本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)和分析檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種在微通道內(nèi)固定化蛋白質(zhì)的方法及應(yīng)用。

技術(shù)背景

微通道(microchannel)是微反應(yīng)器、檢測(cè)器、微流混合器、微流傳感器等設(shè)備的核心精密組件結(jié)構(gòu)，廣泛用于化學(xué)品的生產(chǎn)、材料的合成、物質(zhì)的超細(xì)粉碎或乳化、物料的快速混合、信號(hào)的發(fā)生、探測(cè)與控制、化學(xué)或生物物質(zhì)的檢測(cè)和分析等。在許多情況下，需要蛋白質(zhì)能夠穩(wěn)定固定于微通道的內(nèi)表面。然而在微通道內(nèi)表面固定蛋白質(zhì)往往是一件費(fèi)時(shí)費(fèi)力且成本高昂的工作，目前除了在一些貴重分析檢測(cè)設(shè)備中有少量應(yīng)用外，在實(shí)際應(yīng)用中并不多見。借鑒于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)固定技術(shù)，對(duì)于在微通道表面固定化蛋白質(zhì)已經(jīng)有了多種多樣的嘗試，例如共價(jià)交聯(lián)，表面功能化處理以吸附或捕捉目標(biāo)蛋白，以及簡(jiǎn)單的物理吸附，等等。鑒于蛋白質(zhì)具有一定的壽命，并不適于長(zhǎng)時(shí)間使用，因此固定化蛋白質(zhì)的微通道在功能上也隨所固定的蛋白質(zhì)一樣具有同等且較短的壽命，由于生產(chǎn)價(jià)格較為昂貴，從生產(chǎn)成本上考慮，微通道需要長(zhǎng)久重復(fù)使用，這就要求蛋白質(zhì)在微通道內(nèi)表面的固定化具有以下技術(shù)特點(diǎn)：1-操作簡(jiǎn)便，成本低廉；2-易于在微通道內(nèi)重復(fù)進(jìn)行蛋白質(zhì)的“固定化—使用—清除—重新固定化”操作。此外，由于制造微通道的材料可以多種多樣，這就要求理想的蛋白質(zhì)固定化技術(shù)也必須適用于不同材質(zhì)的微通道內(nèi)表面。基于上述要求，一般來講共價(jià)交聯(lián)并不便于所固定蛋白質(zhì)的清除和多次重復(fù)固定化，且該技術(shù)需要功能化微通道內(nèi)表面，使其能與蛋白質(zhì)共價(jià)交聯(lián)，適用材質(zhì)的范圍窄且操作成本高。而通過內(nèi)表達(dá)的功能化的處理來吸附固定化蛋白質(zhì)的方法，也具有類似缺陷，一方面微通道的選材往往多種多樣，內(nèi)表面的功能化處理技術(shù)往往適用性差，另一方面內(nèi)表面的功能化成本較高且由于表面功能層也具有一定的壽命而不適于蛋白質(zhì)的多次重復(fù)固定化。相比于前兩種，在微通道內(nèi)表面通過簡(jiǎn)單的物理吸附作用來固定化蛋白質(zhì)將是一種理想的技術(shù)，但其前提是要滿足下述三個(gè)要求，即1-操作簡(jiǎn)便，成本低廉；2-易于在微通道內(nèi)重復(fù)進(jìn)行蛋白質(zhì)的“固定化—使用—清除—重新固定化”操作；3-適用于不同材質(zhì)的微通道內(nèi)表面。然而到目前為止，可以同時(shí)滿足上述要求的實(shí)用技術(shù)卻沒有報(bào)道。

基于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種在微通道內(nèi)表面固定化蛋白質(zhì)的方法，該方法可滿足三個(gè)要求，即1-操作簡(jiǎn)便，成本低廉；2-易于在微通道內(nèi)重復(fù)進(jìn)行蛋白質(zhì)的“固定化—使用—清除—重新固定化”操作；3-適用于不同材質(zhì)的微通道內(nèi)表面。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

一種在微通道內(nèi)固定化蛋白質(zhì)的方法，包含下列步驟：

步驟一，magr與目標(biāo)蛋白質(zhì)的融合重組表達(dá)；

步驟二，含有融合重組蛋白質(zhì)的液體在處于磁場(chǎng)中的微通道內(nèi)時(shí)，目標(biāo)蛋白質(zhì)固定化在微通道內(nèi)壁上；

步驟三，使用過程中，從微通道內(nèi)壁脫離的融合重組蛋白，在微通道末端出口被強(qiáng)磁場(chǎng)吸附回收；

步驟四，所固定的蛋白質(zhì)在使用完畢后，通過流體沖洗，清除所固定化的蛋白質(zhì)；

步驟五，清除所固定化的蛋白質(zhì)后，重復(fù)步驟二至步驟四，實(shí)現(xiàn)在微通道內(nèi)重復(fù)進(jìn)行蛋白質(zhì)的“固定化—使用—清除—重新固定化”操作。

進(jìn)一步地，所述magr是如下蛋白質(zhì)(i)或(ii)或(iii)：

(i)與seqidno:1或seqidno:2所示的氨基酸序列同源；

(ii)在(i)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代，缺失或者疊加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸衍生的蛋白質(zhì)；

(iii)與seqidno:1或seqidno:2所編碼蛋白的功能相同的蛋白質(zhì)。

進(jìn)一步地，步驟一中所述magr與目標(biāo)蛋白質(zhì)的融合重組，為magr的c端與目標(biāo)蛋白質(zhì)的n端融合，或目標(biāo)蛋白質(zhì)的c端與magr的n端融合。

