本發(fā)明屬于細(xì)胞分化和培養(yǎng)領(lǐng)域，特別涉及一種從外周血單個核細(xì)胞中大量擴(kuò)增nk細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

自然殺傷細(xì)胞(naturalkiller，nk)來源于骨髓淋巴樣干細(xì)胞，其分化、發(fā)育依賴于骨髓或胸腺微環(huán)境，主要分布于外周血和脾臟，在淋巴結(jié)和其他組織中也有少量存在。nk細(xì)胞不表達(dá)特異性抗原識別受體，是不同于t、b淋巴細(xì)胞的第三類淋巴細(xì)胞。nk細(xì)胞表達(dá)cd56但是缺失cd3，通常用標(biāo)志物組合cd3-cd56+來定義nk細(xì)胞。nk細(xì)胞主要存在于外周血和脾臟中，大概占到外周血淋巴細(xì)胞的5％～15％。

nk細(xì)胞在無需抗原預(yù)先致敏的情況下就能直接殺傷腫瘤細(xì)胞和被感染的細(xì)胞。nk細(xì)胞可以通過多種方式殺傷靶細(xì)胞：1、與靶細(xì)胞接觸后，nk細(xì)胞通過釋放穿孔素和顆粒酶殺傷靶細(xì)胞；2、通過自身表達(dá)的配體，來激活靶細(xì)胞表面的死亡受體；3、通過抗體依賴的細(xì)胞毒性作用對靶細(xì)胞造成殺傷；4、活化的nk細(xì)胞通過釋放tnf引發(fā)靶細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。

nk細(xì)胞是人體的第一道抵御防線，是機(jī)體抵抗惡性腫瘤細(xì)胞和抗病毒感染的重要免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，也是連接天然免疫和特異性免疫的重要橋梁。外周血中的nk細(xì)胞數(shù)量非常有限，所以限制了nk細(xì)胞的臨床應(yīng)用。當(dāng)今獲得臨床級nk細(xì)胞的方法是體外培養(yǎng)，即分離患者外周血的單個核細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)和擴(kuò)增，使其增加數(shù)百甚至數(shù)千倍并且細(xì)胞毒性得到很大的提高，再把nk細(xì)胞回輸?shù)交颊叩捏w內(nèi)，但是常規(guī)的nk細(xì)胞的制備方法并不理想。

nk細(xì)胞在體外難以得到大量增殖，常見的nk細(xì)胞的擴(kuò)增方法包括免疫磁珠分選法(millerjs,etal.,blood105(8):3051-7,2005)、滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法(fujisakih,etal.,cancerres69(9):4010-7,2009)和使用動物血清(iliopouloueg,etal.,cancerimmunolimmunother59(12):1781-9,2010)。動物血清能提供細(xì)胞培養(yǎng)所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，還能提供激素和各種生長因子。然而，動物血清成分復(fù)雜，在臨床治療中有一些潛在的風(fēng)險。使用滋養(yǎng)層細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞株k562)是一種有效的nk細(xì)胞培養(yǎng)方法。不使用滋養(yǎng)層細(xì)胞其培養(yǎng)效果和培養(yǎng)純度均不夠理想，使用滋養(yǎng)層細(xì)胞會得到純度較高的nk細(xì)胞，但是k562細(xì)胞本身是一種腫瘤細(xì)胞，所以其安全性仍然是一個問題。免疫磁珠的方法過程繁瑣，成本較高，并且純的nk細(xì)胞增殖速度較慢，還會引入外源性物質(zhì)(磁珠、洗脫液中的成分和抗體等)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中nk細(xì)胞純度不夠、擴(kuò)增倍數(shù)不高、擴(kuò)增方法成本高且比較麻煩以及安全性不夠的問題，本發(fā)明提供了一種從外周血單個核細(xì)胞中大量擴(kuò)增nk細(xì)胞的方法，該方法不含動物血清和腫瘤細(xì)胞成分，從而很大程度上提高了nk細(xì)胞的安全性和可靠性，具有良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的一種從外周血單個核細(xì)胞中大量擴(kuò)增nk細(xì)胞的方法，包括：

采集100～200ml外周血的單個核細(xì)胞，先將單個核細(xì)胞放入被cd16單抗包被過的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入il-2、il-15、ok432和滅活的自體血清；隨后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入到?jīng)]有被cd16單抗包被過的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入il-2、il-15和滅活的自體血清；再把細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)袋中培養(yǎng)，倒數(shù)第三天培養(yǎng)基中加入il-4繼續(xù)培養(yǎng)，即得大量nk細(xì)胞。

