本發(fā)明涉及萘醌磷酰胺類化合物及其在作為細(xì)胞鐵死亡誘導(dǎo)劑中的用途。此外，本發(fā)明還涉及用此種化合物以及藥物組合物通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡在疾病的治療中的用途。
背景技術(shù)：
：鐵死亡(ferroptosis)是2012年dixo等[dixonsj,lembergkm,lamprechtmr,etal.ferroptosis:aniron-dependentformofnonapoptoticcelldeath.cell,2012,149(5):1060-1072]新提出的一種由鐵依賴的氧化損傷引起的細(xì)胞死亡模式，在形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和遺傳學(xué)等方面與凋亡、壞死和自噬有較大區(qū)別。凋亡典型的特征包括細(xì)胞皺縮、核濃縮、染色質(zhì)邊集、dna降解、膜起泡、核和胞漿斷裂成凋亡小體，后被鄰近的細(xì)胞吞噬和降解。壞死的形態(tài)學(xué)特征是細(xì)胞和細(xì)胞器腫脹、膜破裂、核染色體溶解而不是固縮，線粒體受損，隨后細(xì)胞溶解。自噬典型的特征為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量泡狀結(jié)構(gòu)，即雙層膜結(jié)構(gòu)的自吞噬泡，吞噬泡內(nèi)為胞質(zhì)及細(xì)胞器，高爾基器、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等均先于核的改變而被降解，但細(xì)胞骨架成分卻大部分保存。而鐵死亡的特征為線粒體嵴消失及膜密度增加，同時(shí)表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)以及脂質(zhì)活性氧自由基增多。鐵死亡主要是由鐵依賴的氧化損傷引起，涉及一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)、基因表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)。dixon等最早發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞死亡模式與小分子誘導(dǎo)的ras腫瘤細(xì)胞死亡有關(guān)。新的研究(friedmannaj,schneiderm,etal.inactivationoftheferroptosisregulatorgpx4triggersacuterenalfailureinmice,natcellbiol.2014,16(12):1180-91.)指出鐵死亡通路還與許多病理過(guò)程有關(guān)，包括神經(jīng)退行性疾病、腎功能衰竭、心血管疾病和糖尿病等。而鐵死亡誘導(dǎo)劑的發(fā)現(xiàn)對(duì)深入研究鐵死亡通路的生化機(jī)制，探討其在不同疾病模型中的作用，對(duì)相關(guān)疾病治療靶點(diǎn)的確證以及治療藥物的研究具有重要意義。目前已發(fā)現(xiàn)的鐵死亡誘導(dǎo)劑較少，主要包括以下兩類(caojy,dixonsj,mechanismsofferroptosis,cellmollifesci.2016,73(11-12):2195-209.)，a類抑制胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體(systemxc-)，b類抑制谷胱甘肽過(guò)氧化酶4(gpx4)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種新型鐵死亡誘導(dǎo)劑-萘醌磷酰胺類化合物，此類化合物誘導(dǎo)鐵依賴的細(xì)胞死亡方式，表現(xiàn)為活性氧增多，線粒體嵴消失及膜密度增加，同時(shí)發(fā)明人在動(dòng)物體內(nèi)也證實(shí)了此類化合物誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一類新型鐵死亡誘導(dǎo)劑-萘醌磷酰胺類化合物，以及這些化合物作為細(xì)胞鐵死亡誘導(dǎo)劑在疾病治療中的用途。