可選地，步驟一中所述magr與目標(biāo)蛋白質(zhì)的融合重組，為magr的c端通過一段連接肽與目標(biāo)蛋白質(zhì)的n端融合，或目標(biāo)蛋白質(zhì)的c端通過一段連接肽與magr的n端融合。

進(jìn)一步地，步驟一中所述magr與目標(biāo)蛋白質(zhì)的融合重組表達(dá)，以原核微生物、真核微生物或動(dòng)物細(xì)胞昆蟲細(xì)胞為宿主。

進(jìn)一步地，步驟一中所述magr與目標(biāo)蛋白質(zhì)的融合重組表達(dá)，在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或細(xì)胞外分泌表達(dá)。

進(jìn)一步地，步驟二中所述含有融合重組蛋白質(zhì)的液體是指：magr與目標(biāo)蛋白質(zhì)的融合重組表達(dá)后，如果是在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的，則通過破壁，來釋放與magr重組的目標(biāo)蛋白，破壁液的上清即為含有融合重組蛋白的液體；如果是在宿主細(xì)胞外分泌表達(dá)的，則直接取上清液，即含有融合重組蛋白的液體。

進(jìn)一步地，步驟二中的磁場(chǎng)由外加磁場(chǎng)產(chǎn)生，或者由鐵磁體內(nèi)壁產(chǎn)生。

進(jìn)一步地，所述外加磁場(chǎng)是指在微通道外施加永磁體或電磁體所產(chǎn)生的磁場(chǎng)。

進(jìn)一步地，所述鐵磁體內(nèi)壁是指微通道設(shè)備的微通道內(nèi)壁是鐵磁體材料制成，具有鐵磁性。

進(jìn)一步地，通過在具有鐵磁性內(nèi)壁的微通道外施加永磁體或電磁體所產(chǎn)生的磁場(chǎng)，來增強(qiáng)目標(biāo)蛋白在微通道內(nèi)壁固定化的強(qiáng)度。

進(jìn)一步地，步驟三中，所述強(qiáng)磁場(chǎng)由強(qiáng)磁模塊產(chǎn)生，所述強(qiáng)磁模塊由永磁體或電磁體構(gòu)成。

進(jìn)一步地，步驟四中，對(duì)于通過外加磁場(chǎng)實(shí)現(xiàn)的蛋白質(zhì)固定化，通過撤除磁場(chǎng)，在微通道內(nèi)壁為非鐵磁體的情況下，直接通過水或其他溶劑等流體沖洗，即可清除所固定化的蛋白質(zhì)；在微通道內(nèi)壁為鐵磁體的情況下，通過添加蛋白酶的流體沖洗微通道，可清除所固定化的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的目的之一是提供一種在微通道內(nèi)表面固定化蛋白質(zhì)的應(yīng)用，所述固定化蛋白質(zhì)應(yīng)用于微通道反應(yīng)器的酶催化反應(yīng)、微流傳感器芯片的分析檢測(cè)等領(lǐng)域。

本發(fā)明的原理根基于一種動(dòng)物來源的磁受體蛋白magr棒狀復(fù)合體的對(duì)鐵磁體材質(zhì)及磁力的強(qiáng)相互作用而實(shí)現(xiàn)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有明顯優(yōu)點(diǎn)，即可同時(shí)滿足以下要求：

