本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
；涉及一種復(fù)合生物制劑及其用途，尤其涉及一種用于防治土傳病害的復(fù)合生物制劑及其用途。
背景技術(shù)：
：植物土傳病害是指生活在土壤中的病原菌在條件適宜的情況下，從植物根部或莖部侵染植物，從而導(dǎo)致植株的萎蔫、枯死的病害。常見的土傳病害主要有以下幾種：苗期常見土傳病害包括由腐霉菌引起的猝倒病、由立枯絲核菌引起的立枯病等；成株期常見的突出病害種類包括由鐮刀菌引起的瓜類的枯萎病、由輪枝菌引起的茄子黃萎病、由歐文氏菌引起的大白菜細(xì)菌性軟腐病、由瓜果腐霉菌引起的腐霉根腐病、由根腫病菌引起的根腫病，以及由辣椒疫霉引起的辣椒疫病、由假單胞桿菌引起的番茄細(xì)菌性青枯病、由根結(jié)線蟲引起的根結(jié)線蟲病等。在這些病害種類中，枯萎病和黃萎病是影響最為廣泛的兩類代表性土傳病害，可危害瓜類、豆科、花卉等100多種植物。土傳病原菌的傳播有多種途徑，通常危害植物的根和莖，并引發(fā)植株的系統(tǒng)性病害。土傳病發(fā)病程度主要取決于侵染的病原菌數(shù)量。一個(gè)地區(qū)病原菌基數(shù)越高，發(fā)病較重。作物生長前期發(fā)生病害，導(dǎo)致幼苗根腐爛，或者，莖腐爛猝倒；幼苗很快就會(huì)死亡，嚴(yán)重影響作物生產(chǎn)。作物生長后期發(fā)生病害，一般年份減產(chǎn)20-30％，嚴(yán)重年份減產(chǎn)50-60％，甚至絕收。土傳病害發(fā)病后，比較難以防治。因?yàn)椴【卦谕寥乐性蕉?，很難被殺死；來年繼續(xù)侵害作物，并且隨著種植年限的延長而不斷積累。土傳病害的發(fā)生導(dǎo)致出現(xiàn)土壤環(huán)境惡化、作物產(chǎn)量下降和品質(zhì)降低等一系列不良現(xiàn)象。此外，由于我國很長時(shí)期內(nèi)忽視有機(jī)肥而大量施用化肥，加速了土壤微生物區(qū)系紊亂的發(fā)生。因此，土傳病害逐年加重，已經(jīng)成為影響農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一個(gè)重要限制因素，如何解決土傳病害顯得越來越重要。土傳病害尤其是枯萎病和黃萎病的防治方法較多，主要分為物理防治、化學(xué)防治和生物防治?；瘜W(xué)防治是目前最主要的防治方法，見效快，成本低，方法簡單，殺蟲抗菌譜廣。然而，長期施用化學(xué)農(nóng)藥，不僅污染環(huán)境，降低土壤修復(fù)能力，而且還使病原菌產(chǎn)生抗性，使土壤理、化、生、生化性狀發(fā)生較大變化。物理防治包括土壤暴曬、水蒸氣消毒、淹水等方法，針對少數(shù)作物品種具有一定效果。然而，物理防治耗費(fèi)勞動(dòng)力大，主要應(yīng)用于設(shè)施農(nóng)業(yè)。生物防治則是利用生物或其代謝產(chǎn)物控制病蟲害的發(fā)生，主要包括：以蟲治蟲、以菌治蟲及利用拮抗作用、交叉保護(hù)和信息化學(xué)物質(zhì)等方法。它具有無污染、保護(hù)生態(tài)平衡以及較好的防治效果等特點(diǎn)，被稱為綠色防治方法。通過生物防治的方法防治枯萎病和黃萎病已成為國內(nèi)外學(xué)者的研究焦點(diǎn)。事實(shí)證明，生物防治是現(xiàn)在和將來防治土傳病害的發(fā)展方向，符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求。針對生物防治，各國研究人員已經(jīng)分離出許多生防菌(主要分為細(xì)菌類生防菌、真菌類生防菌、放線菌類生防菌)，同時(shí)研發(fā)出生物菌劑、生物有機(jī)肥等對枯萎病有較好防治效果的生物防治方法。