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：本發(fā)明的一種具有通式i的化合物及其溶劑化物、鹽、復(fù)合物、同質(zhì)多形體、晶型、外消旋混合物、非對(duì)映體、對(duì)映非對(duì)映體、互變非對(duì)映體、同位素標(biāo)記形式、前藥及其組合：其中，n為1-3的整數(shù)；r1為氫，c1-4烷基、c1-4烷氧基、鹵素、c1-4鹵代烷基、羥基、氰基、巰基、硝基或氨基；r2和r3滿足下述兩種情形之一：(1)r2和r3各自獨(dú)立地選自氫、烷基、鹵代烷基、環(huán)烷基、烯基、炔基和芳基所組成的組；或者(2)r2和r3連同二者所連接的n原子共同形成5-6元雜環(huán)，所述5-6元雜環(huán)選自嗎啉基、硫嗎啉基、噻唑烷基、噁唑基、異噁唑基、咪唑烷基、哌啶基、吡咯烷基；所述雜環(huán)任選被一個(gè)或多個(gè)取代基取代，所述取代基各自獨(dú)立地選自由烷基、烯基、炔基和苯基所組成的組；r4為氫，c1-4烷基、c1-4烷氧基、鹵素、c1-4鹵代烷基、羥基、氰基、巰基、硝基或氨基。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，通式i中：n為1；r1為氫，甲基或鹵素；r2和r3為滿足下述兩種情形之一，(1)r2和r3各自獨(dú)立地選自烷基、鹵代烷基，或者(2)r2和r3連同二者所連接的n原子共同形成嗎啉基、硫嗎啉基、噻唑烷基、噁唑基、異噁唑基、咪唑烷基、哌啶基、吡咯烷基；r4為氫、c1-4烷基、c1-4烷氧基、鹵素或羥基。更優(yōu)選的，所述的具有通式i的化合物及其溶劑化物、鹽、復(fù)合物、同質(zhì)多形體、晶型、外消旋混合物、非對(duì)映體、對(duì)映非對(duì)映體、互變非對(duì)映體、同位素標(biāo)記形式、前藥及其組合選自于由下述化合物所組成的組：氨基-n,n-二正丙基氨基磷酸-2-(1,4萘醌)甲酯、氨基-n,n-二-(2-氯乙基)氨基磷酸-2-(3-甲基-1,4-萘醌)甲酯、氨基-n,n-二正丙基氨基磷酸-2-(3-甲基-1,4-萘醌)甲酯、氨基-n,n-二-(2-溴乙基)氨基磷酸-2-(1,4-萘醌)甲酯、氨基嗎啉基磷酸-2-(1,4萘醌)甲酯、氨基-n,n-二-(2-氯乙基)氨基磷酸-2-(3-溴-1,4-萘醌)甲酯、氨基-n,n-二-(2-氯乙基)氨基磷酸-2-(3-甲巰基-1,4-萘醌)甲酯、氨基-n,n-二甲氨基磷酸-2-(1,4萘醌)甲酯、氨基-n-甲基哌嗪基磷酸-2-(1,4萘醌)甲酯、氨基-n,n-二正丙基氨基磷酸-2-(7-甲基-1,4萘醌)甲酯，及其溶劑化物、鹽、復(fù)合物、同質(zhì)多形體、晶型、外消旋混合物、非對(duì)映體、對(duì)映非對(duì)映體、互變非對(duì)映體、同位素標(biāo)記形式、前藥及其組合。進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的具有通式i的化合物及其溶劑化物、鹽、復(fù)合物、同質(zhì)多形體、晶型、外消旋混合物、非對(duì)映體、對(duì)映非對(duì)映體、互變非對(duì)映體、同位素標(biāo)記形式、前藥及其組合在制備調(diào)節(jié)細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化藥物中的應(yīng)用。所述的具有通式i的化合物及其溶劑化物、鹽、復(fù)合物、同質(zhì)多形體、晶型、外消旋混合物、非對(duì)映體、對(duì)映非對(duì)映體、互變非對(duì)映體、同位素標(biāo)記形式、前藥及其組合在制備誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體損傷藥物中的應(yīng)用。所述的具有通式i的化合物及其溶劑化物、鹽、復(fù)合物、同質(zhì)多形體、晶型、外消旋混合物、非對(duì)映體、對(duì)映非對(duì)映體、互變非對(duì)映體、同位素標(biāo)記形式、前藥及其組合在制備鐵死亡誘導(dǎo)劑中的應(yīng)用。以及具有通式i的化合物及其溶劑化物、鹽、復(fù)合物、同質(zhì)多形體、晶型、外消旋混合物、非對(duì)映體、對(duì)映非對(duì)映體、互變非對(duì)映體、同位素標(biāo)記形式、前藥及其組合在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。綜上，本發(fā)明提出了一種新的鐵死亡的誘導(dǎo)劑，該誘導(dǎo)劑能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，進(jìn)而達(dá)到抑制細(xì)胞，特別是腫瘤細(xì)胞增殖的目的，本發(fā)明的提出為腫瘤疾病的治療提供了一種新的技術(shù)手段。