1)操作簡(jiǎn)便，成本低廉；

2)易于在微通道內(nèi)重復(fù)進(jìn)行蛋白質(zhì)的“固定化—使用—清除—重新固定化”操作；

3)適用于不同材質(zhì)的微通道內(nèi)表面。

附圖說明

圖1為果蠅magr的氨基酸編碼序列seqidno:1。

圖2為鴿子magr的氨基酸編碼序列seqidno:2。

圖3為果蠅磁受體dmagr與紅色熒光蛋白的重組融合方式與融合蛋白的磁性吸附。

圖4為鴿子磁受體clmagr與綠色熒光蛋白的重組融合方式與融合蛋白的磁性吸附。

圖5為magr與熒光蛋白分別在枯草芽孢桿菌(a)、里氏木霉(b)和cho細(xì)胞(c)中表達(dá)的粗蛋白被磁鐵的吸附聚集。

圖6為重組magr-蛋白分子在外加磁場(chǎng)微通道(微通道內(nèi)壁為非鐵磁材料)上的固定化及洗脫示意圖。

圖7為重組magr-蛋白分子在外加磁場(chǎng)微通道(微通道內(nèi)壁為鐵磁材料)上的固定化及洗脫示意圖。

圖8為微通道固定化酶催化反應(yīng)示意圖。

圖9為微通道中的酶聯(lián)免疫分析，其中第一(一級(jí))抗體被固定化在微通道芯片的微通道表面。

其中，圖6a-蛋白分子溶液流向外加磁場(chǎng)的微通道；圖6b-蛋白分子被磁場(chǎng)吸附在微通道內(nèi)壁上，其中2級(jí)磁場(chǎng)捕獲吸附1級(jí)磁場(chǎng)未吸附完全的蛋白分子；圖6c-底物分子流經(jīng)微通道，與蛋白分子發(fā)生作用(可為酶催化反應(yīng)，或者也可為抗體-抗原作用)；圖6d-產(chǎn)物流出微通道；圖6e-解除外加磁場(chǎng)，蛋白分子從微通道內(nèi)壁上釋放出來，去固定化；圖6f-蛋白分子隨清洗液流出微通道；圖7a-蛋白分子溶液流向外加磁場(chǎng)的微通道；圖7b-蛋白分子吸附在鐵磁微通道內(nèi)壁上，其中2級(jí)磁場(chǎng)捕獲吸附1級(jí)磁場(chǎng)未吸附完全的蛋白分子；圖7c-底物分子流經(jīng)微通道，與蛋白分子發(fā)生作用(可為酶催化反應(yīng)，或者也可為抗體-抗原作用)；圖7d-產(chǎn)物流出微通道；圖7e-清洗微通道；圖7f-蛋白酶流進(jìn)微通道，酶解蛋白分子；圖7g-撤除外加磁場(chǎng)，蛋白分子被蛋白酶降解；圖7h-清洗微通道，降解產(chǎn)物流出微通道。

具體實(shí)施方式

以下對(duì)本發(fā)明在具體應(yīng)用中的最佳實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說明，需要說明的是，這些實(shí)施例并非對(duì)本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍進(jìn)行約束。

本發(fā)明基于magr復(fù)合物的強(qiáng)磁性特點(diǎn)，來實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)在微通道內(nèi)表面的非共價(jià)物理吸附式固載。

本發(fā)明提供的是一種蛋白質(zhì)在微通道內(nèi)固定化的方法，適用于多種蛋白質(zhì)，并不局限于某種或某幾種蛋白質(zhì)，以下實(shí)施例中對(duì)幾種蛋白質(zhì)的描述，僅為舉例，非為限定，從這些蛋白質(zhì)可很容易推廣到其它蛋白質(zhì)，即以下舉例的蛋白質(zhì)可換成多種蛋白質(zhì)，由于本發(fā)明所適用的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)太過巨大，此處不能一一列舉。

magr可以有不同來源，本發(fā)明只提供果蠅來源的magr的編碼序列seqidno:1，以及鴿子來源的編碼序列seqidno:2，這并不意味著magr局限于這兩個(gè)來源，對(duì)任一具有生物學(xué)同源知識(shí)的人來講，以seqidno:1或seqidno:2序列為模板可極容易地在其它物種中獲得與seqidno:1或seqidno:2功能相同的同源基因及其編碼的magr。

本發(fā)明所使用的微通道反應(yīng)器每個(gè)模塊的流體通道并無統(tǒng)一規(guī)制，流體通道的寬度和深度為0.5μm～50mm。制造這些模塊的材料不受限制，可以為不銹鋼、超硬鋼、鐵、銅、紅寶石、金剛石、陶瓷、碳化硅、玻璃、金屬陶瓷復(fù)合材料或其他高分子材料。本發(fā)明中的微通道反應(yīng)器可以為商品化的微通道反應(yīng)器，例如，美國康寧公司生產(chǎn)的心型結(jié)構(gòu)g1玻璃高通量微通道反應(yīng)器，或者依據(jù)相同原理制備得到的其他商品化或非商品化微通道反應(yīng)器。

實(shí)施例1：果蠅magr與紅色熒光蛋白的重組融合

按照果蠅magr(此處簡(jiǎn)稱dmagr)的氨基酸編碼序列seqidno:1，根據(jù)所用的表達(dá)宿主優(yōu)化合成seqidno:1所對(duì)應(yīng)的基因dmagr。本實(shí)施例以紅色熒光蛋白mcherry為代表蛋白，其基因mcherry與magr進(jìn)行重組連接，方式有以下幾種(如圖3的a部分)：

(1)dmagr的3’端直接與mcherry的5’端相連接。此基因重組的方式，在表達(dá)以后，可獲得dmagr的c端與mcherry熒光蛋白的n端的直接融合，成為一重組蛋白。

(2)dmagr的3’端通過任一編碼短肽的短核苷酸序列與mcherry的5’端相連接。此基因重組的方式，在表達(dá)以后，可獲得dmagr的c端通過一短肽與mcherry熒光蛋白的n端的相融合，成為一重組蛋白。

(3)mcherry的3’端直接與dmagr的5’端相連接。此基因重組的方式，在表達(dá)以后，可獲得mcherry熒光蛋白的c端與dmagr的n端的直接融合，成為一重組蛋白。

(4)dmagr的3’端通過任一編碼短肽的短核苷酸序列與mcherry的5’端相連接。此基因重組的方式，在表達(dá)以后，可獲得mcherry熒光蛋白的c端通過一短肽與dmagr的n端相融合，成為一重組蛋白。

以上重組方式，均可獲得具有mcherry熒光的重組表達(dá)蛋白，且均可被磁鐵吸附聚集(圖3的b部分)。

實(shí)施例2：鴿子magr與綠色熒光蛋白的重組融合

按照鴿子magr(此處簡(jiǎn)稱clmagr)的氨基酸編碼序列seqidno:2，根據(jù)所用的表達(dá)宿主優(yōu)化合成seqidno:2所對(duì)應(yīng)的基因clmagr。本實(shí)施例以綠色熒光蛋白mgfp為代表蛋白，其基因mgfp與clmagr進(jìn)行重組連接，方式有以下幾種(如圖4的a部分)：

(1)clmagr的3’端直接與mgfp的5’端相連接。此基因重組的方式，在表達(dá)以后，可獲得clmagr的c端與mgfp熒光蛋白的n端的直接融合，成為一重組蛋白。

