本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工程，特別涉及與水稻白背飛虱抗性基因相連鎖的分子標(biāo)記及其獲得方法。

背景技術(shù)：

水稻白背飛虱(Sogatella furcifera,Horváth)是我國(guó)和東南亞水稻產(chǎn)區(qū)的主要害蟲之一，80年代以來(lái)，隨著我國(guó)高產(chǎn)雜交稻技術(shù)的推廣及可能與雜種優(yōu)勢(shì)有關(guān)的作物生理因素，白背飛虱已成為水稻主要害蟲。據(jù)中國(guó)農(nóng)業(yè)年鑒記載，在稻飛虱重發(fā)年份，受害面積超過(guò)我國(guó)水稻總面積的50％。1991年，我國(guó)發(fā)生的大范圍稻飛虱為害造成近16億公斤稻谷的損失，受害面積達(dá)2,933萬(wàn)hm²；2005年稻飛虱又大爆發(fā)，加之與稻縱卷葉螟的疊加效應(yīng)，稻飛虱為害達(dá)2.6億畝次以上。因此，對(duì)白背飛虱的防治已成為保障糧食生產(chǎn)的重要內(nèi)容。

大面積種植的主要水稻品種不帶抗性基因或抗性水平低，是白背飛虱爆發(fā)的內(nèi)在原因，加上化學(xué)肥料的大量施用，茂盛生長(zhǎng)的感蟲水稻為白背飛虱的快速繁殖提供了充足的食源。長(zhǎng)期以來(lái)，白背飛虱的防治主要是依靠施用化學(xué)殺蟲劑。然而，農(nóng)藥殺蟲劑的濫用，殺死了稻田中的稻飛虱天敵，反而誘發(fā)白背飛虱的再猖獗。另外，白背飛虱屬大范圍遷飛性害蟲，每年的水稻生長(zhǎng)季節(jié)，白背飛虱隨春夏暖濕氣流，由南往北逐代逐區(qū)遷入我國(guó)稻區(qū)。白背飛虱發(fā)生初期，若蟲的蟲體小，隱蔽性強(qiáng)，不易被農(nóng)民發(fā)現(xiàn)，防治不及時(shí)使其得以大量繁殖，蟲害便得以流行；蟲害爆發(fā)的水稻成熟灌漿期，稻株長(zhǎng)勢(shì)旺盛，將殺蟲劑施到稻株基部的操作非常困難，加上成蟲有很好的移動(dòng)性和較強(qiáng)的抗藥性，結(jié)果屢屢造成危害和減產(chǎn)。

水稻抗病蟲育種實(shí)踐證明，利用抗白背飛虱基因或培育聚合不同來(lái)源抗性基因的新品種是水稻白背飛虱綜合防治中最為經(jīng)濟(jì)有效的方法。栽種的水稻品種即使只帶有中等水平的抗性基因，也足以將白背飛虱的群體控制在造成危害的水平以下，不會(huì)導(dǎo)致白背飛虱大爆發(fā)、或?qū)嶋H危害及產(chǎn)量損失。

另一方面，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，使難以鑒定、易受環(huán)境影響的抗病蟲性狀采用分子輔助育種已成為可能，該技術(shù)不僅可在早代進(jìn)行準(zhǔn)確、穩(wěn)定的選擇，而且可克服分離單株的顯隱性和純雜合問(wèn)題，從而加速育種進(jìn)程，提高育種效率，但該技術(shù)的基礎(chǔ)是必須擁有優(yōu)良的目標(biāo)基因及與之緊密連鎖的分子標(biāo)記。

為實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，挖掘新的抗性基因，發(fā)展緊密連鎖的新標(biāo)記成為水稻抗白背飛虱分子育種的關(guān)鍵。最早對(duì)水稻白背飛虱抗性開展分子定位研究的是McCouch，首先應(yīng)用TN1(臺(tái)中本地1號(hào))/IR36近等基因系將Wbph1定位到兩個(gè)RFLP標(biāo)記RG146和RG445之間，但由于該RFLP標(biāo)記是多拷貝標(biāo)記，而難以用作選擇標(biāo)記；此后，Wbph2和Wbph6(t)也先后被定位，但它們的遺傳距離分別為25.6cM和21.2cM，實(shí)際應(yīng)用仍有很大困難。

