本發(fā)明公開了一種牡丹psdreb1啟動(dòng)子derbp的克隆、載體構(gòu)建及其功能分析的方法,屬于植物基因工程研究領(lǐng)域。
背景技術(shù):
:牡丹(paeoniasuffruticosa)是我國(guó)的傳統(tǒng)名花。隨著我國(guó)園林花卉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,牡丹的美化價(jià)值和藥用價(jià)值等也日益受到重視。然而,環(huán)境因素使其種植和應(yīng)用具有一定的局限性。為了能夠在江南和華南地區(qū)種植出雍容華貴的牡丹花,定向培育具有較強(qiáng)抗逆性的牡丹花品種已成為一項(xiàng)非常重要和緊迫的工作。前期,我們已經(jīng)獲得了牡丹抗逆轉(zhuǎn)錄因子psdreb1基因,并明確了該基因可以提高植物抗干旱和高鹽的能力。但其具體的作用機(jī)制尚未明確。啟動(dòng)子是存在于基因上游、rna聚合酶能夠識(shí)別并與之結(jié)合、從而起始基因轉(zhuǎn)錄的一段核苷酸序列,該序列包含了大量的調(diào)控下游基因表達(dá)的順式作用元件。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:針對(duì)目前牡丹psdreb1啟動(dòng)子方面的研究在國(guó)內(nèi)仍為空白這一現(xiàn)狀,本發(fā)明的目的在于提供一種牡丹psdreb1基因的抗干旱和高鹽啟動(dòng)子及其表達(dá)和應(yīng)用。為達(dá)到上述目的,本發(fā)明采用的實(shí)施方案是:一種牡丹psdreb1基因的抗干旱和高鹽啟動(dòng)子,所述啟動(dòng)子drebp,核苷酸序列如seqidno:1所示,啟動(dòng)子區(qū)域含有三個(gè)abre順式作用元件,能特異性地對(duì)aba進(jìn)行應(yīng)答反應(yīng),含有一個(gè)與干旱誘導(dǎo)相關(guān)的myb結(jié)合位點(diǎn)。一種采用所述的啟動(dòng)子構(gòu)建的表達(dá)載體,啟動(dòng)子序列drebp構(gòu)建到植物表達(dá)載體pbi121上,從而獲得重組載體pbi121-drebp-gus。一種根據(jù)所述的啟動(dòng)子的應(yīng)用,通過調(diào)控啟動(dòng)子drebp的表達(dá),從而調(diào)控牡丹抗干旱和高鹽的能力。本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明首次從牡丹中克隆dreb1轉(zhuǎn)錄因子基因的啟動(dòng)子drebp;本發(fā)明分析了drebp啟動(dòng)子的順式作用元件,發(fā)現(xiàn)其含有典型的tatabox、caatbox以及與逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)聯(lián)的結(jié)構(gòu)域;通過轉(zhuǎn)化擬南芥進(jìn)行功能驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子屬于組成型啟動(dòng)子,并受逆境如干旱、高鹽等脅迫的誘導(dǎo)。附圖說明圖1為重組載體pbi121-drebp-gus構(gòu)建流程圖;圖2為轉(zhuǎn)drebp擬南芥陽(yáng)性植株不同組織器官和不同發(fā)育時(shí)期的gus染色定性分析結(jié)果;其中,a部分組織器官:分別為a根、b莖、c葉、d花、e果莢、f種子;b部分5天幼苗的狀態(tài);c部分10天幼苗的狀態(tài);d部分25天幼苗的狀態(tài);圖3為轉(zhuǎn)drebp擬南芥陽(yáng)性植株在干旱、高鹽脅迫下的gus染色定性分析結(jié)果;圖4a為轉(zhuǎn)drebp擬南芥陽(yáng)性植株根、莖、葉gus定量分析結(jié)果;圖4b為轉(zhuǎn)drebp擬南芥陽(yáng)性植株干旱、高鹽gus定量分析結(jié)果。具體實(shí)施方式啟動(dòng)子的克隆,對(duì)于研究植物基因表達(dá)調(diào)控和構(gòu)建表達(dá)載體以及后續(xù)轉(zhuǎn)化模式植物進(jìn)行功能驗(yàn)證至關(guān)重要。對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行功能分析,能夠揭示植物響應(yīng)逆境脅迫的作用機(jī)制。為了進(jìn)一步揭示psdreb1基因提高植物抗干旱和高鹽能力的分子機(jī)制,我們?cè)噲D找到牡丹psdreb1相關(guān)的啟動(dòng)子,并進(jìn)行克隆、載體構(gòu)建及功能分析。