所述cd16單抗?jié)舛葹?.01～3.0mg/ml，包被溫度為4℃，包被時間為2～16小時。優(yōu)選濃度為0.15mg/ml，優(yōu)選包被時間為16小時。

所述含il-2、il-15、ok432和滅活的自體血清的培養(yǎng)基的具體組成為：100～1000u/ml的il-2、10～200ng/ml的il-15、0.01～1ke/ml的ok432和5～10％滅活的自體血清。優(yōu)選：700u/ml的il-2、100ng/ml的il-15、0.01ke/ml的ok432和10％滅活的自體血清。

所述含il-2、il-15和滅活的自體血清的培養(yǎng)基的具體組成為：100～1000u/ml的il-2、10～200ng/ml的il-15和5～10％滅活的自體血清。

所述培養(yǎng)基為gt-t551無血清培養(yǎng)基。

所述單個核細(xì)胞放入被cd16單抗包被過的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)三至五天，優(yōu)選五天。

所述轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)袋中培養(yǎng)后每2-3天細(xì)胞傳代或者換液一次。

所述倒數(shù)第三天培養(yǎng)基中加入300～500u/ml的il-4，優(yōu)選500u/ml。

能用于nk細(xì)胞的培養(yǎng)基有很多種，只要可以把外周血單個核細(xì)胞誘導(dǎo)成為nk細(xì)胞并使之增殖即可，常見nk細(xì)胞的培養(yǎng)基通常有x-vivo10、x-vivo20、gt-t551無血清培養(yǎng)基、optmizercstt-cellexpansion無血清培養(yǎng)基和cellgro無血清培養(yǎng)基等。本發(fā)明使用的nk培養(yǎng)基是gt-t551無血清培養(yǎng)基。

本發(fā)明所添加的細(xì)胞因子包含白介素2(il-2)、白介素4(il-4)、白介素15(il-15)。在缺失受體γc(commonchaingama)的老鼠中未能檢測到nk細(xì)胞，因此認(rèn)為受體γc對nk細(xì)胞的發(fā)育起到至關(guān)重要的作用(disantojp,etal.,procnatlacadsciusa92(2):377-81,1995)。細(xì)胞因子例如il-2、il-4、il-7、il-9、il-15和il-21的細(xì)胞受體都包含受體γc(waldmannta，cancerimmunolres3(3):219-27,2015)。敲除基因il-2會造成nk細(xì)胞的缺失(disantojp,etal.,j.exp.med171(5):1697-704,1990)，il-2能夠提高nk細(xì)胞的增殖能力(shibuyaa,etal.,blood85(12):3538-46,1995)。il-15同樣對nk細(xì)胞的發(fā)育和增殖起著至關(guān)重要的作用(huntingtonndetal.,j.exp.med206(1):25-34,2009)；其他的細(xì)胞因子例如il-4，和il-15合作能增強(qiáng)nk細(xì)胞的殺傷能力(kiniwat,etal.,procnatlacadsciusa113(36):10139-44,2016)。

ok432是一種能激活免疫能力的制劑，對免疫系統(tǒng)有多重激活作用，而且ok432還能提高nk細(xì)胞的毒性(bonavidab,etal.,cellimmunol102(1):126-35,1986)。cd16即fcγrⅲ，為分子量為50000～70000的糖蛋白，屬ig超家族成員，nk細(xì)胞上交聯(lián)的cd16直接導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ca+水平的增加和一系列的類似于t細(xì)胞受體激活的級聯(lián)生化反應(yīng)，cd16單克隆抗體可激活nk細(xì)胞抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用。本發(fā)明在培養(yǎng)基中聯(lián)合使用il-2等多種細(xì)胞因子、ok432和cd16單抗，很大程度上提高了nk細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)，又提高了nk細(xì)胞的殺傷能力。

有益效果

(1)本發(fā)明用滅活的自體血清代替動物血清，解決了使用動物血清在培養(yǎng)nk細(xì)胞中帶來的不安全問題。

(2)對于傳統(tǒng)的nk細(xì)胞培養(yǎng)方法，使用滋養(yǎng)層細(xì)胞會得到純度很高的nk細(xì)胞，不使用滋養(yǎng)層細(xì)胞的話，nk細(xì)胞的純度會比較低。本發(fā)明繞開了滋養(yǎng)層細(xì)胞，在培養(yǎng)基中加入了免疫激活劑ok432，使用cd16單抗直接快速有效的激活了nk細(xì)胞的增殖信號；所以本發(fā)明在沒有滋養(yǎng)層細(xì)胞的條件下，仍然能夠得到高純度的nk細(xì)胞。