這其中，利用真菌類生防菌的生物防治方法尤為重要。在真菌類生防菌中，鏈格孢屬(alternariasp.)真菌是導(dǎo)致枯萎病發(fā)生的主要真菌。鏈格孢屬真菌對環(huán)境和寄主的適應(yīng)性很強(qiáng)，在自然界中廣泛分布。目前全世界已報(bào)道的鏈格孢菌有500多個(gè)種，其中90％以上的種是兼性寄生于不同科的植物特別是農(nóng)作物上，可引起包括玉米、小麥、煙草、馬鈴薯、番茄、蘋果、梨等幾十種農(nóng)作物的病害，造成田間和產(chǎn)后損失。根據(jù)報(bào)道，鏈格孢屬真菌導(dǎo)致番茄枯萎病、蘋果褐斑病、甜瓜葉斑病、西葫蘆葉斑病、卷心菜黑斑病、煙草赤星病、人參鏈格孢菌、小麥葉斑病、大白菜黑斑病、馬鈴薯早疫病、番茄早疫病、花椒早疫病、茄子早疫病、龍葵早疫病、鴨梨黑斑病、葡萄穗軸褐枯病、杏果實(shí)黑斑病、櫻桃黑色輪斑病、棉花黃萎病、茄子黃萎病等作物病害。以前，鏈格孢屬真菌的防治主要依賴的是化學(xué)藥劑。研究表明，銅制劑是控制鏈格孢屬真菌的有效藥劑，但是使用銅制劑會(huì)影響果實(shí)表面，降低品質(zhì)并且可能導(dǎo)致病原菌的系統(tǒng)抗性。隨著人們對環(huán)境保護(hù)和綠色食物的關(guān)注，使用植物提取物的的抑菌成分研究變得越來越熱門。許牡丹等對13種植物丙酮提取液對鏈格孢菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明只有苦參、甘草、枸杞、金錢草的提取物對鏈格孢菌抑菌效果明顯，其他植物沒有抑制作用。此外，應(yīng)用生物防治鏈格孢屬目前已取得一定的成果。防治鏈格孢屬真菌病害的農(nóng)用抗生素首推日本的多氧霉素和我國的多抗霉素。多抗霉素是一種胞嘧啶核苷類抗生素，產(chǎn)生菌為可可鏈霉菌，主要組分為polyoxina和polyoxinb，其作用位點(diǎn)是真菌的細(xì)胞壁，對煙草赤星病、蘋果斑點(diǎn)落葉病、梨黑斑病等有特效。pichard等從花椰種子上分離到bacilluspolymyxa，該菌可以產(chǎn)生抗生素起到控制花椰菜黑斑病的作用，用無菌上清液進(jìn)行種子處理亦能減少病害的發(fā)生。木霉(trichodermaspp.)是世界上在植物病害物防治中應(yīng)用最多的微生物類群之一。王革等篩選到了對煙草赤星病有明顯拮抗作用。目前，大多數(shù)有益或生防微生物是從土壤中篩選出來的，而且對于單一生防菌的研究及應(yīng)用已經(jīng)取得了較好的防治效果。然而單一生防菌在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中的效果不穩(wěn)定，限制了其商品化進(jìn)程。近幾年來，大量研究表明，利用兩種甚至多種生防微生物制作成的微生物菌劑可以克服單一生防菌的缺點(diǎn)。發(fā)明人已經(jīng)利用枯草芽孢桿菌和擬康氏木霉混合菌防治植物病害，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)出一系列產(chǎn)品。由于防效顯著、防病譜廣，被用戶稱為“傻瓜”農(nóng)藥。例如，中國專利zl201110292116.3和中國專利zl201110292342.1分別公開了一種作物病害防治復(fù)合生物制劑和一種復(fù)合生物土壤改良劑，均包含枯草芽孢桿菌發(fā)酵液、擬康氏木霉發(fā)酵液、水溶性甲殼素、黃腐酸鉀。上述產(chǎn)品對黃瓜黃萎病菌和西瓜枯萎病菌具有較好的防治效果。