啟動(dòng)子克隆的成功與否,與引物設(shè)計(jì)、克隆的方法等都有很大關(guān)系,如果引物設(shè)計(jì)不合理將不能成功地獲得啟動(dòng)子序列;如果克隆的方法不當(dāng),可能獲得的啟動(dòng)子序列不完全或者拿不到想要的啟動(dòng)子序列。我們主要采用取以下的步驟:(1)啟動(dòng)子克?。焊鶕?jù)牡丹psdreb1基因序列設(shè)計(jì)上游引物,采用染色體步移法克隆獲得其上游啟動(dòng)子序列drebp,如seqidno:1所示;(2)載體構(gòu)建:將上述獲得的啟動(dòng)子序列drebp構(gòu)建到植物表達(dá)載體pbi121上,從而獲得重組載體pbi121-drebp-gus;(3)遺傳轉(zhuǎn)化:將2構(gòu)建的重組載體通過蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥,獲得轉(zhuǎn)基因后代;(4)功能驗(yàn)證:將已轉(zhuǎn)入drebp-pbi121的擬南芥陽(yáng)性植株進(jìn)行g(shù)us染色的定性及定量分析,明確其表達(dá)模式。實(shí)施例1牡丹psdreb1啟動(dòng)子序列drebp的克隆于2016年1月取3年生牡丹品種‘洛陽(yáng)紅’的幼嫩葉片為材料,采用omega公司生產(chǎn)的trizol試劑盒提取總dna,以此為模板。根據(jù)psdreb1基因全長(zhǎng)序列,設(shè)計(jì)反向引物sp1-caacagaaggggatcagcgaag(seqidno:2),sp2-ctttggttttacctcttgctcgt(seqidno:3),sp3-cggatttctcattttcccatttc(seqidno:4),使用takara公司的genomewalkingkit(codeno.6108),用上述模板進(jìn)行反應(yīng)。經(jīng)過pcr擴(kuò)增獲得大小約2kb的產(chǎn)物。使用takara公司的minibestaragrosegeldnaextractionkitver4.0(codeno.9762)切膠回收上述pcr產(chǎn)物,命名為p1。使用takara公司的dnaligationkit(codeno.6022)中的solutioni,將p1產(chǎn)物與pmd19-tvector(codeno.6013)連接,熱轉(zhuǎn)化至e.colicompetentcellsjm109(codeno.9052)中,涂布平板,37℃過夜培養(yǎng)。挑選陽(yáng)性菌落植菌,提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒。使用引物f1-ctgctgatttggtatttgga(seqidno:5),r1-ttcctggatctctattctga(seqidno:6)對(duì)獲得的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果如seqidno:1所示,將測(cè)序獲得的序列與已知的psdreb1進(jìn)行blast比對(duì),結(jié)果表明獲得的序列是已知psdreb1基因的上游啟動(dòng)子序列,該序列全長(zhǎng)為2245bp,命名為drebp。啟動(dòng)子序列分析:使用在線分析軟件plantcare和place程序分析所獲得的啟動(dòng)子drebp序列的順式作用元件和調(diào)控元件,在線分析網(wǎng)址分別為:www.plantcare.com/encyclopedia和www.dna.affrc.go.jp/place。分析結(jié)果顯示:drebp啟動(dòng)子序列含有65個(gè)與轉(zhuǎn)錄起始相關(guān)的tatabox結(jié)構(gòu),22個(gè)與組織特異性相關(guān)的caatbox結(jié)構(gòu),15個(gè)與環(huán)境脅迫相關(guān)的元件如光脅迫響應(yīng)元件atct-motif、box4、boxi、g-box、gag-motif、gt1-motif、i-box、sp1、tct-motif和chs-cma,熱脅迫響應(yīng)元件hse、干旱脅迫響應(yīng)元件myb、真菌誘導(dǎo)響應(yīng)元件box-w1等,另外還有一些植物激素感應(yīng)元件如感應(yīng)脫落酸aba的abre、感應(yīng)茉莉酸甲酯meja的cgtca和tgacg結(jié)構(gòu)、感應(yīng)赤霉素ga的garemotif以及感應(yīng)水楊酸sa的tcamotif等。具體如表1所示。