本發(fā)明涉及(s)-羰基還原酶異源聚合體及其在催化多苯環(huán)化合物的應用，屬于生物催化技術領域。
背景技術：
手性化合物在醫(yī)藥、農藥、激素、食品添加劑等精細化工品的生產上得到了越來越廣泛的應用，如聯苯化合物2,4-二氯二苯甲酮對南美錐蟲病的寄生蟲有抑制作用，是一種潛在的藥用化合物。而化合物2-萘乙酮作為重要的藥物中間體，利用生物法催化該化合物，從而獲得各種重要的藥物前體也具有很大的價值。
氧化還原酶催化的不對稱還原反應常用于手性化合物的制備。目前常用的氧化還原酶大部分產自重組型的大腸桿菌。而立體選擇性氧化還原酶能用于工業(yè)轉化手性醇的種類和數量非常有限，尤其是生產(s)-型手性醇的具有anti-prelog立體選擇性氧化還原酶數量更少。因此有必要對現有的氧化還原酶進行改造以獲得具有新功能的工程酶，以滿足實際需要，獲得具有更多功能的手性生物催化劑。
發(fā)明人在前期工作中構建得到了分別表達(s)-羰基還原酶基因簇(scr，scr2和scr3)基因的重組型大腸桿菌(e.coli)，重組菌能夠催化轉化制備(s)-苯基乙二醇。(s)-羰基還原酶系基因在大腸桿菌(e.coli)中分別異源表達后，對單苯環(huán)類化合物具有較好的催化活性。但是(s)-羰基還原酶scr、scr2、scr3的底物譜較窄，無法催化多苯環(huán)類化合物。如目前報道(s)-羰基還原酶scr、scr2、scr3同源蛋白聚合體能催化直鏈潛手性醇和單苯環(huán)類潛手性醇化合物，但對于聯苯類化合物2,4-二氯二苯甲酮和2-萘乙酮等重要的藥物中間體幾乎沒有催化能力。
技術實現要素：
為了解決上述問題，本發(fā)明得到了(s)-羰基還原酶的異源聚合體，提高了(s)-羰基還原酶系基因的底物譜。通過蛋白和蛋白的相互作用，異源羰基還原酶聚合體催化底物譜擴大，能夠催化雙苯環(huán)類化合物，如聯苯化合物2,4-二氯二苯甲酮和2-萘乙酮。
本發(fā)明的第一個目的是提供一種能夠催化多苯環(huán)類化合物的異源羰基還原酶聚合體蛋白，所述異源羰基還原酶聚合體蛋白是(s)-羰基還原酶的異源聚合體蛋白復合物。
在一種實施方式中，所述異源聚合體蛋白復合物是兩個以上氨基酸序列不同的(s)-羰基還原酶形成的異源聚合體。
在一種實施方式中，所述(s)-羰基還原酶是來源于近平滑假絲酵母的(s)-羰基還原酶。
在一種實施方式中，所述(s)-羰基還原酶可以是：氨基酸序列如seqidno:1所示的scr、氨基酸序列如seqidno:2所示的scr2、氨基酸序列如seqidno:3所示的scr3。
在一種實施方式中，所述(s)-羰基還原酶的編碼基因可以是：scr(genbankid:dq675534)、scr2(genbankid:gq411433)、scr3(genbankid:fj939564)。
在一種實施方式中，所述異源聚合體蛋白復合物是由scr和scr2形成的異源聚合體scr/scr2，或者是由scr2和scr3形成的異源聚合體scr2/scr3。
在一種實施方式中，所述異源聚合體蛋白復合物是將兩個以上氨基酸序列不同的(s)-羰基還原酶在同一宿主中共表達而得到的。
本發(fā)明的第二個目的是提供所述異源聚合體蛋白復合物的制備方法。所述方法，是將兩個以上氨基酸序列不同的(s)-羰基還原酶在同一宿主中共表達而得到的。
在一種實施方式中，所述方法，是將兩個以上氨基酸序列不同的(s)-羰基還原酶的基因分別連接到表達載體上，然后轉化到同一宿主中得到重組菌，重組菌共表達這兩個以上的(s)-羰基還原酶基因，得到異源聚合體蛋白復合物。
在一種實施方式中，所述連接到表達載體上，包括每個基因單獨連接到一個表達載體上，或者將多個基因連接到同一個表達載體上。
在一種實施方式中，所述表達載體可以是以下任意一種或者多種：pet21、pet28、petduet。
在一種實施方式中，所述宿主可以是大腸桿菌。
在一種實施方式中，所述宿主為(e.colibl21(de3)。
在一種實施方式中，所述連接到表達載體上，還包括在(s)-羰基還原酶的基因前添加蛋白純化標簽。
在一種實施方式中，所述方法還包括共表達后的純化步驟。
在一種實施方式中，所述方法具體包括：(1)獲取兩個氨基酸序列不同的(s)-羰基還原酶的基因；(2)將上一步得到的兩個基因分別連接到不同的表達載體上，并進一步構建帶有不同純化標簽的含有目的基因的兩個重組質粒；(3)將兩個重組質粒轉化到同一宿主大腸桿菌中，得到共表達兩個氨基酸序列不同的(s)-羰基還原酶的重組大腸桿菌；(4)重組菌發(fā)酵表達，純化得到異源聚合體蛋白復合物。
在一種實施方式中，所述純化標簽為組氨酸標簽或者修飾的鏈球菌抗生物素蛋白標簽。
在一種實施方式中，所述純化，是先收集菌體、破碎細胞得到胞內表達的蛋白，然后離心取上清，先利用ni-ntacolumn純化得到帶有組氨酸標簽的蛋白，再將得到的帶有組氨酸標簽的蛋經過streptraphpcolumn的純化，即得到異源聚合體蛋白。因為異源聚合體蛋白既能親和吸附ni-ntacolumn，又能親和吸附streptraphpcolumn。