附圖說(shuō)明圖1為加入化合物1或化合物1+鐵鰲合劑dfx作用6小時(shí)以及12小時(shí)后顯微鏡下觀察的細(xì)胞狀態(tài)；圖2為加入化合物1或化合物1+鐵鰲合劑dfx作用6小時(shí)后加入二氫乙啶(dhe)的顯微鏡下觀察的細(xì)胞狀態(tài)；圖3為化合物1對(duì)線粒體形態(tài)的影響；圖4為對(duì)照組和給藥組小鼠的ptgs2mrna水平測(cè)定結(jié)果；圖5為對(duì)照組和給藥組小鼠的腫瘤大小。具體實(shí)施方式為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它們僅用來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1：氨基-n,n-二正丙基氨基磷酸-2-(1,4萘醌)甲酯(1)的制備反應(yīng)條件：(a)pocl3,net3,ch2cl2,0℃-rt；(b)ch3i,k2co3,丙酮,回流；(c)liaih4,thf,回流；(d)lin(tms)2,,nh3,thf,-78℃至-20℃；(e)ce(nh4)2(no3)6,ch3cn,h2o,rt.按照以上路線合成得到目標(biāo)化合物，該目標(biāo)化合物為黃色固體。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.11(m,2h,arh),7.77(m,2h,arh),7.06(s,1h,ch＝c-o),4.99(m,2h,ch2o),3.07(m,4h,2ch2ch2ch3),2.74(bs,2h,nh2),1.58(m,4h,2ch2ch2ch3),0.91(m,6h,2ch2ch2ch3)。實(shí)施例2：氨基-n,n-二-(2-氯乙基)氨基磷酸-2-(3-甲基-1,4-萘醌)甲酯(2)的制備該目標(biāo)化合物以1,4-二羥基-3-甲基-2-萘甲酸為原料，參照實(shí)施例1方法制備，得到黃色固體。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.11(m,2h,arh),7.76(m,2h,arh),5.06(m,2h,ch2o),3.66(t,4h,2ch2ch2cl),3.47(dt,4h,2ch2ch2cl),3.02(bs,2h,nh2)，2.34(s,3h)。實(shí)施例3：氨基-n,n-二正丙基氨基磷酸-2-(3-甲基-1,4-萘醌)甲酯(3)的制備該目標(biāo)化合物以1,4-二羥基-3-甲基-2-萘甲酸為原料，參照實(shí)施例1方法制備，得到白色固體。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.13(m,2h,arh),7.76(m,2h,arh),5.03(m,2h,ch2o),3.02(m,4h,2ch2ch2ch3),2.77(bs,2h,nh2),2.35(s,3h,c＝cch3),1.56(m,4h,2ch2ch2ch3),0.89(m,6h,2ch2ch2ch3)。實(shí)施例4:氨基-n,n-二-(2-溴乙基)氨基磷酸-2-(1,4-萘醌)甲酯(4)的制備該目標(biāo)化合物以1,4-二羥基-2-萘甲酸為原料，參照實(shí)施例1方法制備，得到黃色固體。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.10(m,2h,arh),7.77(m,2h,arh),7.03(t,1h,ch＝c-o),5.05(m,2h,ch2o),3.55(m,8h,2ch2ch2cl),2.98(bs,2h,nh2)。實(shí)施例5:氨基嗎啉基磷酸-2-(1,4萘醌)甲酯(5)的制備該目標(biāo)化合物以1,4-二羥基-2-萘甲酸為原料，參照實(shí)施例1方法制備，得到褐色固體。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.08(m,2h,arh),7.78(m,2h,arh),7.03(t,1h,ch＝c-o),5.01(m,2h,ch2o),3.68(t,4h,2ch2ch2o),3.23(dt,4h,2ch2ch2o),2.89(bs,2h,nh2)。實(shí)施例6:氨基-n,n-二-(2-氯乙基)氨基磷酸-2-(3-溴-1,4-萘醌)甲酯(6)的制備該目標(biāo)化合物以1,4-二羥基-3-溴-2-萘甲酸為原料，參照實(shí)施例1方法制備，得到黃色固體。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.18(m,2h,arh),7.80(m,2h,arh),5.21(m,2h,ch2o),3.66(t,4h,2ch2ch2cl),3.48(dt,4h,2ch2ch2cl),2.97(bs,2h,nh2)。