(5)clmagr的3’端通過任一編碼短肽的短核苷酸序列與mgfp的5’端相連接。此基因重組的方式，在表達(dá)以后，可獲得clmagr的c端通過一短肽與mgfp熒光蛋白的n端的融合，成為一重組蛋白。

(6)mgfp的3’端直接與clmagr的5’端相連接。此基因重組的方式，在表達(dá)以后，可獲得mgfp熒光蛋白的c端與clmagr的n端的直接融合，成為一重組蛋白。

(7)clmagr的3’端通過任一編碼短肽的短核苷酸序列與mgfp的5’端相連接。此基因重組的方式，在表達(dá)以后，可獲得mgfp熒光蛋白的c端通過一短肽與clmagr的n端相融合，成為一重組蛋白。

以上重組方式，均可獲得具有mgfp熒光的重組表達(dá)蛋白，且均可被磁鐵吸附聚集(圖4的b部分)。

實(shí)施例3：重組融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)

實(shí)施例1中，如圖3的a部分所示的四種果蠅magr與紅色熒光蛋白mcherry的重組融合方式，構(gòu)建于常規(guī)大腸桿菌表達(dá)pet載體，然后在常規(guī)大腸桿菌表達(dá)宿主bl21(de3)中表達(dá)。于28攝氏度左右，分別通過iptg誘導(dǎo)，四種融合重組的蛋白均能表達(dá)出紅色熒光蛋白，蛋白質(zhì)經(jīng)勻漿破壁后，可獲得粗蛋白液，在6000-7000高斯的磁場(chǎng)作用下，均可發(fā)生吸附聚集(圖3的b部分)。其中以圖3的a部分中(1)dmagr的c端與mcherry的n端直接融合的產(chǎn)物以及(2)dmagr的c端與mcherry的n端通過一段短肽相融合的產(chǎn)物的吸附效果最佳，在強(qiáng)磁場(chǎng)的作用下(6000-7000高斯，永磁鐵)，吸附率可達(dá)到95％以上，(4)mcherry的n端通過一段短肽與dmagr的c端相融合的產(chǎn)物的吸附效果稍差，吸附率約為85％左右，而(3)mcherry的n端與dmagr的c端直接融合的產(chǎn)物吸附效果最差，僅為75％左右。

實(shí)施例4：重組融合蛋白在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)

實(shí)施例1中，如圖3的a部分所示的四種果蠅magr與紅色熒光蛋白mcherry的重組融合方式，構(gòu)建于枯草芽孢桿菌psk4衍生雜交型啟動(dòng)子的表達(dá)載體，然后在枯草芽孢桿菌表達(dá)宿主wb800n中表達(dá)。于30攝氏度左右，四種融合重組的蛋白均能表達(dá)出紅色熒光蛋白，表達(dá)量可達(dá)到實(shí)施例3中大腸桿菌表達(dá)量的45％左右，提取的濃縮粗蛋白液，均可被磁鐵吸附聚集。其中以(1)dmagr的c端與mcherry的n端直接融合的產(chǎn)物以及(2)dmagr的c端與mcherry的n端通過一段短肽相融合的產(chǎn)物的吸附效果最佳，在強(qiáng)磁場(chǎng)的作用下(6000-7000高斯，永磁鐵)，吸附率可達(dá)到90％左右(圖5的a管)，(4)mcherry的n端通過一段短肽與dmagr的c端相融合的產(chǎn)物的吸附效果稍差，吸附率約為80％左右，而(3)mcherry的n端與dmagr的c端直接融合的產(chǎn)物吸附效果較差，約為65％左右。

實(shí)施例5：重組融合蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)

實(shí)施例2中，如圖4的a部分所示的四種鴿子magr與綠色熒光蛋白mgfp的重組融合方式，分別通過ppic3.5k和ppic9k中，構(gòu)建于常規(guī)畢赤酵母gs115中表達(dá)。于30攝氏度左右，四種融合重組的蛋白均能表達(dá)出綠色熒光蛋白，而且也均可被磁鐵吸附聚集，其中ppic9k作為載體的表達(dá)效果較佳，提取ppic9k為載體的表達(dá)菌株生產(chǎn)的粗蛋白，在6000-7000高斯的磁場(chǎng)作用下，發(fā)生吸附聚集的情況如圖4的b部分所示。在以ppic9k為載體的表達(dá)菌株中，其中以(1)clmagr的c端與mgfp的n端直接融合以及(2)clmagr的c端與mgfp的n端通過一段短肽相融合的表達(dá)效果最佳，且吸附效果最佳，在(6000-7000高斯磁場(chǎng)作用下，吸附率可達(dá)到90％左右，(4)mcherry的n端通過一段短肽與dmagr的c端相融合的產(chǎn)物的吸附效果稍差，吸附率約為75％左右，而(3)mcherry的n端與dmagr的c端直接融合的產(chǎn)物吸附效果較差，約為60％左右。

實(shí)施例6：重組融合蛋白在里氏木霉中的表達(dá)

