，同時借助于G四聯(lián)體-hemin復(fù)合物可催化底物發(fā)生顏色變化的特性，構(gòu)建了一種靈敏度高、特異性強、檢測成本低廉的可視化方法，用于檢測人血清中是否含有巨細胞病毒。

所述的基于巢式PCR技術(shù)構(gòu)建的可視化檢測巨細胞病毒的方法包括：

1）所設(shè)計的基因序列如下：

本發(fā)明中所用到的DNA引物序列（primer）由生工生物工程有限公司（中國，上海）合成并純化，具體序列如下：

2）本發(fā)明的實驗步驟：

①巨細胞病毒DNA的提取

首先用無菌注射器抽取受檢者靜脈血1mL，注入無菌1.5mL Eppendoff管，4℃靜置過夜。吸取上層血清（注意勿帶入紅細胞）至另一無菌1.5mL Eppendoff管，即為血清標本。取50μL血清加50μL DNA提取液攪拌均勻，100℃保溫10分鐘，12,000 rpm離心5分鐘，取上清液（含病毒DNA）5μL進行PCR擴增。

② Nest PCR擴增

第一輪擴增：50uL待測體系中含有5uL的模板，1uL的前向引物和后向引物，2U的Taq酶，5uL PCR buffer（100mM Tris-HCl，400mM NaCl，15mM MgCl₂，PH=8.3），1uL的dNTP,余下用滅菌雙蒸水補足。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4min，95℃擴增30s，52℃擴增30s，72℃擴增30s，30個循環(huán)。

第二輪擴增：25uL待測體系中包含1uL的被稀釋10000倍的模板，0.5uL的前后引物，1U的Taq酶，2.5uL PCR buffer，0.5uL的dNTP 余下體積用滅菌雙蒸水補足。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4min后，95℃擴增30s，57℃擴增30s，72℃擴增30s，30個循環(huán)。

③可視化比色反應(yīng)

1uL的MB加到產(chǎn)物中，95℃加熱5min，冷卻到室溫，接著加入2uL的hemin試劑，反應(yīng)10min，將混合物加到60uL的TMB溶液中，反應(yīng)10min，加入等體積的H₂SO₄終止反應(yīng)。最后，用450nm波長的酶聯(lián)免疫儀檢測濃度。

④聚丙烯酰胺凝膠電泳驗證結(jié)果

配置10mL 8%的聚丙烯酰胺凝膠：甲叉雙丙烯酰胺2.66mL，蒸餾水5.27mL，5*TBE 2mL，NH₂SO₄ 70uL，TEMED 3.5uL，設(shè)置電壓90v，進行電泳45min，用EB染色15min，最后在凝膠成像儀上曝光。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

1、采用了巢式PCR技術(shù)，構(gòu)建了一種可檢測人血清中巨細胞病毒的可視化方法，降低了檢測成本，縮短了檢測時間，提高了檢測特異性。

2、對目標物進行了兩次PCR擴增，提高了檢測樣本中目標DNA的濃度，極大的提高了檢測靈敏度。

2、采用了可視化檢測方法，可避免檢測結(jié)果對儀器的依賴，實現(xiàn)肉眼即可識別的便捷檢測目標。同時，為發(fā)展中國家及第三世界人群巨細胞病毒的大規(guī)模篩查提供新的檢測方法。

附圖說明

圖1本發(fā)明設(shè)計的實驗原理圖。

圖2本發(fā)明的實驗結(jié)果。其中 a)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，第二條泳道為普通PCR的結(jié)果，第三條泳道為巢式PCR的結(jié)果。b) 比色反應(yīng)：左邊為實驗組（黃色），右邊為對照組（淺黃色）。 c) 用酶標儀在450nm下的檢測結(jié)果，error bar 代表5個獨立樣本的標準差。

圖3 檢測結(jié)果的特異性驗證。其中a)為非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，從左到右引物比例分別為1:1，1:20，1:40，1:60，1:80，1:100，在不對稱PCR的電泳道上可以看到四條條帶，分別是單鏈DNA，帶有特異序列的單鏈DNA，雙鏈DNA，帶有特異序列的雙鏈DNA。 b)比色反應(yīng)的結(jié)果顯示，引物比例不同使得樣品顏色具有可視的差別。c) 用酶標儀在450nm下的檢測結(jié)果，error bar 代表5個獨立樣本的標準差。

具體實施方式

實施例1

基于巢式PCR技術(shù)構(gòu)建的可視化檢測巨細胞病毒的方法包括：

1）所設(shè)計的基因序列如下：

本發(fā)明中所用到的DNA引物序列（primer）由生工生物工程有限公司（中國，上海）合成并純化，具體序列如下：

寡核苷酸鏈購自生工生物工程有限公司（中國，上海），Tris-HCL，氯化血紅素（hemin），二甲基亞砜（DMSO），氯化鈉，氯化鎂，均購自Sigma公司。過氧化氫（H₂O₂），30%甲叉雙丙烯酰胺，過硫酸銨（(NH₄)₂S₂O₈），四甲基乙二胺（TEMED），TBE buffer均購自鼎國公司，dNTP，Taq酶購自GeneView。本實驗過程總共收集20例患者標本和20例健康對照組標本，所有血清標本均來自福建福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，且都滿足人類倫理學(xué)要求。