實(shí)施例7：氨基-n,n-二-(2-氯乙基)氨基磷酸-2-(3-甲巰基-1,4-萘醌)甲酯(7)的制備該目標(biāo)化合物以1,4-二羥基-3-甲巰基-2-萘甲酸為原料，參照實(shí)施例1方法制備，得到黃色油狀物。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.10(m,2h,arh),7.75(m,2h,arh),5.21(m,2h,ch2o),3.66(t,4h,2ch2ch2cl),3.46(dt,4h,2ch2ch2cl),2.97(bs,2h,nh2)，2.74(s,3h，ch3s)。實(shí)施例8：氨基-n,n-二甲氨基磷酸-2-(1,4萘醌)甲酯(8)的制備該目標(biāo)化合物以1,4-二羥基-2-萘甲酸為原料，參照實(shí)施例1方法制備，得到黃色固體。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.01(m,2h,arh),7.73(m,2h,arh),7.04(t,1h,ch＝c-o),5.20(m,2h,ch2o),2.96(bs,2h,nh2)，2.82(s,6h，2nch3)。實(shí)施例9:氨基-n-甲基哌嗪基磷酸-2-(1,4萘醌)甲酯(9)的制備該目標(biāo)化合物以1,4-二羥基-2-萘甲酸為原料，參照實(shí)施例1方法制備，得到黃色固體。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.07(m,2h,arh),7.80(m,2h,arh),7.01(t,1h,ch＝c-o),5.03(m,2h,ch2o),3.38(t,4h,2ch2ch2n),3.05(dt,4h,2ch2ch2n),2.89(bs,2h,nh2)，2.73(s，3h，nch3)。實(shí)施例10:氨基-n,n-二正丙基氨基磷酸-2-(7-甲基-1,4萘醌)甲酯(11)的制備該目標(biāo)化合物以1,4-二羥基-7-甲基-2-萘甲酸為原料，參照實(shí)施例1方法制備，得到黃色固體。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.57-8.01(m,3h,arh),7.02(s,1h,ch＝c-o),4.99(m,2h,ch2o),3.12(m,4h,2ch2ch2ch3),2.77(s，3h，ch3)，2.70(bs,2h,nh2),1.56(m,4h,2ch2ch2ch3),0.92(m,6h,2ch2ch2ch3)。實(shí)施例11：對(duì)所合成通式i類化合物進(jìn)行細(xì)胞毒作用評(píng)價(jià)1)實(shí)驗(yàn)方法：細(xì)胞株：hct116結(jié)腸癌細(xì)胞篩選方法：mtt法作用時(shí)間：48h2)結(jié)果細(xì)胞毒測(cè)試結(jié)果如下表1所示。表1：細(xì)胞毒測(cè)試結(jié)果(10μm化合物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率)化合物編號(hào)抑制率化合物編號(hào)抑制率189.5％699.2％280.7％796.1％356.6％890.8％492.3％978.3％570.4％1088.1％由以上數(shù)據(jù)可以看出，通式i化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞具有顯著的殺傷作用。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)這種殺傷作用與化合物誘導(dǎo)鐵死亡相關(guān)。實(shí)施例12：化合物1誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡方式具有鐵依賴性1)實(shí)驗(yàn)方法：將5×105個(gè)hct116細(xì)胞/孔鋪于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80％，分兩組，第一組加入化合物1(10μm)，第二組加入化合物1(10μm)同時(shí)加入鐵鰲合劑dfx(100μm)。作用6小時(shí)以及12小時(shí)后顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：加入化合物1或化合物1+鐵鰲合劑dfx作用6小時(shí)以及12小時(shí)后顯微鏡下觀察的細(xì)胞狀態(tài)如圖1所示。