將里氏木霉纖維二糖水解酶(cbh1)和丙酮酸脫羧酶基因啟動(dòng)子(ppdc)相融合組成雜合型啟動(dòng)子，同cbh1自身信號(hào)肽、終止子和潮霉素篩選基因依次插入骨架質(zhì)粒puc19中，構(gòu)建出里氏木霉表達(dá)載體ptr，分別把實(shí)施例2中，如圖4的a部分所示的四種鴿子磁受體clmagr與綠色熒光蛋白mgfp的重組融合方式，構(gòu)建入ptr載體中，然后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化入里氏木霉中，篩選獲得穩(wěn)定遺傳的高表達(dá)菌株。于28攝氏度左右，四種融合重組的蛋白均能表達(dá)出綠色熒光蛋白，而且也均可被磁鐵吸附聚集。其中以(1)clmagr的c端與mgfp的n端直接融合的產(chǎn)物以及(2)clmagr的c端與mgfp的n端通過一段短肽相融合的產(chǎn)物的吸附效果最佳(圖5的b管)，在強(qiáng)磁場(chǎng)的作用下(6000-7000高斯，永磁鐵)，吸附率可達(dá)到95％左右，(4)mcherry的n端通過一段短肽與dmagr的c端相融合的產(chǎn)物的吸附效果稍差，吸附率約為85％左右，而(3)mcherry的n端與dmagr的c端直接融合的產(chǎn)物吸附效果較差，約為70％左右。

實(shí)施例7：重組融合蛋白在cho細(xì)胞(中國倉鼠卵巢細(xì)胞)中的表達(dá)

實(shí)施例2中，如圖4的a部分所示的四種鴿子磁受體clmagr與綠色熒光蛋白mgfp的重組融合方式，分別通過lentiviralvector構(gòu)建于cho無血清培養(yǎng)的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。于37度左右，四種融合重組的蛋白均表達(dá)出綠色熒光蛋白，且均可被磁鐵吸附聚集。其中以(1)clmagr的c端與mgfp的n端直接融合的產(chǎn)物以及(2)clmagr的c端與mgfp的n端通過一段短肽相融合的產(chǎn)物的吸附效果最佳(圖5的c管)，在強(qiáng)磁場(chǎng)的作用下(6000-7000高斯，永磁鐵)，吸附率可達(dá)到90％左右，(4)mcherry的n端通過一段短肽與dmagr的c端相融合的產(chǎn)物的吸附效果稍差，吸附率約為85％左右，而(3)mcherry的n端與dmagr的c端直接融合的產(chǎn)物吸附效果較差，約為70％左右。

實(shí)施例8：重組融合蛋白在微通道鐵磁體內(nèi)表面上的固定化

實(shí)施例5所獲得的四種重組蛋白，在發(fā)酵結(jié)束后，以6000-7000高斯的永磁鐵吸附目標(biāo)蛋白，移除菌體和大部分液體后，加純凈水溶解稀釋磁吸附的沉淀，配成濃度為100mg/l的重組融合蛋白溶液30ml。然后通過泵把溶液以1ml/min的速度泵入微通道反應(yīng)器的微通道內(nèi)，此微通道長(zhǎng)度為0.1m，管徑為0.1mm，此微通道內(nèi)表面材料為鐵磁體。結(jié)果表明，實(shí)施例5所獲得的四種重組蛋白，均可以在5分鐘內(nèi)快速吸附固定化于微通道內(nèi)壁上。

在重組蛋白未能占滿微通道鐵磁體內(nèi)表面時(shí)，即微通道鐵磁體內(nèi)表所固定的蛋白質(zhì)未飽和時(shí)，對(duì)于clmagr的c端與mgfp的n端直接融合的蛋白以及clmagr的c端與mgfp的n端通過一段短肽相融合的蛋白來講，80％的重組蛋白可在1分鐘內(nèi)吸附于微生物通道內(nèi)壁上，3分鐘吸附率穩(wěn)定在90％左右，不再增加。mcherry的n端通過一段短肽與dmagr的c端相融合的產(chǎn)物的吸附效果稍差，3分鐘吸附率穩(wěn)定在75％左右，mcherry的n端與dmagr的c端直接融合的產(chǎn)物，3分鐘吸附率穩(wěn)定在60％左右。

在重組蛋白相對(duì)于占滿微通道鐵磁體內(nèi)表面過剩的情況下，微通道鐵磁體內(nèi)表面對(duì)實(shí)施例5所構(gòu)建的四種融合蛋白的吸附規(guī)律相同，1分鐘內(nèi)相當(dāng)于75％飽和當(dāng)量的蛋白已吸附于微生物通道內(nèi)壁上，隨后吸附率緩慢增加，5分鐘以后基本達(dá)到吸附飽和，此后吸附率無明顯增加。

上述所固定的蛋白，在高壓力高速流體的工作條件下，所固定的蛋白質(zhì)有脫吸附現(xiàn)像。(1)clmagr的c端與mgfp的n端直接融合的產(chǎn)物以及(2)clmagr的c端與mgfp的n端通過一段短肽相融合的產(chǎn)物在固定化效果較好，5bar壓力10m/s的純水流作用下，所固定蛋白質(zhì)的達(dá)到50％脫吸率，時(shí)間約為80min。而(3)mcherry的n端與dmagr的c端直接融合的產(chǎn)物和(4)mcherry的n端通過一段短肽與dmagr的c端相融合的產(chǎn)物的吸附穩(wěn)定較差，達(dá)到50％脫吸率，所用時(shí)間分別為35min和50min。

實(shí)施例9：重組融合蛋白在外加磁場(chǎng)微通道非鐵磁體內(nèi)表面上的固定化

實(shí)施例5所獲得的四種重組蛋白，在發(fā)酵結(jié)束后，以6000-7000高斯的永磁鐵吸附目標(biāo)蛋白，移除菌體和大部分液體后，加純凈水溶解稀釋磁吸附的沉淀，配成濃度為100mg/l的重組融合蛋白溶液30ml。然后通過泵把溶液以1ml/min的速度泵入微通道反應(yīng)器的微通道內(nèi)，此微通道長(zhǎng)度為0.1m，管徑為0.1mm，此微通道內(nèi)表面為非鐵磁體。此微通道反應(yīng)器置于外加的永磁鐵營造的6000-7000高斯的磁場(chǎng)內(nèi)，結(jié)果表明，實(shí)施例5所獲得的四種重組蛋白，均可以在3分鐘內(nèi)快速吸附固定化于微通道內(nèi)壁上。