2008100613306的發(fā)明《與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標(biāo)記及其開發(fā)方法》公開了與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標(biāo)記RM6917、AP4741；RM6917定位于水稻第6染色體上，其SSR分子標(biāo)記與抗蟲基因間的遺傳距離為2.6cM。AP4741也定位于水稻第6染色體上，其STS分子標(biāo)記與抗蟲基因間的遺傳距離為3.3cM。

2012100453977的發(fā)明《與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用》公開了一種與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標(biāo)記引物RM401、Wbsca1；RM401定位于水稻第4染色體上，其SSR分子標(biāo)記與抗蟲基因間的遺傳距離為5.3cM；Wbsca1也定位于水稻第4染色體上，其STS分子標(biāo)記與抗蟲基因間的遺傳距離為1.2cM。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標(biāo)記及其用途，本發(fā)明所得的分子標(biāo)記與白背飛虱抗性基因緊密連鎖，能用于水稻白背飛虱抗性輔助選擇育種。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標(biāo)記，以水稻作為物種，該分子標(biāo)記引物選自下列引物對(duì)，其中的核苷酸序列為5′→3′，

WBC2-12 正向：GCGAGGTCACGAGGACTATC

反向：TCTCGGAAGTCGAGGAACTG；

WBC2-20 正向：AACAATTTTTATCTGCGTCATACA

反向：TTCGTGATTTCCTTCCTAACC。

作為本發(fā)明的分子標(biāo)記的改進(jìn)：WBC2-12定位于水稻第2染色體上；WBC2-20也定位于水稻第2染色體上(圖1)。

本發(fā)明還提供了上述分子標(biāo)記的開發(fā)方法，包括以下步驟：

1)、以秈稻品種ZF802作為抗性基因供體親本與感蟲的近等基因系材料ZCJ進(jìn)行雜交，從而獲得作為雜交后代抗蟲性分析的單株；

2)、用CTAB(十六烷基三乙基溴化銨，Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)法提取水稻親本幼苗及雜交后代幼苗基因組DNA；

3)、采用SSR(簡(jiǎn)單重復(fù)序列，simple sequence repeat)和/或STS(序列標(biāo)簽位點(diǎn)sequence-tagged site)分子標(biāo)記方法進(jìn)行水稻白背飛虱抗性分子標(biāo)記的篩選；

4)、篩選出兩個(gè)STS分子標(biāo)記WBC2-12和WBC2-20。

與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標(biāo)記WBC2-12和WBC2-20，具體是用下述方法得到的：

1)、抗蟲基因供體親本來(lái)自中國(guó)水稻研究所種質(zhì)庫(kù)的秈稻品種ZF802，與感蟲的近等基因系材料ZCJ進(jìn)行雜交，抗、感蟲單株是通過(guò)雜交、回交和自交，獲得的抗、感蟲近等基因系用于配組和基因定位。

2)、用CTAB法提取水稻親本幼苗及雜交后代幼苗基因組DNA。

3)、采用SSR和STS分子標(biāo)記方法進(jìn)行水稻白背飛虱抗性分子標(biāo)記的篩選；

4)、篩選出兩個(gè)STS分子標(biāo)記WBC2-12和WBC2-20，經(jīng)連鎖分析，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)標(biāo)記與水稻抗白背飛虱基因相連鎖。

采用SSR和STS分子標(biāo)記進(jìn)行篩選與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標(biāo)記的方法具體是：