由圖1可知，鐵鰲合劑的加入可以抑制化合物1對(duì)hct116腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，說(shuō)明化合物1誘導(dǎo)的死亡方式具有鐵依賴性。實(shí)施例13：化合物1誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡方式與氧自由基ros積累有關(guān)1)實(shí)驗(yàn)方法：將5×105個(gè)hct116細(xì)胞/孔鋪于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80％，分兩組，第一組加入化合物1(10μm)，第二組加入化合物1(10μm)同時(shí)加入鐵鰲合劑dfx(100μm)。作用6小時(shí)后，加入二氫乙啶(dhe)，dhe可以被細(xì)胞內(nèi)ros氧化為氧化乙啶插入dna中產(chǎn)生紅色熒光，熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)ros的量正相關(guān)。染色30分鐘后，pbs漂洗兩次，每次5分鐘去除背景后熒光顯微鏡下觀察。2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：加入化合物1或化合物1+鐵鰲合劑dfx作用6小時(shí)后加入二氫乙啶(dhe)的顯微鏡下觀察的細(xì)胞狀態(tài)如圖2所示。由圖2可知，化合物1促進(jìn)了細(xì)胞氧自由基ros的積累，而dfx的加入可抑制化合物1誘導(dǎo)的ros積累，說(shuō)明化合物1誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡方式與氧自由基ros積累有關(guān)。實(shí)施例14：化合物1誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體嵴消失及膜密度增加1)實(shí)驗(yàn)方法：將5×105個(gè)hct116細(xì)胞/孔鋪于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80％，分兩組，第一組加入溶劑dmso，第二組加入化合物1(10μm)。作用8小時(shí)后收取細(xì)胞pbs洗兩次，加入戊二醛細(xì)胞固定液固定過(guò)夜后切片，透射電鏡觀察。2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：化合物1對(duì)線粒體形態(tài)的影響如圖3所示。由圖3的透射電鏡結(jié)果可以看出，化合物1使細(xì)胞線粒體嵴消失且線粒體雙層膜密度增加。綜合以上化合物1誘導(dǎo)hct116細(xì)胞發(fā)生的死亡在形態(tài)及生化基礎(chǔ)上都與鐵死亡完全吻合。實(shí)施例15：化合物1誘導(dǎo)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡1)實(shí)驗(yàn)方法：取15只balb/c裸鼠(♀16-18g)，于右側(cè)背部肩胛骨處種植2×106個(gè)hct116細(xì)胞制作藥效檢測(cè)的小鼠模型，6-7天后成瘤，等待瘤體長(zhǎng)到50-100mm3大小后隨機(jī)分組給藥。設(shè)置：對(duì)照組和給藥組(腹腔注射15mg/kg的化合物1)。2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：ptgs2為鐵死亡發(fā)生的重要分子標(biāo)志物，其mrna水平的上調(diào)則預(yù)示細(xì)胞將發(fā)生鐵死亡。對(duì)對(duì)照組和給藥組小鼠的ptgs2mrna水平進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖4所示，圖4結(jié)果表明，給藥組腫瘤組織中ptgs2的量顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明化合物1誘導(dǎo)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。圖5為對(duì)照組和給藥組小鼠的腫瘤大小，由結(jié)果推測(cè)化合物1誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，降低了腫瘤生長(zhǎng)速度。當(dāng)前第1頁(yè)12