在重組蛋白未能占滿微通道鐵磁體內(nèi)表面時(shí)，即微通道鐵磁體內(nèi)表所固定的蛋白質(zhì)未飽和時(shí)，對(duì)于clmagr的c端與mgfp的n端直接融合的蛋白以及clmagr的c端與mgfp的n端通過一段短肽相融合的蛋白來講，95％的重組蛋白可在1分鐘內(nèi)吸附于微生物通道內(nèi)壁上，2分鐘吸附率穩(wěn)定在90％左右，不再增加。mcherry的n端通過一段短肽與dmagr的c端相融合的產(chǎn)物的吸附效果稍差，2分鐘吸附率穩(wěn)定在75％左右，mcherry的n端與dmagr的c端直接融合的產(chǎn)物，2分鐘吸附率穩(wěn)定在60％左右。

在重組蛋白相對(duì)于占滿微通道鐵磁體內(nèi)表面過剩的情況下，微通道鐵磁體內(nèi)表面對(duì)實(shí)施例5所構(gòu)建的四種融合蛋白的吸附規(guī)律相同，1分鐘內(nèi)相當(dāng)于90％飽和當(dāng)量的蛋白已吸附于微生物通道內(nèi)壁上，隨后吸附率緩慢增加，3分鐘以后基本達(dá)到吸附飽和，此后吸附率無明顯增加。

上述所固定的蛋白，在高壓力高速流體的工作條件下，所固定的蛋白質(zhì)有脫吸附現(xiàn)像。(1)clmagr的c端與mgfp的n端直接融合的產(chǎn)物以及(2)clmagr的c端與mgfp的n端通過一段短肽相融合的產(chǎn)物在固定化效果較好，5bar壓力10m/s的純水流作用下，所固定蛋白質(zhì)的達(dá)到50％脫吸率，時(shí)間約為150min。而(3)mcherry的n端與dmagr的c端直接融合的產(chǎn)物和(4)mcherry的n端通過一段短肽與dmagr的c端相融合的產(chǎn)物的吸附穩(wěn)定較差，達(dá)到50％脫吸率，所用時(shí)間分別為60min和80min。

實(shí)施例10：重組融合蛋白在外加磁場(chǎng)微通道鐵磁體內(nèi)表面上的固定化

實(shí)施例5所獲得的四種重組蛋白，在發(fā)酵結(jié)束后，以6000-7000高斯的永磁鐵吸附目標(biāo)蛋白，移除菌體和大部分液體后，加純凈水溶解稀釋磁吸附的沉淀，配成濃度為100mg/l的重組融合蛋白溶液30ml。然后通過泵把溶液以1ml/min的速度泵入微通道反應(yīng)器的微通道內(nèi)，此微通道長(zhǎng)度為0.1m，管徑為0.1mm，此微通道內(nèi)表面為鐵磁體。此微通道反應(yīng)器置于外加的永磁鐵營造的6000-7000高斯的磁場(chǎng)內(nèi)，結(jié)果表明，實(shí)施例5所獲得的四種重組蛋白，均可以在3分鐘內(nèi)快速吸附固定化于微通道內(nèi)壁上。

在重組蛋白未能占滿微通道鐵磁體內(nèi)表面時(shí)，即微通道鐵磁體內(nèi)表所固定的蛋白質(zhì)未飽和時(shí)，對(duì)于clmagr的c端與mgfp的n端直接融合的蛋白以及clmagr的c端與mgfp的n端通過一段短肽相融合的蛋白來講，95％的重組蛋白可在1分鐘內(nèi)吸附于微生物通道內(nèi)壁上，2分鐘吸附率穩(wěn)定在90％左右，不再增加。mcherry的n端通過一段短肽與dmagr的c端相融合的產(chǎn)物的吸附效果稍差，2分鐘吸附率穩(wěn)定在75％左右，mcherry的n端與dmagr的c端直接融合的產(chǎn)物，2分鐘吸附率穩(wěn)定在60％左右。

在重組蛋白相對(duì)于占滿微通道鐵磁體內(nèi)表面過剩的情況下，微通道鐵磁體內(nèi)表面對(duì)實(shí)施例5所構(gòu)建的四種融合蛋白的吸附規(guī)律相同，1分鐘內(nèi)相當(dāng)于95％飽和當(dāng)量的蛋白已吸附于微生物通道內(nèi)壁上，隨后吸附率緩慢增加，2分鐘以后基本達(dá)到吸附飽和，此后吸附率無明顯增加。

上述所固定的蛋白，在高壓力高速流體的工作條件下，所固定的蛋白質(zhì)有脫吸附現(xiàn)像。(1)clmagr的c端與mgfp的n端直接融合的產(chǎn)物以及(2)clmagr的c端與mgfp的n端通過一段短肽相融合的產(chǎn)物在固定化效果較好，5bar壓力10m/s的純水流作用下，所固定蛋白質(zhì)的達(dá)到50％脫吸率，時(shí)間約為240min。而(3)mcherry的n端與dmagr的c端直接融合的產(chǎn)物和(4)mcherry的n端通過一段短肽與dmagr的c端相融合的產(chǎn)物的吸附穩(wěn)定較差，達(dá)到50％脫吸率，所用時(shí)間分別為90min和120min。