(1)、STS引物在雙親CJ06和TN1以及它們的雜交后代間DNA多態(tài)性分析：

用STS標(biāo)記技術(shù)篩選，首先對(duì)基因組已完成測(cè)序的日本晴(http://rgp.dna.affrc.go.jp)和93-11(http://www.rise.genomics.org.cn)的序列進(jìn)行序列比對(duì)，根據(jù)日本晴和93-11序列比對(duì)的結(jié)果設(shè)計(jì)合適的引物用于ZF802和ZCJ的多態(tài)性篩選，引物委托上海申能博彩公司合成，在PTC-225 PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：20ng/ul水稻基因組DNA 1ul,10×PCR Buffer 2.0ul,25mM MgCl₂ 2.0ul,2mM dNTP 2.0ul,10uM引物2.0ul,5U/ul Taq DNA聚合酶0.2ul，ddH₂O 11.8ul，總體系20ul。反應(yīng)程序：95℃變性5分鐘；94℃變性1分鐘，52℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，40個(gè)循環(huán)；72℃10分鐘；產(chǎn)物檢測(cè)：在含有0.5％ug/ul EB的4.0％的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并照相記錄結(jié)果。

(2)、分子標(biāo)記的連鎖分析

ZF802和近等基因系材料ZCJ及其后代的白背飛虱抗性鑒定在室內(nèi)進(jìn)行，于幼苗期以幼苗死亡率對(duì)雙親及后代分離群體進(jìn)行抗蟲性鑒定；分別提取抗蟲、感蟲單株的總DNA，用與前面同樣的反應(yīng)體系、篩選獲得的多態(tài)性引物及程序進(jìn)行單株的PCR擴(kuò)增，統(tǒng)計(jì)抗、感單株標(biāo)記帶的出現(xiàn)頻率和交換類型并計(jì)算交換值，用MapnakerEXP3.0b計(jì)算標(biāo)記與抗蟲基因之間的遺傳距離。

本發(fā)明還同時(shí)公開了上述分子標(biāo)記的用途：用于水稻白背飛虱抗性品種的鑒定和水稻抗蟲后代的輔助選擇育種。

在本發(fā)明中，近等基因系材料ZCJ的獲得方式為：

首先ZF802和春江06(CJ06)雜交獲得F1代植株，而后以ZF802為輪回親本，結(jié)合分子標(biāo)記WBC2-12和WBC2-20輔助選擇，在回交后代中選擇含CJ06帶型的單株繼續(xù)與ZF802回交，回交5次后再自交一次，將純合的帶CJ06目標(biāo)片段的單株命名為ZCJ。

本發(fā)明是用分子生物學(xué)方法從抗白背飛虱秈稻品種ZF802中篩選和尋找新的、而且穩(wěn)定存在與白背飛虱抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記及其方法，用于水稻白背飛虱抗性輔助選擇育種；由于研究所用的材料對(duì)白背飛虱表現(xiàn)抗蟲性，其對(duì)我國(guó)稻區(qū)的白背飛虱具有普遍的抗性。另外，根據(jù)所得分子標(biāo)記也有助于水稻抗白背飛虱新基因得克隆。

白背飛虱是危害水稻生產(chǎn)的主要蟲害，本發(fā)明是利用分子標(biāo)記方法得到兩個(gè)新的與白背飛虱抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。利用這種方法，不僅克服了常規(guī)育種方法所需時(shí)間周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，可以有目標(biāo)地將抗蟲基因在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)選擇獲得并有目的地進(jìn)行多個(gè)抗性基因的聚合，從而培育出具有穩(wěn)定抗性的水稻新品種。同時(shí)，也可利用這兩個(gè)白背飛虱抗性基因分子標(biāo)記，深入進(jìn)行抗白背飛虱基因的克隆并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析，這對(duì)于進(jìn)一步了解水稻抗白背飛虱的分子遺傳學(xué)機(jī)制有積極的意義。因此，本發(fā)明結(jié)果在水稻育種實(shí)踐及抗蟲理論研究上都有重要意義。其優(yōu)點(diǎn)具體歸納如下：