然而，在上述生物制劑或土壤改良劑中，枯草芽孢桿菌發(fā)酵液和擬康氏木霉發(fā)酵液必須為單獨(dú)發(fā)酵所得。如果采用混合發(fā)酵，則兩種真菌的生長繁殖行為互相干擾，導(dǎo)致菌絲致密度不如單獨(dú)發(fā)酵之和，同時(shí)產(chǎn)孢量也難以盡如人意。這將大大影響植物病害的防治效果。因此，為了防治上述植物病害，迫切需要尋找一種用于防治土傳病害的復(fù)合生物制劑。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明目的是提供一種用于防治土傳病害的復(fù)合生物制劑。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)兩種特定的微生物混合發(fā)酵后，化學(xué)成分發(fā)生了改變，抗菌活性也隨之增強(qiáng)。該復(fù)合生物制劑具有穩(wěn)定、定殖能力強(qiáng)的特點(diǎn)，并且利用微生物之間的協(xié)同作用，提高發(fā)酵液的菌絲致密度和產(chǎn)孢量，進(jìn)而提高植物病害的防治效果。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明擬采取以下技術(shù)方案：一種用于防治土傳病害的復(fù)合生物制劑，包含匍枝根霉(rhizopusstolonifer)和綠色木霉(trichodermaviride)的混合發(fā)酵液。根據(jù)本發(fā)明所述的復(fù)合生物制劑，其中，所述匍枝根霉保藏號(hào)為：cgmccno.8435；保藏名稱為：匍枝根霉pf102；保藏日期為：2013年11月5日；保藏單位為：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。匍枝根霉的抗逆性極強(qiáng)，在快速繁殖過程中，可以產(chǎn)生多種分解土壤有機(jī)質(zhì)和土壤有效成分的活性物質(zhì)，例如：維生素、氨基酸、糖化酶、蛋白酶、淀粉酶等。匍枝根霉可以產(chǎn)生大量的胞外活性物質(zhì)例如：氨基酸類、核酸類、維生素、鞘脂類等多種化合物，它們具有分解有機(jī)質(zhì)，抑制有害微生物，促進(jìn)植物根系生長等作用；匍枝根霉還可以外分泌多種抑菌物質(zhì)，其對多種病原菌有抑制活性，具有光譜性，且抗逆性強(qiáng)，既可防病，又能促進(jìn)植株生長。根據(jù)本發(fā)明所述的復(fù)合生物制劑，其中，所述綠色木霉保藏號(hào)為：cgmccno.8434；保藏名稱為：綠色木霉pf1；保藏日期為：2013年11月5日；保藏單位為：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。綠色木霉分布廣泛，其分泌物具有促進(jìn)植物生長和殺菌效果，具有極大的改善土壤潛力的菌株。綠色木霉具有豐富的菌絲，其菌絲可以纏繞土壤微粒，進(jìn)而提高土壤的穩(wěn)定性和通透性，打破土壤板結(jié)和硬化，綠色木霉還可分泌豐富的胞外高分子多糖和糖蛋白及高活性的特殊酶系，調(diào)節(jié)土壤酸堿平衡，促進(jìn)土壤釋放養(yǎng)分、促進(jìn)植物根系對營養(yǎng)成分的吸收。根據(jù)本發(fā)明所述的復(fù)合生物制劑，其中，所述混合發(fā)酵是將葡枝根霉的孢子懸浮液和綠色木霉的孢子懸浮液按照一定重量比例同時(shí)接種到發(fā)酵罐中進(jìn)行液體深層發(fā)酵。