(3)本發(fā)明在細(xì)胞培養(yǎng)的最后三天加入了il-4，極大的提高了nk細(xì)胞的殺傷能力。

(4)在細(xì)胞的增殖處于對數(shù)期的時候，把細(xì)胞從培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)到培養(yǎng)袋中培養(yǎng)：第一，保證了nk細(xì)胞被充分激活；第二，稀釋了細(xì)胞代謝產(chǎn)物對細(xì)胞的不利影響；第三，在同等條件下，培養(yǎng)袋的培養(yǎng)效果要優(yōu)于培養(yǎng)瓶。

附圖說明

圖1是常規(guī)培養(yǎng)方法與本發(fā)明所得nk細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)的比較圖；

圖2是常規(guī)培養(yǎng)方法與本發(fā)明所得nk細(xì)胞的活力比較圖；

圖3是常規(guī)培養(yǎng)方法與本發(fā)明所得nk細(xì)胞的純度比較圖；

圖4是本發(fā)明所得nk細(xì)胞的其他標(biāo)志物的表達(dá)水平；

圖5是常規(guī)培養(yǎng)方法與本發(fā)明所得nk細(xì)胞對k562殺傷能力的曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實(shí)施例1

一、pbmc的分離過程

用25ml生理鹽水溶解500μg人cd16單抗，然后完全加入到一個t175的培養(yǎng)瓶中。使液體鋪滿瓶底，把培養(yǎng)瓶平放在4℃冰箱中包被過夜(16個小時)。

從患者外周血中分離外周血，用注射器吸出血液緩緩滴入50ml離心管中。用600g的轉(zhuǎn)速離心20分鐘；分離后的血液上層為血漿層，下層為血細(xì)胞層。吸取上層血漿，封口，56℃滅活30分鐘，滅活完畢；4℃放置15分鐘，用1800g的速度離心15分鐘，自體血漿離心結(jié)束后，分裝到15ml離心管中，根據(jù)當(dāng)前需要把血漿保存在-20℃或4℃中。用與血細(xì)胞沉淀等體積的生理鹽水重懸下層血細(xì)胞沉淀，混合均勻。

預(yù)先把人淋巴細(xì)胞分離液ficoll-hypaque(密度為1.077g/ml)平衡到室溫。把20mlficoll緩慢加入到50ml體積的無菌離心管中，傾斜離心管45度，在離ficoll液面上1cm處把等體積的細(xì)胞懸液緩慢加到ficoll上面。把離心管放入水平離心機(jī)，用500g的速度離心20分鐘。

從離心管中吸取中間白膜層，加入到新的50ml離心管中。吹打均勻，用生理鹽水定容至45ml，600g離心10分鐘。離心后棄上清，補(bǔ)加40～45ml生理鹽水吹打細(xì)胞至混勻，再次以500g離心10分鐘，棄上清得到外周血單個核細(xì)胞。用20～30ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，同時細(xì)胞計(jì)數(shù)。

二、nk細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)過程：

從培養(yǎng)瓶中吸走cd16單抗液體。用含有700u/mlil-2、100ng/mlil-15、0.01ke/ml的ok432和10％滅活的自體血清的optmizercstt-cellexpansion培養(yǎng)基培養(yǎng)把pbmc的濃度調(diào)整為1.5×106個/ml，把25mlpbmc細(xì)胞懸液加入到被cd16單抗包被過的t175的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

細(xì)胞在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，把所有的細(xì)胞用25～30ml新鮮的培養(yǎng)基重懸，全部轉(zhuǎn)移到另外一個新的沒有被cd16單抗包被過的t175的培養(yǎng)瓶中(培養(yǎng)基中含有700u/mlil-2、100ng/mlil-15和10％滅活的自體血清)。

在第八天的時候，把細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)袋中培養(yǎng)，細(xì)胞的接種密度是1.5～2.0×106個/ml，此時使用的培養(yǎng)基仍然是用含有700u/mlil-2、100ng/mlil-15和10％滅火的自體血清的optmizercstt-cellexpansion培養(yǎng)基。細(xì)胞每2到3天換液或者傳代一次；在第18天的時候，培養(yǎng)基中添加500u/mlil-4，總共培養(yǎng)21天以后就能夠得到大量高純度的nk細(xì)胞。三、擴(kuò)大培養(yǎng)后細(xì)胞的表型分析：

從培養(yǎng)瓶中取出細(xì)胞，每個5ml流式細(xì)胞儀檢測管中加入1×106個細(xì)胞，用800rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，丟掉上清；用pbs洗細(xì)胞一次，用800rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，丟掉上清。