在一種實施方式中，所述純化，先利用蛋白純化儀連接鎳柱ni-nta純化帶有組氨酸標簽的蛋白；由于所表達的這兩個氨基酸序列不同的(s)-羰基還原酶會形成異源聚合體，因此在這一步中有部分帶有strep標簽的蛋白也會被ni-nta結合；接著將結合在ni-nta柱子上的蛋白用含有咪唑的緩沖洗脫，將獲得的收集液流經已經用緩沖平衡好的streptraphpcolumn上，最后用含有脫硫生物素的緩沖將目的蛋白洗脫，獲得異源聚合體蛋白。
在一種實施方式中，所述方法具體是：將來源于近平滑假絲酵母的(s)-羰基還原酶scr、scr2、scr3中的任意兩種，分別連接到表達載體上并進一步構建帶有不同純化標簽的含有目的基因的兩個重組質粒，得到pet21-strep-scr、pet28-his-scr2、pet28-his-scr3、pet21-strep-scr2，然后將pet21-strep-scr與pet28-his-scr2，或者pet28-his-scr3與pet21-strep-scr2共同轉化到同一宿主細胞大腸桿菌中，篩選具有雙質粒的重組大腸桿菌；重組菌發(fā)酵表達，純化得到異源聚合體蛋白復合物。
在一種實施方式中，所述發(fā)酵表達，是將重組大腸桿菌接種于lb培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，然后轉接于lb培養(yǎng)基中，于37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)至od達到0.6-0.8時，加入一定濃度iptg誘導12h。
本發(fā)明的第三個目的是提供表達所述異源聚合體蛋白復合物的重組菌。
在一種實施方式中，所述重組菌是將兩個以上氨基酸序列不同的(s)-羰基還原酶的基因分別連接到表達載體上，然后共同轉化到同一宿主中而得到的。
在一種實施方式中，所述宿主是大腸桿菌。
在一種實施方式中，所述宿主為(e.colibl21(de3)。
在一種實施方式中，所述表達載體可以是以下任意一種或者多種：pet21、pet28和petduet。
在一種實施方式中，所述連接到表達載體上，還包括在(s)-羰基還原酶的基因前添加蛋白純化標簽。
本發(fā)明的第四個目的是提供所述異源聚合體蛋白復合物的應用。
在一種實施方式中，所述應用，是應用于催化領域。
在一種實施方式中，所述應用，是應用于精細化工品生產領域。
在一種實施方式中，所述應用，是用于催化雙苯環(huán)類化合物。
在一種實施方式中，所述雙苯環(huán)類化合物包括但不限于2,4-二氯二苯甲酮、2-萘乙酮。
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明通過共表達(s)-羰基還原酶基因簇中的兩個以上(s)-羰基還原酶基因，獲得了異源聚合體蛋白。本發(fā)明的異源聚合體蛋白具有新的性能，能夠催化雙苯環(huán)類化合物，且具有較好的催化活性。本發(fā)明的異源聚合體蛋白可以用于精細化工品生產領域。
本發(fā)明根據近平滑假絲酵母(c.parapsilosis)(s)-羰基還原酶基因簇序列scr(genbankid:dq675534)，scr2(genbankid:gq411433)和scr3(genbankid:fj939564)，通過構建不同(s)-羰基還原酶的共表達菌株，并通過不同蛋白所帶有的不同標簽，利用pulldown實驗純化異源聚合體，從而獲得大量的異源聚合體蛋白。利用所獲得的異源聚合體蛋白復合物，測定聯苯化合物2,4-二氯二苯甲酮和2-萘乙酮的活性，相比于同源聚合體基因scr，scr2和scr3，可以得到較高的羰基還原酶催化活性。本發(fā)明的異源聚合體蛋白scr/scr2和scr2/scr3對聯苯化合物2,4-二氯二苯甲酮的酶活性分別為4.55u/mg、4.42u/mg，scr/scr2對聯苯化合物2-萘乙酮的酶活性為2.43u/mg。
具體實施方案
異源聚合體蛋白對不同底物的酶活力測定方法：
(1)原理：輔酶nadph被還原后，會引起340nm的吸光度的降低。因此可以通過測定反應過程中340nm處吸光度的變化來檢測氧化還原酶的活力。
(2)測定還原酶活的條件：總反應體積為250ul，分別加入0.5mmol/lnadph，5mmol/l底物2,4-二氯二苯甲酮或者2-萘乙酮。30℃水浴恒溫2min，加入適量酶液后開始掃描340nm處吸光度的變化。
(3)計算方法與酶活力定義
酶活計算公式：酶活(u)＝ew×v×103/(6220×0.15)
比活的計算公式：比活(u/mg)＝酶活(u)/蛋白量(mg)
其中，ew：1min內340nm處吸光度的變化；v:反應液的體積(ml)；6220:摩爾消光系數(lmol-1cm-1)；0.15:光程距離(cm)。