1)、本發(fā)明的與白背飛虱抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，是在對(duì)抗白背飛虱的秈稻ZF802及其抗性穩(wěn)定的雜交后代單株中獲得的新標(biāo)記，對(duì)水稻白背飛虱具有很強(qiáng)的抗性，而且穩(wěn)定存在，可用于水稻白背飛虱抗性品種的鑒定和水稻抗蟲后代的輔助選擇育種。

2)、本發(fā)明所用的材料不僅抗水稻白背飛虱，還有著一定的抗褐飛虱能力，具有普遍的抗蟲特性。因此，根據(jù)所得的分子標(biāo)記有望克隆到新的白背飛虱抗性基因。

3)、為克隆水稻白背飛虱抗性基因、基因序列分析以及轉(zhuǎn)抗白背飛虱基因水稻研究奠定了良好基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

圖1是STS分子標(biāo)記WBC2-12和WBC2-20與抗蟲基因WBPH2間的遺傳距離示意圖；

圖2是檢測(cè)分子標(biāo)記WBC2-12與抗蟲性連鎖的分子標(biāo)記的電泳譜帶圖；

圖3是檢測(cè)分子標(biāo)記WBC2-20與抗蟲性連鎖的分子標(biāo)記的電泳譜帶圖；

圖4是分子標(biāo)記WBC2-12鑒定水稻品種白背飛虱抗性的電泳譜帶圖；

圖5是分子標(biāo)記WBC2-12輔助篩選獲得的3份抗蟲育種材料的電泳譜帶圖；

圖6是分子標(biāo)記WBC2-20鑒定水稻品種白背飛虱抗性的電泳譜帶圖；

圖7是分子標(biāo)記WBC2-20輔助篩選獲得的3份抗蟲育種材料的電泳譜帶圖；

對(duì)上述圖1～7中符號(hào)分別作如下說(shuō)明：

1代表：感蟲等近基因系材料ZCJ；

2代表：抗蟲親本ZF802；

3代表：ZF802/ZCJ的F1植株；

4,5,6均代表：ZF802和ZCJ雜交后代的抗蟲單株，此抗蟲單株是通過(guò)雜交后并自交，經(jīng)分子標(biāo)記篩選后獲得；

S代表：不帶抗白背飛虱基因的雜交后代的感蟲單株；

P1～P5分別指抗蟲水稻材料：蜀恢527、揚(yáng)輻秈5號(hào)、湘矮早9號(hào)、浙733、二九青；P6～P10分別指感蟲水稻材料：空育131、鄂晚5號(hào)、北陸129、蘇御糯、東農(nóng)416。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。

實(shí)施例1、用STS分子標(biāo)記獲得與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標(biāo)記WBC2-12：

具體做法是：抗蟲基因供體親本來(lái)自中國(guó)水稻研究所種質(zhì)庫(kù)的秈稻品種ZF802，與感蟲品種近等基因系材料ZCJ進(jìn)行雜交，自交獲得F2分離群體，從該群體后代中鑒定得到70株隱性個(gè)體(即，表現(xiàn)為感蟲的個(gè)體)用于連鎖關(guān)系分析。

一、提取DNA

1)、配制DNA提取緩沖液：

按順序依次加1體積的DNA提取溶液(0.35M sorbitol；0.1M Tris,pH8.2；0.005M EDTA；其余為水)，1體積的核裂解液(0.2M Tris,pH7.5；0.05M EDTA；2M NaCl；0.055M CTAB；其余為水)和0.4體積的5％(質(zhì)量濃度)sarkosyl溶液(即十二酰-N-甲基甘氨酸鈉的水溶液)；最后加入亞硫酸氫鈉，配制成DNA提取緩沖液；亞硫酸氫鈉在DNA提取緩沖液中的終濃度為0.02M。

2)、對(duì)上述ZF802、ZCJ和70株抗蟲隱性個(gè)體的水稻葉片分別進(jìn)行如下處理：

①、稱取0.1g的水稻葉片用液氮研磨成粉狀，然后加入700μl的上述步驟1)配制的DNA提取緩沖液，65℃水浴40分鐘。再加700μl的氯仿:異戊醇(24:1的體積比)，并混勻。10,000rpm離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中。

