本發(fā)明涉及病原微生物檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
：，具體說是涉及一種快速檢測產(chǎn)腸毒素大腸桿菌st-ii毒素的lamp檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：：大腸桿菌為腸道中最常見的一類細菌。依據(jù)它的致病性大致可分為：腸致病性大腸桿菌（enteropathogenice.coli，epec），侵襲性大腸桿菌（enteroinvasivee.coli，eiec）、產(chǎn)毒素性大腸桿菌（enterotoxigenice.coli，etec）、腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhagice.coli，ehec/stec）及粘附性大腸埃希菌（enteroaggregativee.coli，eaec）。其中etec可產(chǎn)生不耐熱性腸毒素（heatlabileenterotoxin，lt）和耐熱性腸素（heatstableenterotoxin，st），從而導(dǎo)致人或是牲畜出現(xiàn)嚴重的腹瀉。目前對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的檢測方法有傳統(tǒng)的檢測方法和基因檢測方法。傳統(tǒng)的檢測方法主要依賴于生理生化鑒定和毒素試驗，生理生化試驗參照gb4789.3進行，毒素試驗是判斷大腸桿菌致病性的重要指標。在檢測毒素時，常用的方法是家兔結(jié)扎回腸試驗、乳鼠灌胃試驗和雙向瓊脂擴散試驗，然而這些傳統(tǒng)的檢測方法費時費力，操作復(fù)雜，已不能滿足基層和臨床中及時、靈敏、快速的檢測要求，不利于疾病的預(yù)防?；驒z測技術(shù)主要是聚合酶鏈式反應(yīng)（pcr），pcr技術(shù)是一種利用dna聚合酶在體外大量擴增靶序列的技術(shù)，該技術(shù)是病原檢測最常規(guī)的方法之一，廣泛應(yīng)用于病原鑒定，變異檢測等分子生物學(xué)研究。pcr檢測技術(shù)靈敏度高、特異性強，已成為病原檢測的重要技術(shù)之一，主要包括常規(guī)pcr、巢式pcr、和實時熒光定量pcr等，但該技術(shù)需要依靠昂貴的pcr儀器設(shè)備，不利于基層生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediatedisothermalamplification,lamp）技術(shù)是由日本科學(xué)家開發(fā)的一種新穎的簡便、快速、高效及廉價的核酸體外擴增技術(shù)。該技術(shù)針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異的引物，在等溫條件下，通過bstdna聚合酶的鏈置換作用，短時間內(nèi)便使得產(chǎn)物得到大量擴增，擴增產(chǎn)物加入熒光染料sybrgreeni后，陽性結(jié)果變?yōu)榫G色，陰性無變化，可通過肉眼直接觀察。與常規(guī)pcr相比，該技術(shù)不需要模板的熱變性，溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程，反應(yīng)速度更快。因其具有特異性強、靈敏度高、設(shè)備簡單、擴增效率高以及產(chǎn)物檢測簡便等特點，尤為適合基層和現(xiàn)場病原檢測工作的需求。近年來，關(guān)于lamp技術(shù)的研究已經(jīng)取得了較大的進展，已經(jīng)在細菌檢測、病毒檢測、寄生蟲檢測、真菌和支原體檢測、動物胚胎性別鑒定、轉(zhuǎn)基因食品檢測以及腫瘤基因檢測中廣泛應(yīng)用。本發(fā)明采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)，建立了快速檢測st-ii型產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的方法，提高了檢測效率以及靈敏性，為基層準確檢測產(chǎn)腸毒素大腸桿菌提供了可能。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種st-ii型產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的lamp檢測試劑盒，目的是實現(xiàn)對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌進行特異、快速、簡便的現(xiàn)場檢測，改善原有檢測技術(shù)繁瑣、費時的弊端。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：1.lamp引物的設(shè)計從genbank檢索獲得產(chǎn)腸毒素大腸桿菌耐熱腸毒素st-ii基因序列，通過megalign軟件進行同源性對比分析，獲得一段st-ii毒素基因的保守序列seqno.1，采用primerexplorerv4軟件設(shè)計了4條特異性lamp檢測引物，包括正向外引物f3、反向外引物b3、正向內(nèi)引物fip和反向內(nèi)引物bip，引物序列分別為：正向外引物f3：5’-gcaataaggttgaggtgatt-3’；反向外引物b3：5’-gcaaccattatttgggcg-3’；正向內(nèi)引物fip：5’-tgattgtgtagatgcataggcattatttcttcttgcatctatgttcg-3；反向內(nèi)內(nèi)引物bip：5’-tagacaaatagccaaggaaagttgttgctccagcagtaccatc-3；2.根據(jù)所得lamp引物配制lamp反應(yīng)液，構(gòu)成檢測體系，進而組裝成一種用于檢測產(chǎn)腸毒素大腸桿菌腸毒素st-ii的lamp試劑盒。