羰基還原酶酶活力的定義：在上述條件下，每分鐘催化氧化1umolnadph的酶量為1個酶活單位。
下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此。
實施例1
近平滑假絲酵母(c.parapsilosis)cctccm203011的菌體培養(yǎng)，其生長培養(yǎng)基組成為：葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨2％。將近平滑假絲酵母接種于5ml試管中于28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)16-18h。
實施例2
近平滑假絲酵母(c.parapsilosis)基因組的提?。簩嵤├?培養(yǎng)的菌體于6,000rpm，5min下離心，用生理鹽水洗滌兩次后，收集細胞利用基因組dna提取試劑盒genomicdnaminipreparationkit(takara公司)提取基因組。
實施例3
從近平滑假絲酵母中調取目的基因序列，包括scr(氨基酸序列如seqidno:1所示)，scr2(氨基酸序列如seqidno:2所示)和scr3(氨基酸序列如seqidno:3所示)。
合成兩端引物(序列如seqidno:4～seqidno:11所示)
b-s-scr-f1:atcggatccgtggtctcatcctcaatttgaaaagggttctatgggcgaaatcgaatctta
x-s-scr-r1：tgactctcgagctatggacacgtgtatccacc
b-s-scr2-f1：atcggatccgtggtctcatcctcaatttgaaaagggttctatgggcgaaatcgaatctta
x-s-scr2-r1：tgactctcgagctatggacaagtgtaaccaccat
b-his-scr2-f1：cgcggatccgaaaatttatatttccagagtatgggcgaaatcgaatctta
x-his-scr2-r1：tgactctcgagctatggacacgtgtatccacc
e-his-scr3-f1：ccggaattcgaaaatttatatttccagagtatgggcgaaatcgaatctta
x-his-scr3-r1：gcccgctcgagctatggacaggtgaatccaccatc
實施例4
scr、scr2和scr3基因的獲得：采用pcr反應體系50ul：1ul基因組，1ul引物(上下游分別1ul)，primestarhspremix25ul，滅菌的超純水22ul。pcr條件為：98℃熱變性10s；98℃10s，52℃15s，72℃1min。經過30個循環(huán)后，最后72℃再延伸10min。利用3sspinagarosegeldnapurificationkit(上海申能博彩生物科技有限公司)純化dna片斷。
利用引物b-s-scr-f1和x-s-scr-r1擴增得到了氮端具有修飾的鏈球菌抗生物素蛋白標簽strep的scr基因，即strep-scr基因。利用引物b-s-scr2-f1和x-s-scr2-r1擴增得到了氮端具有修飾的鏈球菌抗生物素蛋白標簽的strep-scr2基因。利用引物b-his-scr2-f1和x-his-scr2-r1擴增得到了氮端具有組氨酸標簽的his-scr2基因。利用引物e-his-scr3-f1和x-his-scr3-r1擴增得到了氮端具有組氨酸標簽的his-scr3基因。
實施例5
pet21-strep-scr、pet28-his-scr2、pet28-his-scr3和pet21-strep-scr2重組質粒的獲得scr，scr2，scr3及空質粒pet21和pet28的酶切反應體系。
利用bamhi、xhoi酶切pet21和strep-scr基因，酶切產物純化后進行連接、轉化、驗證，得到陽性質粒pet21-strep-scr。利用bamhi、xhoi酶切pet21和strep-scr2基因，酶切產物純化后進行連接、轉化、驗證，得到陽性質粒pet21-strep-scr2。利用bamhi、xhoi酶切pet28和his-scr2基因，酶切產物純化后進行連接、轉化、驗證，得到陽性質粒pet28-his-scr2。利用bamhi、xhoi酶切pet28和his-scr3基因，酶切產物純化后進行連接、轉化、驗證，得到陽性質粒pet28-his-scr3。
實施例6
異源表達(s)-羰基還原酶和(s)-羰基還原酶2，以及(s)-羰基還原酶2和(s)-羰基還原酶3的大腸桿菌重組菌的獲得：
利用質粒提取試劑盒plasmidminikiti(200)(omega)從e.colijm109中提取質粒pet21-strep-scr、pet21-strep-scr2、pet28-his-scr2和pet28-his-scr3。