根據(jù)本發(fā)明所述的復(fù)合生物制劑，其中，所述葡枝根霉的孢子懸浮液按照如下方法制備：首先，用接種環(huán)將冷藏保存的菌種接種于平板pda培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接3代；然后用接種環(huán)挑取邊緣菌絲轉(zhuǎn)接于pdb培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為20℃～35℃，培養(yǎng)時(shí)間為5～15天，發(fā)酵液過濾得到葡枝根霉的孢子懸浮液，活孢子濃度為(5～9)×108個(gè)/ml。根據(jù)本發(fā)明所述的復(fù)合生物制劑，其中，所述pda培養(yǎng)基為：馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂18g，蒸餾水1000ml。根據(jù)本發(fā)明所述的復(fù)合生物制劑，其中，所述pdb培養(yǎng)基為：馬鈴薯200g，蔗糖20g，蒸餾水1000ml。根據(jù)本發(fā)明所述的復(fù)合生物制劑，其中，所述培養(yǎng)溫度優(yōu)選為22℃～32℃，更優(yōu)選為25℃～30℃，以及最優(yōu)選為28℃。根據(jù)本發(fā)明所述的復(fù)合生物制劑，其中，所述培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為6～14天，更優(yōu)選為7～13天，更加優(yōu)選為8～12天，以及最優(yōu)選為10天。根據(jù)本發(fā)明所述的復(fù)合生物制劑，其中，所述過濾為100μm篩過濾。根據(jù)本發(fā)明所述的復(fù)合生物制劑，其中，所述綠色木霉的孢子懸浮液按照如下方法制備：首先，用接種環(huán)將冷藏保存的菌種接種于平板pda培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接3代；然后用接種環(huán)挑取邊緣菌絲轉(zhuǎn)接于pdb培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為20℃～35℃，培養(yǎng)時(shí)間為5～15天，發(fā)酵液過濾得到綠色木霉的孢子懸浮液，活孢子濃度為(5～9)×108個(gè)/ml。根據(jù)本發(fā)明所述的復(fù)合生物制劑，其中，所述pda培養(yǎng)基為：馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂18g，蒸餾水1000ml。根據(jù)本發(fā)明所述的復(fù)合生物制劑，其中，所述pdb培養(yǎng)基為：馬鈴薯200g，蔗糖20g，蒸餾水1000ml。根據(jù)本發(fā)明所述的復(fù)合生物制劑，其中，所述培養(yǎng)溫度優(yōu)選為22℃～32℃，更優(yōu)選為25℃～30℃，以及最優(yōu)選為28℃。根據(jù)本發(fā)明所述的復(fù)合生物制劑，其中，所述培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為6～14天，更優(yōu)選為7～13天，更加優(yōu)選為8～12天，以及最優(yōu)選為10天。根據(jù)本發(fā)明所述的復(fù)合生物制劑，其中，所述過濾為100μm篩過濾。根據(jù)本發(fā)明所述的復(fù)合生物制劑，其中，所述發(fā)酵罐盛有pdb培養(yǎng)基或麩皮培養(yǎng)基；所述液體深層發(fā)酵的溫度為25℃～35℃，優(yōu)選為28℃～32℃，以及最優(yōu)選為30℃；所述液體深層發(fā)酵的時(shí)間為24h～20天，優(yōu)選為36h～15天，更優(yōu)選為48h～12天，以及最優(yōu)選為48h～10天。