本發(fā)明的一種st-ii型產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的lamp檢測試劑盒，其包含如下組分：（1）反應(yīng)液i（23μl）：10×thermopolbuffer2.5μl；2.5mmdntpmix1～6μl；25mmmgcl20～3μl；8μl/ulbstdna酶0.2～1.2μl；10μm正向外引物f30.2～0.7μl；10μm反向外引物b30.2～0.7μl；10μm正向內(nèi)引物fip2～5μl；10μm反向內(nèi)引物bip2～5μl、其余為滅菌超純水；（2）陽性dna（2μl）：待測樣品dna；（3）顯色液（1μl）：sybrgreeni。本發(fā)明中，10×thermopolbuffer含有200mmph值為8.8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽（tris-hcl）、100mm氯化鉀（kcl）、100mm硫酸銨（（nh4）2so4）、20mm硫酸鎂（mgso4）及1％曲拉通x-100（triton-100）。本發(fā)明中，顯色液sybrgreeni為1000×sybrgreeni。進一步優(yōu)選的，所述lamp反應(yīng)液i（23μl）組成為：10×thermopolbuffer2.5μl；10mm的dntps4μl；25mm的mgcl21μl；8μl/μl的bstdna酶0.6μl；10μm的正向外引物f30.5μl；10μm的反向外引物b30.5μl；10μm的正向內(nèi)引物fip2μl；10μm的反向內(nèi)引物bip2μl，滅菌超純水9.9μl。此外，本發(fā)明還公開了采用上述試劑盒的使用方法，該方法包括如下步驟：包括如下步驟：（a）dna的提?。翰捎弥蠓蟹ㄌ崛na，取1ml細菌培養(yǎng)物，12000r/min離心5min；加入100μl超純水，混勻，100℃煮沸，迅速轉(zhuǎn)移至-20℃冷凍5min，然后4℃12000r/min離心5min，取上清，即為待測樣品中的dna；（b）lamp擴增：配置23μl反應(yīng)液，取2μl待測樣品dna與反應(yīng)液混勻，組成25μl反應(yīng)體系；取1μlsybrgreen滴加在反應(yīng)管蓋內(nèi)側(cè)，小心操作以免染料掉入反應(yīng)體系內(nèi)；將反應(yīng)管置于60℃～63℃恒溫水浴45min進行l(wèi)amp擴增，85℃加熱5min滅活酶的活性；（c）取出反應(yīng)管進行結(jié)果判斷：倒置反應(yīng)管，混勻顯色液和反應(yīng)液，若顏色為綠色，則樣品中含有st-ii型產(chǎn)腸毒素大腸桿菌，若顏色為橘黃色，則樣品中不含有st-ii型產(chǎn)腸毒素大腸桿菌。與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的優(yōu)點及效果：1．特異性強：所檢測的陰性對照細菌均無陽性結(jié)果出現(xiàn)，與pcr結(jié)果相一致。2．靈敏度高：普通pcr檢測最低限度為500pg/μl，而采用本發(fā)明檢測方法，檢測限最低可達到500fg/μl，是普通pcr的1000倍。3．時效性強：普通pcr檢測整個過程在2～4小時左右才能得出結(jié)果，而采用本發(fā)明檢測方法，只需1小時左右即可做出判斷結(jié)果。4．環(huán)保無污染：普通pcr結(jié)束后還要進行瓊脂糖凝膠電泳，使用eb染料等對人和環(huán)境會造成損害，而采用本發(fā)明檢測方法，無需昂貴的pcr儀，只需能夠控溫的普通水浴鍋即可，反應(yīng)結(jié)束后可直接通過肉眼觀察反應(yīng)液顏色變化而直接判定。同時有效地避免了因為開蓋造成的氣溶膠污染，確保了每次實驗結(jié)果的準確性，能較好的滿足對st-ii型產(chǎn)腸毒素大腸桿菌現(xiàn)場檢測的需要。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例3中st-ii型產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的lamp檢測試劑盒的可視化檢測圖；其中：1是待測樣品為st-ii型產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌；2待測樣品為超純水；圖2為本發(fā)明實施例3中st-ii型產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的lamp檢測試劑盒的電泳圖；其中：m.dnamarkerdl2000，1是待測樣品為st-ii型產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌；2是待測樣品為超純水；圖3為本發(fā)明實施例4中st-ii型產(chǎn)腸毒素大腸桿菌lamp檢測試劑盒特異性試驗結(jié)果；其中：1-10分別為空白對照，產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌，沙門菌，葡萄球菌，鴨疫里默氏桿菌，巴氏桿菌，變形桿菌，豬丹毒桿菌，產(chǎn)氣莢膜梭菌，鏈球菌；圖4為本發(fā)明實施例5中st-ii型產(chǎn)腸毒素大腸桿菌lamp檢測試劑盒靈敏性電泳結(jié)果；其中：m、dl2000dnamarker；1-9分別為：空白對照和500ng/μl，50ng/μl，5ng/μl，500pg/μl，50pg/μl，5pg/μl，500fg/μl，50fg/μl濃度的待測樣品。圖5為本發(fā)明實施例5中st-ii型產(chǎn)腸毒素大腸桿菌lamp檢測試劑盒靈敏性靈敏性可視化結(jié)果；其中：n為陰性對照；1-8分別為500ng/μl、50ng/μl、5ng/μl、500pg/μl、50pg/μl、5pg/μl、500fg/μl、50fg/μl濃度的待測樣品。