在100μle.colibl21(de3)感受態(tài)細胞懸液中分別加入0.5μlpet21-strep-scr和pet28-his-scr2，同時在另外一管100μle.colibl21(de3)感受態(tài)細胞懸液中分別加入0.5μlpet21-strep-scr2和pet28-his-scr3。輕輕混勻，冰浴中靜置30min。轉入42℃水浴中，熱擊90s?？焖俎D移至冰浴冷卻2min。每管中加入700μllb液體培養(yǎng)基，37℃100rpm搖床溫育培養(yǎng)1h。培養(yǎng)后菌液5,000rpm離心2min，棄上清600μl，剩余菌液混勻后涂布到含有100μg/ml氨芐青霉素和50μg/ml卡那霉素lb雙抗性平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日挑選單菌落進行試管培養(yǎng)，篩選得到具有雙質粒的重組大腸桿菌e.coli/pet21-strep-scr/pet28-his-scr2和e.coli/pet21-strep-scr2/pet28-his-scr3。
實施例7
重組菌株大腸桿菌e.coli/pet21-strep-scr/pet28-his-scr2和e.coli/pet21-strep-scr2/pet28-his-scr3的培養(yǎng)和菌體獲得：
重組菌株培養(yǎng)基(lb)組成為：1％氯化鈉、1％蛋白胨、0.5％酵母膏。重組型的大腸桿菌培養(yǎng)還需添加100μg/ml的氨芐青霉素和50μg/ml卡那霉素。
挑取陽性克隆單菌落接種于5ml含氨芐青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的lb試管培養(yǎng)基中，于37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。取3ml培養(yǎng)液轉接于150mllb培養(yǎng)基中，于37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)至od達到0.6-0.8時，加入iptg的濃度為0.1、0.2、0.5和1.0mm，30℃誘導12h。培養(yǎng)后的重組型大腸桿菌細胞于12,000rpm離心10min并用生理鹽水洗滌三次后收集。
實施例8
重組菌株大腸桿菌e.coli/pet21-strep-scr/pet28-his-scr2和e.coli/pet21-strep-scr2/pet28-his-scr3的細胞破碎：將收集好并洗滌干凈的大腸桿菌利用ni-ntacolumn的純化緩沖a液(20mmtris，150nacl，ph8.0)以1:20的比例稀釋并懸浮，然后利用磁力攪拌器把菌體充分打散，接著利用超聲破碎儀(sonic)破碎細胞(破碎2s，停4s，工作時間30min，工作強度40％)，釋放胞內表達的(s)-羰基還原酶系。利用冷凍離心機將細胞破碎液以12,000rpm離心40min，然后將破碎液上清過0.22um的水系濾膜，并轉移至干凈的離心管，作為蛋白純化的樣品備用。
實施例9
異源聚合體蛋白scr/scr2和scr2/scr3的ni-ntacolumn純化：
將過膜后的細胞破碎上清液先用ni-nta純化。利用aktapurifer進行樣品的純化，樣品流經柱子后，先用平衡液沖洗柱子，直到紫外吸收值降低并保持平衡，接著先用40mm的咪唑緩沖液洗雜帶，然后再用200mm咪唑緩沖液將帶有組氨酸標簽的蛋白復合物洗脫并接收相關樣品。
實施例10
異源聚合體蛋白scr/scr2和scr2/scr3的streptraphpcolumn純化：將ni-nta純化后收集的樣品繼續(xù)使用streptraphpcolumn純化。利用aktapurifer進行樣品的純化，樣品流經柱子后，先用平衡液沖洗柱子，直到紫外吸收值降低并保持平衡，接著先用2.5mm的脫硫生物素緩沖液將帶有strep標簽的蛋白復合物洗脫并接收。
實施例11
異源聚合體蛋白scr/scr2和scr2/scr3對聯苯化合物2,4-二氯二苯甲酮的酶活測定。測定還原酶活的條件：總反應體積為250ul，分別加入0.5mmol/lnadph，5mmol/l底物2,4-二氯二苯甲酮。30℃水浴恒溫2min，加入適量酶液后開始掃描340nm處吸光度的變化。最后計算得scr/scr2酶活性為4.55u/mg、scr2/scr3酶活性為4.42u/mg，而同源聚合體scr、scr2和scr3并未測到任何活性。
實施例12
異源聚合體蛋白scr/scr2和scr2/scr3對聯苯化合物2-萘乙酮的酶活測定。測定還原酶活的條件：總反應體積為250ul，分別加入0.5mmol/lnadph，5mmol/l底物2-萘乙酮。30℃水浴恒溫2min，加入適量酶液后開始掃描340nm處吸光度的變化。最后計算得scr/scr2酶活性為2.43u/mg，而同源聚合體scr、scr2和scr3并未測到任何活性。