②、在上述步驟①離心后所得的上清液中加2/3～1倍體積預(yù)冷的異丙醇，輕輕混勻至DNA沉淀。13,000rpm離心8分鐘，倒出上清液。

③、再用70％(體積濃度)的已醇200μl洗滌上述步驟②所得的DNA沉淀物。

④、將上述洗滌后的DNA涼干并溶于100μl TE緩沖液或純水中。

⑤、紫外分光光度法檢測(cè)上述步驟④所得的DNA樣品的濃度，0.7％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性。

完整合適的DNA用于PCR擴(kuò)增，不完整的DNA則重新提取，直至獲得完整的DNA。

二、STS分析：

STS引物設(shè)計(jì)根據(jù)日本晴和93-11序列比對(duì)的結(jié)果設(shè)計(jì)合適的引物用于ZF802和ZCJ的多態(tài)性篩選，委托上海申能博彩公司合成設(shè)計(jì)的STS引物2對(duì)，具體如表1所示：

表1.合成的2對(duì)STS引物序列

1、PCR擴(kuò)增

(1)、反應(yīng)體系：

水稻基因組DNA 20ng/ul 1ul，10×PCR Buffer 2.0ul，25mM MgCl₂ 2.0ul，2mM dNTP 2.0ul，10uM引物2.0ul，5U/ul Taq DNA聚合酶0.2ul，ddH₂O 10.8ul，總體系20ul。

(2)、反應(yīng)程序：

95℃變性5分鐘；94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，40個(gè)循環(huán)；72℃補(bǔ)齊10分鐘。

2、電泳檢測(cè)

取擴(kuò)增產(chǎn)物20ul，用4.0％的瓊脂糖凝膠(含有0.5％ug/ul EB)電泳，紫外燈下觀察并照相記錄結(jié)果。

我們利用2對(duì)STS引物對(duì)ZF802和ZCJ進(jìn)行多態(tài)性分析，其中有1對(duì)引物在雙親間表現(xiàn)出多態(tài)性。進(jìn)一步用這對(duì)引物對(duì)ZF802、ZCJ和其雜交后代單株進(jìn)行STS分析，發(fā)現(xiàn)STS引物WBC2-12在所有感蟲的雜交后代單株中均帶有感蟲材料ZCJ一樣的帶型。說(shuō)明STS引物WBC2-12與水稻抗白背飛虱特性存在聯(lián)系。

WBC2-12引物序列為：左翼5’-GCG AGG TCA CGA GGA CTA TC-3’，右翼5’-TCT CGG AAG TCG AGG AAC TG-3’，定位于水稻第2染色體上。

而引物WBC2-10的表現(xiàn)結(jié)果為：在雙親間不具有多態(tài)性。

引物WBC2-12PCR擴(kuò)增所得的分子標(biāo)記WBC2-12在ZF802中的序列為：GCGAGGTCACGAGGACTATCTTCTATGGTGTTACTCGTATCGGTATCAGAACTGTTGTTATGTGTTTTAATTTTTCATTGCTATGTGCTCAGCAGTTCCTCGACTTCCGAGA；

引物WBC2-12PCR擴(kuò)增所得的分子標(biāo)記WBC2-12在ZCJ中的序列為：GCGAGGTCACGAGGACTATCTTCTATGGTGTTACTGGTATCGGTATCAGAACTACCGTCTATTGTGTTACTGGTATCGGTATCAGAACTGTTGTTATGTGTTTAATTTTTCATTGCTATGTGCTCAGCAGTTCCTCGACTTCCGAGA。