用10μghumanigg封閉每管細(xì)胞，室溫下封閉15分鐘。然后根據(jù)抗體說明書上指定的抗體使用量把抗體直接加到細(xì)胞里面，4℃孵育30分鐘。

用4ml的pbs洗細(xì)胞2次，用300μl的pbs重懸細(xì)胞。

使用流式細(xì)胞儀之前加入pi或者7-aad燃料。

流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)顯示：用本發(fā)明所得cd3-cd56+nk細(xì)胞的純度能高達(dá)98.7％；而用常規(guī)方法所得nk細(xì)胞的純度僅僅是40.5％。所以用本發(fā)明所得的nk細(xì)胞的純度明顯高于常規(guī)培養(yǎng)方法所得的細(xì)胞純度。

本發(fā)明所得nk細(xì)胞表達(dá)高水平的的ifn-γ和其他nk細(xì)胞標(biāo)志物nkp30，nkp44，nkp46和nkg2d。21天以后，本發(fā)明所得nk細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)是290±20，而用常規(guī)方法所得nk細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)是145±26，所以本發(fā)明的nk細(xì)胞擴(kuò)增效率幾乎是常規(guī)培養(yǎng)方法的兩倍。

四、擴(kuò)大培養(yǎng)和免疫細(xì)胞的活力(viability)分析

用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(556547，bdbiosciences)檢測免疫細(xì)胞的活力。收集免疫細(xì)胞，離心去除上清，用預(yù)冷的pbs(phosphatebuffersaline)緩沖液洗兩遍。

用1×bindingbuffer把細(xì)胞稀釋成1×106個/ml的細(xì)胞懸液；把100μl的細(xì)胞懸液加到一個5ml的圓底離心管中；加入5μlpi和5μlannexinv試劑，輕輕混勻細(xì)胞，室溫下避光放置15分鐘，然后加入400μl1×bindingbuffer，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的凋亡情況。

在細(xì)胞活力方面，用本發(fā)明和常規(guī)方法沒有明顯的區(qū)別；兩種培養(yǎng)制備方法所得的細(xì)胞活力都能在95％以上。

五、擴(kuò)大培養(yǎng)后免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)：

白血病細(xì)胞株k562培養(yǎng)在含有10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，取處于對數(shù)生長期的k562細(xì)胞計(jì)數(shù)并用于實(shí)驗(yàn)。

整個殺傷實(shí)驗(yàn)中用到的培養(yǎng)基是含有1％滅活的胎牛血清的1640培養(yǎng)基。用到的試劑盒是非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒(promega,g1780)。

用新鮮的培養(yǎng)基把k562細(xì)胞制成1×105個/ml的細(xì)胞懸液，加入到圓底的96孔板中，每孔100μl。用同樣的培養(yǎng)基調(diào)整一系列nk細(xì)胞的濃度，把80μlnk細(xì)胞按照效應(yīng)細(xì)胞：靶細(xì)胞為1:1、10:1、30:1、50:1的比例加入到k562細(xì)胞中；同時設(shè)置nk細(xì)胞對照和k562細(xì)胞對照組，培養(yǎng)基對照組和k562細(xì)胞最大釋放組，每孔的最終體積矯正為200μl，均設(shè)三個復(fù)孔，250g離心4分鐘，把細(xì)胞放在37度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6個小時。

在反應(yīng)結(jié)束前45分鐘，把20μl裂解液加入到靶細(xì)胞最大釋放組。反應(yīng)結(jié)束后從每個孔吸走50μl細(xì)胞上清至另一個新的96孔板，再加入50μlldh酶反應(yīng)液，混勻30秒，室溫下避光放置30分鐘，再加入50μl終止液，用酶標(biāo)儀測量每個孔的od值。

計(jì)算nk細(xì)胞殺傷活力的公式：自然殺傷活性％＝(實(shí)驗(yàn)組od值-nk細(xì)胞對照組od值-k562細(xì)胞對照組od值)/(k562細(xì)胞最大釋放組od值-k562細(xì)胞對照組od值)×100％

在不同的效靶比條件下，本發(fā)明所得nk細(xì)胞的殺傷效率均明顯的高于常規(guī)方法所得nk細(xì)胞的殺傷效率，見表1。效靶比越高，nk細(xì)胞的殺傷效率越高；在效靶比是30:1的時候，本發(fā)明制備的nk細(xì)胞的殺傷效率是90±8.3％，50:1的時候達(dá)到最大，93.2±5.2％。

表1殺傷效率的具體數(shù)值

注：對于每個組別，常規(guī)組和實(shí)驗(yàn)組的殺傷率存在顯著的差異，p<0.01。