實(shí)施例11：在微通道末端出口設(shè)置強(qiáng)磁場(chǎng)模塊對(duì)脫落的融合重組蛋白予以吸附回收

由于在高壓高流速流體通過微通道時(shí)，對(duì)內(nèi)表面所固定的蛋白具有較強(qiáng)的剪切力，蛋白的脫吸附速度較快，為了避免蛋白質(zhì)的快速損耗，在微通道末端出口的降壓低速區(qū)設(shè)置由強(qiáng)磁鐵組成強(qiáng)磁模塊，一般情況下可通過6000-7000高斯的磁場(chǎng)來實(shí)現(xiàn)對(duì)所脫落重組蛋白的吸附回收。結(jié)果表明，在實(shí)施例8中加裝強(qiáng)磁模塊進(jìn)行回收，對(duì)于clmagr的c端與mgfp的n端直接融合的蛋白以及clmagr的c端與mgfp的n端通過一段短肽相融合的蛋白來講，脫落蛋白中的80％左右可實(shí)現(xiàn)回收；對(duì)于mcherry的n端通過一段短肽與dmagr的c端相融合的產(chǎn)物來講，脫落蛋白中的75％左右可實(shí)現(xiàn)回收；而對(duì)于mcherry的n端與dmagr的c端直接融合的產(chǎn)物，脫落蛋白中的60％左右可實(shí)現(xiàn)回收。

實(shí)施例12：在微通道中固定化蛋白的清除與再固定化重組蛋白

實(shí)施例9的使用完畢后，為了重新使用微通道設(shè)備，需要對(duì)微通道內(nèi)壁所殘留的固定化的蛋白質(zhì)進(jìn)行清除。由于此微通道內(nèi)表面為非鐵磁材質(zhì)，具體措施是撤去外加磁場(chǎng)，然后通過1bar的壓力1m/s的純水流體，對(duì)于不超過0.1m的微通道進(jìn)行沖洗，10分鐘內(nèi)可完全清除微通道內(nèi)壁先前所固定化的蛋白質(zhì)。此時(shí)微通道可重復(fù)用于蛋白質(zhì)的固定化，如果仍然使用實(shí)施例2的重組蛋白質(zhì)，其固定的效果仍如實(shí)施例9，無明顯差異。

實(shí)施例13：在微通道中固定化蛋白的沖洗清除與再固化重組蛋白

對(duì)于實(shí)施例8和去除外加磁場(chǎng)的實(shí)施例10，在使用完畢后，為了重新使用微通道設(shè)備，需要對(duì)微通道內(nèi)壁所殘留的固定化的蛋白質(zhì)進(jìn)行清除。由于此微通道內(nèi)表面為鐵磁材質(zhì)，單純通過高剪切力，不易快速徹底地清除所固定化的蛋白質(zhì)，在此種情況下，對(duì)于不超過0.1m的微通道進(jìn)行沖洗，可先在微通道內(nèi)灌注蛋白酶液，在蛋白酶適宜的作用條件下，在30min內(nèi)可快速消解微通道內(nèi)壁的蛋白質(zhì)，然而通過1bar的壓力1m/s的純水流體，沖洗10分鐘可完全清除微通道內(nèi)壁先前所固定化的蛋白質(zhì)。此時(shí)微通道可重復(fù)用于蛋白質(zhì)的固定化，如果仍然使用實(shí)施例2的重組蛋白質(zhì)，其固定的效果仍如實(shí)施例8和實(shí)施例10，無明顯差異。

實(shí)施例14：鴿子磁受體clmagr與轉(zhuǎn)酮酶的重組融合蛋白在微通道中的固定化

鴿子磁受體clmagr與轉(zhuǎn)酮酶tkl1按實(shí)施例2中(1)的方式融合，并按實(shí)施例5的表達(dá)方式，獲得clmagr與轉(zhuǎn)酮酶tkl1融合的重組蛋白，按實(shí)施例9的方法固定于微通道中。隨后分兩路泵入羥基丙酮酸鋰和乙醇醛溶液，同時(shí)添加鎂離子和緩沖液，在以1m/s的流速下，流過120m長(zhǎng)的微通道反應(yīng)器，結(jié)果檢測(cè)到l-赤蘚酮糖的合成，表明轉(zhuǎn)酮酶tkl1成功固定化于微通道內(nèi)，并具有良好的酶活與催化反應(yīng)效率。整個(gè)反應(yīng)過程參考圖8。

實(shí)施例15：鴿子磁受體clmagr與環(huán)氧水解酶在微通道中的固定化

鴿子磁受體clmagr與巨大芽孢桿菌環(huán)氧水解酶bmeh按實(shí)施例2中(2)的方式融合，并按實(shí)施例4的表達(dá)方式，獲得clmagr與環(huán)氧水解酶bmeh融合的重組蛋白，按實(shí)施例10的方法固定于微通道中。隨后在微通道內(nèi)使用水/異丙醚/異辛烷＝50/35/15(v/v/v)的兩相反應(yīng)體系，在50gl^-1濃度下對(duì)苯基縮水甘油醚pge進(jìn)行酶促拆分。在最佳拆分條件下，反應(yīng)生成(s)-pge(99％ee)和(r)型雙醇(99.5％ee)時(shí)空產(chǎn)率達(dá)到68gl^-1d^-1和70gl^-1d^-1。表明轉(zhuǎn)酮酶tkl1成功固定化于微通道內(nèi)，并具有良好的酶活與催化反應(yīng)效率。整個(gè)反應(yīng)過程參考圖8。