三、STS分子標(biāo)記WBC2-12的連鎖性鑒定

ZF802和近等基因系材料ZCJ及其后代的白背飛虱抗性鑒定在室內(nèi)進(jìn)行，于幼苗期以幼苗死亡率對(duì)雙親及后代分離群體進(jìn)行抗蟲性鑒定；提取隱性的感蟲單株的總DNA，用與前面同樣的反應(yīng)體系及程序，用引物WBC2-12進(jìn)行單株的PCR擴(kuò)增，統(tǒng)計(jì)抗、感單株標(biāo)記帶的出現(xiàn)頻率和交換類型并計(jì)算交換值，用MapnakerEXP3.0b計(jì)算標(biāo)記與抗蟲基因之間的遺傳距離。以WBC2-12對(duì)雜交后代群體70個(gè)單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，70個(gè)單株中有65單株的帶型與感蟲材料(隱性親本)ZCJ一樣，有5株的帶型同時(shí)帶有雙親的帶型，沒(méi)發(fā)現(xiàn)與抗蟲親本ZF802帶型一樣的單株。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：STS分子標(biāo)記WBC2-12與水稻的白背飛虱抗性緊密連鎖的，但在感蟲單株中仍有一定的交換，如圖2所示，出現(xiàn)雙親帶型的單株表明發(fā)生了交換。經(jīng)計(jì)算，其重組率為3.6％，STS分子標(biāo)記與抗蟲基因間的遺傳距離為3.6cM。

實(shí)施例2：用STS分子標(biāo)記獲得與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標(biāo)記WBC2-20：

植物材料同實(shí)施例1，具體做法如下：

一、提取DNA：

同實(shí)施例1。

二、STS分析：

STS引物設(shè)計(jì)根據(jù)日本晴和93-11序列比對(duì)的結(jié)果設(shè)計(jì)合適的引物用于ZF802和ZCJ的多態(tài)性篩選，委托上海申能博彩公司合成設(shè)計(jì)的STS引物3對(duì)，具體如表2所示：

表2.合成的3對(duì)STS引物序列

1、PCR擴(kuò)增

(1)、反應(yīng)體系為：

水稻基因組DNA 20ng/ul 1ul，10×PCR Buffer 2.0ul，25mM MgCl₂ 2.0ul，2mM dNTP 2.0ul，10uM引物2.0ul，5U/ul Taq DNA聚合酶0.2ul，ddH₂O 10.8ul，總體系20ul。

(2)、反應(yīng)程序：

95℃變性5分鐘；94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，40個(gè)循環(huán)；72℃補(bǔ)齊10分鐘。

2、電泳檢測(cè)

取擴(kuò)增產(chǎn)物20ul，用4.0％的瓊脂糖凝膠(含有0.5％ug/ul EB)電泳，紫外燈下觀察并照相記錄結(jié)果。

我們利用3對(duì)STS引物對(duì)ZF802和ZCJ進(jìn)行多態(tài)性分析，其中有1對(duì)引物在雙親間表現(xiàn)出多態(tài)性。進(jìn)一步用這對(duì)引物對(duì)ZF802、ZCJ和其雜交后代單株進(jìn)行STS分析，發(fā)現(xiàn)STS引物WBC2-20在所有感蟲的雜交后代單株中均帶有感蟲親本ZCJ一樣的帶型。說(shuō)明STS引物WBC2-20與水稻抗白背飛虱特性存在聯(lián)系。

WBC2-20引物序列為：左翼5’-AAC AAT TTT TAT CTG CGT CAT ACA-3’，右翼5’-TTC GTG ATT TCC TTC CTA ACC-3’，定位于水稻第2染色體上。

而引物WBC2-19、WBC2-22的表現(xiàn)結(jié)果為：在雙親間不具有多態(tài)性。

引物WBC2-20 PCR擴(kuò)增所得的分子標(biāo)記WBC2-20在ZF802中的序列為：AACAATTTTTATCTGCGTCATACATATAAGATTTATTATTTTTGTTTCTCTAGTTATAGATCAAATATAGGTCCCGTTTCCGTTTAGTTCCTCAAAAGTTTTTCCCAAAAACATCACATTGAATCTTTGGACATATGCATGAAACGTTAAATATAGATTAAAAGAAAAACTAATTACACGGTTAGGAAGGAAATCACGAA；