圖6為本發(fā)明實施例6中st-ii型產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌常規(guī)pcr方法靈敏性檢測結(jié)果；其中m.dnamarkerdl2000；1-9分別為陰性對照和500ng/μl、50ng/μl、5ng/μl、500pg/μl、50pg/μl、5pg/μl、500fg/μl、50fg/μl濃度的待測樣品具體實施方式下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明做進一步描述：下面實施例中所用的試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下面實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明均可從商業(yè)途徑獲得。實施例1lamp引物的設(shè)計從genbank檢索獲得產(chǎn)腸毒素大腸桿菌耐熱腸毒素st-ii基因序列，通過megalign軟件進行同源性對比分析，獲得一段st-ii毒素基因的保守序列seqno.1，采用primerexplorerv4軟件設(shè)計了4條特異性lamp檢測引物，包括正向外引物f3、反向外引物b3、正向內(nèi)引物fip和反向內(nèi)引物bip，引物序列分別為：正向外引物f3：5’-gcaataaggttgaggtgatt-3’；反向外引物b3：5’-gcaaccattatttgggcg-3’；正向內(nèi)引物fip：5’-tgattgtgtagatgcataggcattatttcttcttgcatctatgttcg-3；反向內(nèi)內(nèi)引物bip：5’-tagacaaatagccaaggaaagttgttgctccagcagtaccatc-3；實施例2lamp檢測試劑盒的配置（1）反應(yīng)液i（23μl）：10×thermopolbuffer2.5μl；10mm的dntps4μl；25mm的mgcl21μl；8u/ul的bstdna酶0.6μl；10μm的正向外引物f30.5μl；10μm的反向外引物b30.5μl；10μm的正向內(nèi)引物fip2μl；10μm的反向內(nèi)引物bip2μl，滅菌超純水9.9μl。；（2）陽性dna（2μl）：待測樣品dna；（3）顯色液（1μl）：sybrgreeni。實施例3st-ii型產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的lamp檢測試劑盒使用方法（a）dna的提?。翰捎弥蠓蟹ㄌ崛na，取1ml細菌培養(yǎng)物，12000r/min離心5min；加入100μl超純水，混勻，100℃煮沸，迅速轉(zhuǎn)移至-20℃冷凍5min，然后4℃12000r/min離心5min。取上清，即為待測樣品中的dna；（b）lamp擴增：配置23μl反應(yīng)液，取2μl待測樣品dna與反應(yīng)液混勻，組成25μl反應(yīng)體系；取1μlsybrgreen滴加在反應(yīng)管蓋內(nèi)側(cè)，小心操作以免染料掉入反應(yīng)體系內(nèi)；將反應(yīng)管置于60℃～63℃的恒溫水浴45min進行l(wèi)amp擴增，85℃加熱5min滅活酶的活性；（c）取出反應(yīng)管進行結(jié)果判斷：倒置反應(yīng)管，混勻顯色液和反應(yīng)液，若顏色為綠色，則樣品中含有st-ii型產(chǎn)腸毒素大腸桿菌，若顏色為橘黃色，則樣品中不含有st-ii型產(chǎn)腸毒素大腸桿菌。試驗分為兩組，實驗組中待測樣品的dna為st-ii型產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的dna；對照組中待測樣品為超純水，結(jié)果如圖1，同時采用瓊脂糖凝膠電泳法進行觀察如圖2（采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，若有梯形條帶產(chǎn)生則為樣品中含有產(chǎn)腸毒素大腸桿菌，無梯形條帶則樣品中無產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌）。實施例4st-ii型產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的lamp檢測試劑盒特異性檢測（1）按照上述煮沸法分別提取st-ii型產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、沙門菌、葡萄球菌、鴨疫里默氏桿菌、巴氏桿菌、變形桿菌、豬丹毒桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、鏈球菌的dna，同時以超純水做為陰性對照；（2）配置23μl反應(yīng)液，取2μl待測樣品dna與反應(yīng)液混勻，組成25μl反應(yīng)體系；取1μlsybrgreen滴加在反應(yīng)管蓋內(nèi)側(cè)，小心操作以免染料掉入反應(yīng)體系內(nèi)；將反應(yīng)管置于60℃～63℃恒溫水浴45min進行l(wèi)amp擴增，85℃加熱5min滅活酶的活性；（3）取出反應(yīng)管進行結(jié)果判斷：倒置反應(yīng)管，混勻顯色液和反應(yīng)液，若顏色為綠色，則樣品中含有st-ii型產(chǎn)腸毒素大腸桿菌，若顏色為橘黃色，則樣品中不含有st-ii型產(chǎn)腸毒素大腸桿菌。結(jié)果如圖3，st-ii型產(chǎn)腸毒素大腸桿菌反應(yīng)管呈綠色，為陽性結(jié)果；而沙門菌、葡萄球菌、鴨疫里默氏桿菌、巴氏桿菌、變形桿菌、豬丹毒桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、鏈球菌以及超純水為陰性對照反應(yīng)管均呈現(xiàn)橘黃色，為陰性。