表1牡丹psderb1啟動(dòng)子drebp序列結(jié)構(gòu)分析結(jié)果元件名稱數(shù)量序列功能abre3gacacgtacgt,tacgtg,gccacgtaca受干旱、aba、鹽脅迫的誘導(dǎo)are2tggttt厭氧菌誘導(dǎo)的調(diào)控元件atct-motif1aatctaatcc受光的誘導(dǎo)box41attaat受光的誘導(dǎo)boxi1tttcaaa受光的誘導(dǎo)box-w11ttgacc受真菌的誘導(dǎo)caat-box22caat,caaat啟動(dòng)子增強(qiáng)區(qū)域cgtca-motif1cgtca茉莉酸甲酯響應(yīng)的調(diào)控元件g-box3cacgta,gtacgtg,tacgtg光感應(yīng)的調(diào)控元件gag-motif1agagagt受光的誘導(dǎo)gare-motif1tctgttg赤霉素響應(yīng)的調(diào)控元件gt1-motif3ggttaa光感應(yīng)的調(diào)控元件hse2aaaaaatttc受高溫脅迫誘導(dǎo)i-box1aagataaggct受光的誘導(dǎo)mbs1caactgmyb結(jié)合位點(diǎn),干旱誘導(dǎo)相關(guān)mbsii1aaaagttagttamyb結(jié)合位點(diǎn),類黃酮合成相關(guān)skn-1motif1gtcat胚乳特異性表達(dá)元件sp13cc(g/a)ccc光感應(yīng)的調(diào)控元件tata-box65taata,taaaaataa,tacaaaa…轉(zhuǎn)錄起始tca-element1gagaagaata水楊酸響應(yīng)元件tct-motif1tcttac受光的誘導(dǎo)tgacg-motiv1tgacg茉莉酸甲酯響應(yīng)的調(diào)控元件chs-cma2ttacttaa,gcaattcc受光的誘導(dǎo)實(shí)施例2重組載體pbi121-drebp-gus的構(gòu)建insertdna(目的dna)的制備:以上述獲得的啟動(dòng)子drebp質(zhì)粒為模板,采用引物對(duì)f2(seqidno:7)/r2(seqidno:8)使用takara公司的primestar??hs(premix)(codeno.r040a)進(jìn)行pcr擴(kuò)增,擴(kuò)增體系為:drebp質(zhì)粒(50倍稀釋液)1μl,f2(20pmol/μl)0.5μl,r2(20pmol/μl)0.5μl,primestarhs(premix)25μl,加dh2o至50μl;反應(yīng)條件:98℃10s,55℃15s,72℃90s,共30個(gè)循環(huán)。取5μlpcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,并使用takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0(codeno.9762)切膠回收目的片段,命名為insertdna。vectordna(載體dna)的制備:以質(zhì)粒pbi121為模板,采用限制性內(nèi)切酶hindiii和xbai進(jìn)行雙酶切,酶切反應(yīng)體系為:pbi121質(zhì)粒dna30μl,10×buffer5μl,hindiii(10u/μl)1.5μl,xbair2(10u/μl)1.5μl,加dh2o至50μl;反應(yīng)條件:37℃16h。取5μlpcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,并使用takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0(codeno.9762)切膠回收載體片段,命名為vectordna。重組質(zhì)粒的構(gòu)建:使用in-fusion??hdcloningkit(clontechcodeno.639633),將insertdna和vectordna連接,連接反應(yīng)體系如下:insertdna(約50ng/μl)1μl,vectordna(約80ng/μl)1μl,5×in-fusionhdenzymepremix2μl,加dh2o至10μl。反應(yīng)條件:50℃,15min。將連接產(chǎn)物取1μl熱轉(zhuǎn)化至e.colicompetentcelljm109(codeno.9052)中,涂布平板,37℃過夜培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性克隆,提取質(zhì)粒并使用引物vp1(seqidno:9)/vp2(seqidno:10)對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序獲得的結(jié)果經(jīng)blast比對(duì),確認(rèn)為成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒,并命名為pbi121-drebp-gus。