引物WBC2-20 PCR擴(kuò)增所得的分子標(biāo)記WBC2-20在ZCJ中的序列為：AACAATTTTTATCTGCGTCATACATATAAGATTTATTATTTTTGTTTCTCTACATTGAATCTTTGGACACATGCATGAAGCGTTAAATATAGATTAAAAGAAAAACTAATTGCACGGTTAGGAAGGAAATCACGAA。

三、STS分子標(biāo)記WBC2-20的連鎖性鑒定

ZF802和ZCJ雙親及其后代的白背飛虱抗性鑒定在室內(nèi)進(jìn)行，于幼苗期以幼苗死亡率對(duì)雙親及后代分離群體進(jìn)行抗蟲性鑒定；提取隱性的抗蟲單株的總DNA，用與前面同樣的反應(yīng)體系及程序，用引物WBC2-20進(jìn)行單株的PCR擴(kuò)增，統(tǒng)計(jì)抗、感單株標(biāo)記帶的出現(xiàn)頻率和交換類型并計(jì)算交換值，用MapnakerEXP3.0b計(jì)算標(biāo)記與抗蟲基因之間的遺傳距離。以WBC2-20對(duì)雜交后代群體70個(gè)單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，70個(gè)感蟲單株中有67個(gè)單株的帶型與感蟲材料ZCJ一樣，有3個(gè)單株的帶型同時(shí)帶有雙親的帶型，沒(méi)發(fā)現(xiàn)與抗蟲親本ZF802帶型一樣的單株。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：STS分子標(biāo)記WBC2-20與水稻的白背飛虱抗性緊密連鎖的，但在抗蟲單株中仍有一定的交換，如圖3示，出現(xiàn)雙親帶型的單株表明發(fā)生了交換。經(jīng)計(jì)算，其重組率為2.1％，STS分子標(biāo)記與抗蟲基因間的遺傳距離為2.1cM。

實(shí)施例3、利用WBC2-12進(jìn)行水稻白背飛虱抗性品種的鑒定

具體做法是：從中國(guó)水稻研究所種質(zhì)資源庫(kù)中選取已知白背飛虱抗性的水稻材料各5份，抗蟲材料為：蜀恢527、揚(yáng)輻秈5號(hào)、湘矮早9號(hào)、浙733、二九青；感蟲材料為：空育131、鄂晚5號(hào)、北陸129、蘇御糯、東農(nóng)416，利用STS引物WBC2-12鑒定其白背飛虱抗性。

一、提取DNA

同實(shí)施例1。

二、STS分析

同實(shí)施例1。

三、STS分子標(biāo)記WBC2-12與水稻品種的白背飛虱抗性

結(jié)果如圖4所示，5份抗蟲材料的帶型與抗蟲對(duì)照(ZF802)一樣，而5份感蟲材料的帶型則與感蟲對(duì)照(ZCJ)一致。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：STS分子標(biāo)記WBC2-12可以用于水稻白背飛虱的抗性篩選。

實(shí)施例4、利用WBC2-12進(jìn)行水稻抗蟲后代的輔助選擇育種：

具體做法是：抗蟲基因供體親本來(lái)自中國(guó)水稻研究所種質(zhì)庫(kù)的秈稻品種ZF802，與感蟲近等基因系材料ZCJ進(jìn)行雜交，自交獲得F2分離群體，用分子標(biāo)記WBC2-12對(duì)分離群體進(jìn)行分析，選擇F2分離群體中帶型與抗蟲親本ZF802帶型一致的單株用于育種改良。