實施例5st-ii型產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的lamp檢測試劑盒靈敏度檢測將提取的st-ii型產(chǎn)腸毒素大腸桿菌dna按10倍倍比稀釋至500ng/μl、50ng/μl、5ng/μl、500pg/μl、50pg/μl、5pg/μl、500fg/μl、50fg/μl8個稀釋度；分別取2μl各稀釋度的st-ii型產(chǎn)腸毒素大腸桿菌dna，按照上述實施例3的使用方法進行反應(yīng)并觀察結(jié)果；同時采用瓊脂糖凝膠電泳法進行觀察，結(jié)果如圖4和圖5，st-ii型產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的lamp檢測試劑靈敏度檢測限為500fg/μl。實施例6st-ii型產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌常規(guī)pcr方法靈敏性檢測st-ii型產(chǎn)腸毒素大腸桿菌pcr反應(yīng)組分如下：2×estaqmastermix12.5μl；10μmst-ii-forwardprimer：5’-atgtaaatacctacaacgggtgat-3’1μl；10μmst-ii-reverseprimer：5’-tatttgggcgccaaagcatgctcc-3’1μl；不同濃度st-ii型產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌dna模板（500ng/μl、50ng/μl、5ng/μl、500pg/μl、50pg/μl、5pg/μl、500fg/μl、50fg/μl）2μl，超純水8.5μl；pcr反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min，然后進入94℃變性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s的循環(huán)，共進行30個循環(huán)，最后再經(jīng)72℃延伸10分鐘。采用瓊脂糖凝膠電泳法進行觀察，結(jié)果如圖6st-ii型產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌常規(guī)pcr方法的檢測限為500pg/μl，本發(fā)明的lamp檢測法比常規(guī)pcr檢測法靈敏度高1000倍，完全可以替代常規(guī)pcr檢測方法。實施例7st-ii型產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的lamp檢測試劑盒臨床檢測利用本發(fā)明的st-ii型產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的lamp檢測試劑盒對揚州大學(xué)獸醫(yī)微生物實驗室分離保存的96株大腸桿菌進行檢測。結(jié)果顯示，96株大腸桿菌中有10株為st-ii型產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌，同時利用常規(guī)pcr方法對96株大腸桿菌進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，常規(guī)pcr檢測結(jié)果與本發(fā)明檢測試劑盒檢出陽性率一致，符合率達到100%。序列表<110>江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院<120>一種st-ii型產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的lamp檢測試劑盒及方法<160>7<170>primerexplorerv4<210>1<211>300<212>dna<213>st-ii基因的特異性保守靶序列<400>tcgtcacatttttttgacttgactcatataaaagcccactggtataagttttattgcttatagcaataaggttgaggtgattttatgaaaaagaatatcgcatttcttcttgcatctatgttcgttttttctattgctacaaatgcctatgcatctacacaatcaaataaaaaagatctgtgtgaacattatagacaaatagccaaggaaagttgtaaaaaaggttttttaggggttagagatggtactgctggagcatgctttggcgcccaaataatggttgcagcaaaaggatgctaa<210>2<211>20<212>dna<213>正向外引物f3<400>gcaataaggttgaggtgatt<210>3<211>18<212>dna<213>反向外引物b3<400>gcaaccattatttgggcg<210>4<211>47<212>dna<213>正向內(nèi)引物fip<400>tgattgtgtagatgcataggcattatttcttcttgcatctatgttcg<210>5<211>43<212>dna<213>反向內(nèi)引物bip<400>tagacaaatagccaaggaaagttgttgctccagcagtaccatc<210>6<211>24<212>dna<213>forwardprimer<400>atgtaaatacctacaacgggtgat<210>7<211>24<212>dna<213>reverseprimer<400>tatttgggcgccaaagcatgctcc當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12