構(gòu)建流程如圖1所示。實(shí)施例3遺傳轉(zhuǎn)化將上述構(gòu)建好的重組載體質(zhì)粒采用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌gv3101,然后采用clough和bent(1998)報(bào)道的蘸花法轉(zhuǎn)入擬南芥。采集擬南芥轉(zhuǎn)化苗的f1代種子,在含有40mg/l卡那霉素(kan)的1/2ms培養(yǎng)基上進(jìn)行初步篩選培養(yǎng),篩選出的陽(yáng)性植株再使用引物對(duì)vp1/vp2進(jìn)行pcr鑒定,鑒定為陽(yáng)性的植株繼續(xù)種植從而收集f2代種子。延續(xù)上述方法,繼續(xù)獲得純合的f3代種子。實(shí)施例4功能分析無菌播種:將獲得的擬南芥轉(zhuǎn)化苗的f3代種子經(jīng)1%的naclo表面消毒10min,無菌水清洗6遍后,播種在1/2ms+蔗糖20g/l+瓊脂粉7.5g/l(ph5.8)的培養(yǎng)基上,先22℃暗培養(yǎng)48h后再進(jìn)行光培養(yǎng)。不同組織器官的表達(dá)模式分析:將光培養(yǎng)40天的擬南芥轉(zhuǎn)化苗,使用中科瑞泰(北京)生物科技有限公司的gus染色試劑盒(貨號(hào):rtu4032)進(jìn)行染色。具體染色方法如下:gus染色液配制:將1mlx-gluc染色液加入到50mlgus染色緩沖液中,即配成gus染色溶液。染色步驟:1)將準(zhǔn)備好的擬南芥轉(zhuǎn)化苗浸泡在gus染色液中,于25℃染色過夜;2)染過色的植株依次轉(zhuǎn)入25%、50%、75%、95%的乙醇中,分別在25℃搖床上120rpm振蕩脫色20min;3)顯微鏡下觀察擬南芥轉(zhuǎn)化苗根、莖、葉、花、果莢、種子等不同組織器官的gus染色結(jié)果。染色結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)入drebp的擬南芥植株,在根、莖、葉、花、果莢中都有g(shù)us基因的表達(dá),而在種子里無表達(dá),其中根部表達(dá)量最高,其次是葉片和莖干,如圖2a所示。定量分析以25d轉(zhuǎn)化苗作為材料,使用上海江萊生物科技有限公司的植物guselisa試劑盒(cat.no.jl13690)進(jìn)行測(cè)定,具體方法參照說明書,gus定量結(jié)果與染色結(jié)果吻合,即根部表達(dá)最強(qiáng),其次是葉片和莖干,如圖4a所示。不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式分析:將無菌培養(yǎng)5d、10d和25d的擬南芥轉(zhuǎn)化苗,使用上述方法分別進(jìn)行g(shù)us染色并在顯微鏡下觀察染色結(jié)果,結(jié)果顯示:擬南芥轉(zhuǎn)化苗在不同發(fā)育時(shí)期均有不同的表達(dá)模式,5d發(fā)芽期,只在主根的成熟區(qū)進(jìn)行表達(dá),其他部位不表達(dá),如圖2b所示;10d幼苗期,在主根的成熟區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)均有表達(dá),葉片也有表達(dá),莖干部分有輕微的染色,說明在莖部位表達(dá)很少,如圖2c所示;25d花苞期,gus染色布滿整個(gè)植株,根、莖、葉、花苞都有g(shù)us表達(dá),其中又以根部表達(dá)最強(qiáng)、其次是葉片和花苞、莖干表達(dá)較其他部位稍弱,如圖2d所示。不同逆境脅迫下的表達(dá)模式分析:采集無菌播種25d的擬南芥轉(zhuǎn)化苗,分別將其根系浸泡在含有10%的聚乙二醇(peg6000)、300μm的nacl溶液中,以模擬干旱和高鹽脅迫,以蒸餾水作為對(duì)照,分別處理2h。取處理后的植株分別進(jìn)行g(shù)us染色定性分析和gus定量分析。gus染色結(jié)果顯示:干旱和高鹽脅迫處理后,gus染色程度明顯高于對(duì)照,如圖3所示;gus定量分析結(jié)果顯示:與gus染色結(jié)果相吻合,即經(jīng)干旱和高鹽處理后gus表達(dá)量高于對(duì)照,且高鹽脅迫下的表達(dá)量最高,如圖4b所示。