一、提取DNA

同實(shí)施例1。

二、STS分析

同實(shí)施例1。

三、STS分子標(biāo)記WBC2-12進(jìn)行水稻抗蟲后代的輔助選擇

抗蟲基因供體秈稻品種ZF802與感蟲近等基因系ZCJ進(jìn)行雜交，自交獲得F2分離群體，用STS分子標(biāo)記WBC2-12對(duì)F2分離群體中的各個(gè)單株進(jìn)行基因型分析，選擇帶型與抗蟲親本ZF802帶型一致的3個(gè)單株進(jìn)一步用于育種改良(圖5)，淘汰帶型與感蟲材料ZCJ帶型一致和雜合帶型(同時(shí)具有ZF802和ZCJ帶型)的個(gè)體，抗蟲性分析表明，所選擇的帶ZF802帶型的3個(gè)單株均表現(xiàn)抗水稻白背飛虱。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：SSR分子標(biāo)記WBC2-12可以用于水稻白背飛虱抗蟲后代的輔助選擇育種。

實(shí)施例5、利用WBC2-20進(jìn)行水稻白背飛虱抗性品種的鑒定：

具體做法是：從中國(guó)水稻研究所種質(zhì)資源庫(kù)中選取已知白背飛虱抗性的水稻材料各5份，抗蟲材料為：蜀恢527、揚(yáng)輻秈5號(hào)、湘矮早9號(hào)、浙733、二九青；感蟲材料為：空育131、鄂晚5號(hào)、北陸129、蘇御糯、東農(nóng)416，利用STS引物WBC2-20鑒定其白背飛虱抗性。

一、提取DNA

同實(shí)施例1。

二、STS分析

同實(shí)施例2。

三、STS分子標(biāo)記WBC2-20與水稻品種的白背飛虱抗性

結(jié)果如圖6所示，5份抗蟲材料的帶型與抗蟲對(duì)照(ZF802)一樣，而5份感蟲材料的帶型則與感蟲對(duì)照(ZCJ)一致。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：STS分子標(biāo)記WBC2-20可以用于水稻白背飛虱的抗性篩選。

實(shí)施例6、利用WBC2-20進(jìn)行水稻抗蟲后代的輔助選擇育種：

具體做法是：抗蟲基因供體親本來(lái)自中國(guó)水稻研究所種質(zhì)庫(kù)的秈稻品種ZF802，與感蟲近等基因系材料ZCJ進(jìn)行雜交，自交獲得F2分離群體，用分子標(biāo)記WBC2-20對(duì)分離群體進(jìn)行分析，選擇F2分離群體中帶型與抗蟲親本ZF802帶型一致的單株用于育種改良。

一、提取DNA

同實(shí)施例1。

二、STS分析

同實(shí)施例2。

三、STS分子標(biāo)記WBC2-20進(jìn)行水稻抗蟲后代的輔助選擇

抗蟲基因供體秈稻品種ZF802與感蟲近等基因系ZCJ進(jìn)行雜交，自交獲得F2分離群體，用STS分子標(biāo)記WBC2-20對(duì)F2分離群體中的各個(gè)單株進(jìn)行基因型分析，選擇帶型與抗蟲親本ZF802帶型一致的3個(gè)單株進(jìn)一步用于育種改良(圖7)，淘汰帶型與感蟲材料ZCJ帶型一致和雜合帶型(同時(shí)具有ZF802和ZCJ帶型)的個(gè)體，抗蟲性分析表明，所選擇的帶ZF802帶型的3個(gè)單株均表現(xiàn)抗水稻白背飛虱。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：SSR分子標(biāo)記WBC2-20可以用于水稻白背飛虱抗蟲后代的輔助選擇育種。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。

<110> 中國(guó)水稻研究所

<120> 抗水稻白背飛虱基因WBPH2的分子標(biāo)記及應(yīng)用

<160> 4

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> WBC2-12正向引物

<400> 1

gcgaggtcac gaggactatc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> WBC2-12反向引物

<400> 2

tctcggaagt cgaggaactg 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> WBC2-20正向引物

<400> 3

aacaattttt atctgcgtca taca 24

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> WBC2-20正向引物

<400> 4

ttcgtgattt ccttcctaac c 21