此外，發(fā)明人采用類似的方法，得到了異源聚合體蛋白scr2/scr3和scr/scr3，結果顯示，這兩種異源聚合體蛋白也具有一定的催化雙苯環(huán)類化合物的活性。
雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。
序列表
<110>江南大學
<120>(s)-羰基還原酶異源聚合體及其在催化多苯環(huán)化合物的應用
<160>11
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>279
<212>prt
<213>scr
<400>1
metglygluileglusertyrcysasnlysgluleuglyproleupro
151015
thrlysalaprothrleuserlysasnvalleuaspleupheserleu
202530
lysglylysvalalaservalthrglyserserglyglyileglytrp
354045
alavalalaglualatyralaglnalaglyalaaspvalalailetrp
505560
tyrasnserhisproalaaspglulysalagluhisleuglnlysthr
65707580
tyrglyvalhisserlysalatyrlyscysasnileseraspprolys
859095
servalglugluthrileserglnglnglulysasppheglythrile
100105110
aspvalphevalalaasnalaglyvalthrtrpthrglnglyproglu
115120125
ileaspvalaspasntyraspsertrpasnlysileileservalasp
130135140
leuasnglyvaltyrtyrcysserhisasnileglylysilephelys
145150155160
lysasnglylysglyserleuileilethrserserileserglylys
165170175
ilevalasnileproglnleuglnalaprotyrasnthralalysala
180185190
alacysthrhisleualalysserleualaileglutrpalaprophe
195200205
alaargvalasnthrileserproglytyrileaspthraspilethr
210215220
aspphealaserlysaspmetlysalalystrptrpglnleuthrpro
225230235240
leuglyarggluglyleuthrglngluleuvalglyglytyrleutyr
245250255
leualaserasnalaserthrphethrthrglyseraspvalvalile
260265270
aspglyglytyrthrcyspro
275
<210>2
<211>279
<212>prt
<213>scr2
<400>2
metglygluileglusertyrcysasnlysgluleuglyproleupro
151015
thrlysalaprothrleuserlysasnvalleuaspleupheserleu
202530
lysglylysvalalaservalthrglyserserglyglyileglytrp
354045
alavalalaglualatyralaglnalaglyalaaspvalalailetrp
505560
tyrasnserhisproalaaspglulysalagluhisleuglnlysthr
65707580
tyrglyvalargserlysalatyrlyscysasnileseraspprolys
859095
servalglugluthrileserglnglnglulysasppheglythrile
100105110
aspvalphevalalaasnalaglyvalprotrpthrgluglyproglu
115120125
ileasnvalaspasntyraspsertrpasnlysileileasnleuasp
130135140
leuasnglyvaltyrtyrcysalahisthrvalglylysilephelys
145150155160
lysasnglylysglyserleuvalilethrsersermetserglythr
165170175
ilevalasnvalproglnleuglnalaalatyrasnalaalalysala