實(shí)施例16：鴿子磁受體clmagr與p450氧化酶在微通道中的固定化

鴿子磁受體clmagr與委內(nèi)瑞拉鏈霉菌pikc按實(shí)施例2中(1)的方式融合，并在變鉛青鏈霉菌中異源表達(dá)，獲得clmagr與pikc的重組蛋白，按實(shí)施例8的方法固定于微通道中，隨后加入同樣大場(chǎng)桿菌異源表達(dá)的鐵氧化還原蛋，在補(bǔ)加nadph的條件下，在微通道內(nèi)泵入聚酮內(nèi)酯yc-17，可檢測(cè)到等量獲得甲微素和新甲微素的生成。整個(gè)反應(yīng)過程參考圖8。

實(shí)施例17：鴿子磁受體clmagr與脂肪酶在微通道中的固定化

鴿子磁受體clmagr與假絲酵母來源的脂肪酶按實(shí)施例2中(2)的方式融合，并按實(shí)施例5的表達(dá)方式，獲得clmagr與假絲酵母脂肪酶的重組蛋白，按實(shí)施例10的方法固定于微通道中。微通道長(zhǎng)度為100m，以10ml/min的流速，以300g棕櫚酸、200g異辛醇、1200ml石油醚組成的反應(yīng)系統(tǒng)在40℃條件下反應(yīng)，酯化率可達(dá)96.6％。整個(gè)反應(yīng)過程參考圖8。

實(shí)施例18：鴿子磁受體clmagr與環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶和葡萄糖淀粉酶雙酶在微通道中的固定化

用鴿子磁受體clmagr分別與芽孢桿菌來源的一種環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶cgt和黑曲霉來源葡萄糖淀粉酶aml按實(shí)施例2中(1)的方式融合，并分別按實(shí)施例4和實(shí)施例6的表達(dá)方式，分別獲得clmagr與cgt的重組蛋白和clmagr與aml的重組蛋白。兩者按2:1的比例，按實(shí)施例10的方法固定于微通道中。微通道長(zhǎng)度為300m，通道管徑為0.1mm，以6m/min的流速，以10g/l的維生素c為底物，以30g/lβ-環(huán)糊精為糖基供體，在ph5.6，37攝氏度下，可獲得11.6g/l左右的2-氧-α-d-吡喃葡萄糖基維生素c。整個(gè)反應(yīng)過程參考圖8。

實(shí)施例19：鴿子磁受體clmagr與抗體在微通道內(nèi)的固定化

鴿子磁受體clmagr與mgfp的抗體按實(shí)施例2中(1)的方式融合，并按實(shí)施例7的表達(dá)方式，獲得clmagr與mgfp的抗體的重組蛋白，按實(shí)施例10的方法固定于微通道中。微通道長(zhǎng)度為100m，通道管徑為0.1mm，在mgfp流經(jīng)微通道時(shí)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)mgfp的快速捕捉。在1m/s的流速情況下，1min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)mgfp的飽和吸附。

實(shí)施例20：鴿子磁受體clmagr與羊免疫球蛋白m(igm)兔抗體在微流傳感器芯片的微通道內(nèi)的固定化，用于酶聯(lián)免疫分析

鴿子磁受體clmagr與羊免疫球蛋白m(igm)兔抗體蛋白按實(shí)施例2中(1)的方式融合，并按實(shí)施例7的表達(dá)方式，獲得clmagr與igm兔抗體的重組蛋白，按實(shí)施例10的方法固定于微流傳感器芯片的微通道中用于定量分析模板底物(羊免疫球蛋白m(igm))。igm緩沖液以10ml/min的流速流經(jīng)微流傳感器芯片微通道，微通道長(zhǎng)度為0.1m，通道管徑為0.1mm，0.5min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)igm的飽和吸附。在微流傳感器芯片微通道內(nèi)吸附igm后，再將辣根過氧化酶(horseradishperoxidase,hrp)標(biāo)記的二級(jí)抗體(羊(igm)兔抗體-辣根過氧化酶)緩沖液以10ml/min的流速流經(jīng)微流傳感器芯片微通道，0.5min內(nèi)，二級(jí)抗體被igm捕獲，隨后，將熒光底物3-羥基苯丙酸緩沖液以10ml/min的流速流經(jīng)微流傳感器芯片微通道，在微通道內(nèi)，熒光底物被辣根過氧化酶催化生成螢光團(tuán)，隨后收集流出緩沖液，由熒光檢測(cè)器來定量分析熒光產(chǎn)物，所測(cè)定的螢光信號(hào)和測(cè)試樣品中的底物濃度成正比。本實(shí)施例清楚地表明，利用本發(fā)明提供的抗體固定化方法，可以方便的應(yīng)用在微流傳感器芯片用于酶聯(lián)免疫分析，可參考圖9。

在此說明書中，本發(fā)明已參照其特定的實(shí)施例作了描述。但是，很顯然仍可以做出各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍，一個(gè)有本專業(yè)知識(shí)的普通技術(shù)人員，仍可以根據(jù)本專利所傳授的技術(shù)，在本發(fā)明的范圍內(nèi)產(chǎn)生其它的實(shí)施例，但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>理星（天津）生物科技有限公司

<120>一種在微通道內(nèi)固定化蛋白質(zhì)的方法及應(yīng)用

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