2）實驗儀器及實驗參數(shù)設(shè)置：

Milli-Q 超純水系統(tǒng)（Millipore，Bedford，USA），實驗用水均為其凈化的超純水；

PHS-3C 型精密酸度計（上海大普儀器有限公司）；

FINNPIPETTE 可調(diào)式移液器（上海熱電儀器有限公司）；

PCR擴增儀；第一輪PCR擴增時反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4min，95℃擴增30s，52℃擴增30s，72℃擴增30s，30個循環(huán)。第二輪PCR時反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4min后，95℃擴增30s，57℃擴增30s，72℃擴增30s，30個循環(huán)。

聚丙烯酰胺凝膠電泳；實驗時電泳參數(shù)設(shè)置為：電壓90v，EB染色15min。

3）基于巢式PCR技術(shù)構(gòu)建的可視化檢測巨細胞病毒新方法的原理：

目的DNA先在第一對引物（primer1和primer2）下完成第一輪擴增，然后在第二對引物（primer3和primer4）下完成第二輪擴增，充分增加目標DNA的濃度，便于提高檢測靈敏度。同時，對第二對引物進行一些修飾，在引物的5’端處添加了一段特異性DNA序列，在擴增過程中會以其為模板產(chǎn)生一段特定的序列，這段序列可與分子信標的DNA序列互補，打開分子信標DNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)后，分子信標會隨即形成G四鏈體結(jié)構(gòu)并與hemin結(jié)合形成G四鏈體-hemin復(fù)合物，該復(fù)合物可催化底物使其變色。因此，通過顏色變化即可判定待測血清中是否含有巨細胞病毒。

4）本發(fā)明的實驗步驟：

①巨細胞病毒DNA的提取

首先用無菌注射器抽取受檢者靜脈血1mL，注入無菌1.5mL Eppendoff管，4℃靜置過夜。吸取上層血清（注意勿帶入紅細胞）至另一無菌1.5mL Eppendoff管，即為血清標本。取50μL血清加50μL DNA提取液攪拌均勻，100℃保溫10分鐘，12,000 rpm離心5分鐘，取上清液（含病毒DNA）5μL進行PCR擴增。

② Nest PCR擴增

第一輪擴增：50uL待測體系中含有5uL的模板，1uL的前向引物和后向引物，2U的Taq酶，5uL PCR buffer（100mM Tris-HCl，400mM NaCl，15mM MgCl₂，PH=8.3），1uL的dNTP,余下用滅菌雙蒸水補足。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4min，95℃擴增30s，52℃擴增30s，72℃擴增30s，30個循環(huán)。

第二輪擴增：25uL待測體系中包含1uL的被稀釋10000倍的模板，0.5uL的前后引物，1U的Taq酶，2.5uL PCR buffer，0.5uL的dNTP 余下體積用滅菌雙蒸水補足。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4min后，95℃擴增30s，57℃擴增30s，72℃擴增30s，30個循環(huán)。

③可視化比色反應(yīng)

1uL的MB加到產(chǎn)物中，95℃加熱5min，冷卻到室溫，接著加入2uL的hemin試劑，反應(yīng)10min，將混合物加到60uL的TMB溶液中，反應(yīng)10min，加入等體積的H₂SO₄終止反應(yīng)。最后，用450nm波長的酶聯(lián)免疫儀檢測濃度。

④聚丙烯酰胺凝膠電泳驗證結(jié)果

配置10mL 8%的聚丙烯酰胺凝膠：甲叉雙丙烯酰胺2.66mL，蒸餾水5.27mL，5*TBE 2mL，NH₂SO₄ 70uL，TEMED 3.5uL，設(shè)置電壓90v，進行電泳45min，用EB染色15min，最后在凝膠成像儀上曝光。

5）本發(fā)明的反應(yīng)條件進行優(yōu)化

在此發(fā)明中我們分別對MB和hemin的反應(yīng)時間30min，20min，10min進行了優(yōu)化，每組獨立實驗5次，無法用肉眼分別出三次不同時間的區(qū)別，用SPSS對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，并使用ANOVA方法進行檢驗，發(fā)現(xiàn)三者差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），因此設(shè)置反應(yīng)時間為10min。

6）本發(fā)明的重復(fù)性研究

我們對收集到20例感染巨細胞病毒的血清標本和20例健康對照標本進行研究，將檢測結(jié)果用實驗組吸光度的均值減去空白組吸光度的均值，得到的吸光度均值為0.1768，標準差為0.01065，計算的RSD=6.02%，因此說明該實驗重復(fù)性良好。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建醫(yī)科大學(xué)

<120> 一種檢測巨細胞病毒巢式PCR產(chǎn)物的可視化方法

<130> 5

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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<210> 5

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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