180185190
alacysthrhisleuthrlysserleualavalglutrpalaprophe
195200205
alaargvalasncysvalserproglytyrilealathrgluileser
210215220
aspphevalglulysaspmetlysalalystrptrpglnleuthrpro
225230235240
leuglyarggluglyleualaglngluleuvalglyalatyrleutyr
245250255
leualaserasnalaserthrtyrthrthrglyalaasnleualaval
260265270
aspglyglytyrthrcyspro
275
<210>3
<211>279
<212>prt
<213>scr3
<400>3
metglygluileglusertyrcysasnlysgluleuglyproleupro
151015
thrlysalaprothrleualalysasnvalleuaspleupheserleu
202530
lysglylysvalalaservalthrglyserserglyglyileglytrp
354045
alavalalaglualatyralaglnalaglyalaaspvalalailetrp
505560
tyrasnserhisproalaaspglulysalagluhisleuglnlysthr
65707580
tyrglyvalargserlysalatyrlyscysasnileseraspprolys
859095
servalglugluthrileserglnglnglulysasppheglythrile
100105110
aspvalphevalalaasnalaglyileprotrpalaaspglyproval
115120125
ileaspleugluasntyraspalatrpasnlysleuileasnthrasp
130135140
ileasnglyvalphetyrcysalahisserileglylysilephelys
145150155160
lysasnglylysglyserleuileilethralaserleualaglyser
165170175
valvalthrileproglnglnglnthrprotyrasnthralalysala
180185190
alacysleuhisleualalysserleualavalglutrpalaprophe
195200205
alaargvalasnthrvalserproglytyrphegluthrgluileasn
210215220
glyphealaaspgluaspmetargglulystrptyrglnleuthrpro
225230235240
leuglyargmetglyilethrglugluleuvalglyglytyrleutyr
245250255
phealaserasnalaserthrphethrthrglyseraspleuileile
260265270
aspglyglyphethrcyspro
275
<210>4
<211>60
<212>dna
<213>人工序列
<400>4
atcggatccgtggtctcatcctcaatttgaaaagggttctatgggcgaaatcgaatctta60
<210>5
<211>32
<212>dna
<213>人工序列
<400>5
tgactctcgagctatggacacgtgtatccacc32
<210>6
<211>60
<212>dna
<213>人工序列
<400>6
atcggatccgtggtctcatcctcaatttgaaaagggttctatgggcgaaatcgaatctta60
<210>7
<211>34
<212>dna
<213>人工序列
<400>7
tgactctcgagctatggacaagtgtaaccaccat34
<210>8
<211>50
<212>dna
<213>人工序列
<400>8
cgcggatccgaaaatttatatttccagagtatgggcgaaatcgaatctta50
<210>9
<211>32
<212>dna
<213>人工序列
<400>9
tgactctcgagctatggacacgtgtatccacc32
<210>10
<211>50
<212>dna
<213>人工序列
<400>10
ccggaattcgaaaatttatatttccagagtatgggcgaaatcgaatctta50
<210>11
<211>35
<212>dna
<213>人工序列
<400>11
gcccgctcgagctatggacaggtgaatccaccatc35