sequencelisting<110>浙江省蕭山棉麻研究所<120>牡丹psdreb1基因的抗干旱和高鹽啟動(dòng)子及其表達(dá)和應(yīng)用<160>10<170>patentinversion3.5<210>1<211>2245<212>dna<213>paeoniasuffruticosa<400>1cgcgacgcatgcgcatccttttactcatttaccccaaacaaactaaccctagttaactga60actccgtttcactttcaccgacgttaaccatggttagttaaacccagcccttgatttgcg120taatgaaactctgttccccactcgagaatcgagggaatccaaacgtctctatctctcgct180acaattttttttctttctgggactggcgccgcaattgaagaagagaagcttttgtcctca240gtggccacttgattatggctctcaaccatggtttcgttaaaaactaaccatagttatcag300ttgatcattcagcaaactttcaaccaacgcactttcccacttaggcttattttaatcggg360ttttggtattggttttaataaataaaaaaggtctaatttagatgagattgtgtggataag420aatgatgccgttaaagattagtattatccattgtccaaccactactataaccatttcact480gtgatgatgtaacgtgcttatgtacggcgcacccatgtcaatcttaatcagtaaattaaa540aactatttttttttataaaatttaatctatttggttttttacccggtagttgttatttac600attatttcgctttcatccaattattcatttaaggtcctgtttgggatagcttctgcttat660gcttataaacagtaaaagtagagaagcagaagccagtgcagcttaaaactgctgatttgg720tatttggaaactgtttttggaagtgctttttagtaatatgttaaccagccttaaaaataa780attttgtataaaaactgcttatttttctgctttttgagaaaaagctatcccttaggtgct840tctgccaaaaaacactttttggcttttaagcactttttagtcaagtatgccaaacaccgt900aaaagcacttatatatgaaaataagtgcttataagcagcttataagcttagccaaacagg960gcctaagtctgactaacttttatattttcacacctacattctatggttatttattattat1020cgttcgagtttttaattcattgaattaaatttgaatttactagaatcttaaatcgagatg1080atgagtgcaccttacatctacacacctataatccatggctcttaactttctatgccagac1140tcttcaccactatagttcgagtctcgatctcatcgaactaagtttcaattcactcaaatc1200ctaaatcgagatgttgagtgcaccttaactttctaagtcagacttttcaccactagactt1260atcttagtagtttaatttaatatatttgtttacagtcatatttgtcgatacgatttttca1320accatctaatttattttttttataaaatcattgtccaaccctaattcataatactcaacc1380ttaattcaaaatactaaggtaagagaaaggacaaaaatgtattaaattctaaaggtaata1440tactcaatcagtcaatcacttacaaacaagtatgggtagtgtgaaggtaatatactcaat1500ccgtcaatcacttacaaacaagtatgggtagtgtgttatctccacccaaatgttggtggt1560caataaatatgaagttcatgtacgtgtcgctatagtattggatttgatttatgagtttag1620tttttaaaaaaaataaagaattaggtatctttcaagttgacaaaggttaaaaaaaaagaa1680gtgataactaagtaaaaagaaatatgaaaatagtgagaagaaagagagtaataattaagt1740aaagaaatgggaaaatgagaaatccgtgcgcctggaagtttatataagaggatgggtggg1800ggagggtacgagcaagaggtaaaaccaaagtgaggccacgaaaaaagagtgatacagttt1860ctctcactttctgcaactgcttttgatcatcatcttcttcttctcccccatccccacttc1920gctgatccccttctgttgtctcctgtctttcaattaattgttttgggtattgtttttttg1980tgatttttgtttgatatttgtgggttaaaaaaagcaattccagaaaggtgtttttga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