根據(jù)本發(fā)明所述的復(fù)合生物制劑，其中，所述pdb培養(yǎng)基為：馬鈴薯200g，蔗糖20g，蒸餾水1000ml。根據(jù)本發(fā)明所述的復(fù)合生物制劑，其中，所述葡枝根霉的孢子懸浮液和綠色木霉的孢子懸浮液的重量比例為1：1至1：10。優(yōu)選地，所述葡枝根霉的孢子懸浮液和綠色木霉的孢子懸浮液的重量比例為1：2至1：8；更優(yōu)選地，所述葡枝根霉的孢子懸浮液和綠色木霉的孢子懸浮液的重量比例為1：3至1：6；以及，最優(yōu)選地，所述葡枝根霉的孢子懸浮液和綠色木霉的孢子懸浮液的重量比例為1：4。根據(jù)本發(fā)明所述的復(fù)合生物制劑，應(yīng)用形式為土壤改良劑、生物肥料、葉面噴劑或根部噴劑。在上述產(chǎn)品中，優(yōu)選進(jìn)一步包含作物營養(yǎng)成分。根據(jù)本發(fā)明所述的復(fù)合生物制劑，其中，所述作物營養(yǎng)成分包括，但不限于，水溶性甲殼素、黃腐酸鉀和腐熟有機(jī)質(zhì)的任意一種或多種。其中，水溶性甲殼素具有“植物疫苗”的稱號(hào)，連續(xù)使用可誘導(dǎo)農(nóng)作物自身產(chǎn)生對病害的抗性因子，降低病害發(fā)生率，顯著減少農(nóng)藥使用量。此外還有極強(qiáng)葉面附著性能，可促根壯苗，促進(jìn)果實(shí)成熟。水溶性甲殼素的分子量m為(1～5)×105，黏度100～200mpas，脫乙酯度dac≥90％，純度≥90％。黃腐酸鉀具有高負(fù)載量及生理活性，其螯合常量及微量營養(yǎng)物質(zhì)可以使其更好地為植物利用，激發(fā)植物微觀生物活性，能夠緩釋肥料，提高植物對營養(yǎng)的吸收，促進(jìn)植物發(fā)芽生長，加速沉淀分解，增強(qiáng)抗?jié)承?。甲殼素和黃腐酸鉀以其不同的結(jié)構(gòu)形態(tài)進(jìn)行螯合，起到相互促進(jìn)作用，更有利于土壤結(jié)構(gòu)的改善。黃腐酸鉀規(guī)格為：細(xì)度＜120目，水可溶物＞99.7wt％，水溶性黃腐酸＞50wt％，氧化鉀9.5-10wt％，氮2.5-3.0wt％，磷0.5-0.8wt％，有機(jī)質(zhì)50-60wt％。腐熟有機(jī)質(zhì)同樣是本領(lǐng)域熟知的作物營養(yǎng)成分。為提高本制劑在施用初期的萌發(fā)率，可適當(dāng)添加常用腐熟有機(jī)質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明所述的復(fù)合生物制劑，其中，當(dāng)包含所述作物營養(yǎng)成分時(shí)，有利地，所述作物營養(yǎng)成分為復(fù)合生物制劑重量的2～20wt％。在一個(gè)實(shí)施方式中，基于復(fù)合生物制劑的總重量計(jì)，所述匍枝根霉和綠色木霉的混合發(fā)酵液為70～98wt％，水溶性甲殼素為0.5～2wt％，黃腐酸鉀為0.5～2wt％。根據(jù)本發(fā)明所述的復(fù)合生物制劑使用量為視其地力一般為100～5000ml/畝，優(yōu)選為200～4500ml/畝，更優(yōu)選為300～4000ml/畝，更加優(yōu)選為400～3000ml/畝，以及最優(yōu)選為500～2500ml/畝。另一方面，本發(fā)明還提供了所述的復(fù)合生物制劑在防治土傳病害優(yōu)選是枯萎病或黃萎病的用途。根據(jù)本發(fā)明所述的用途，其中，所述土傳病害優(yōu)選為鏈格孢屬真菌導(dǎo)致的土傳病害。根據(jù)本發(fā)明所述的用途，其中，所述土傳病害選自番茄枯萎病、蘋果褐斑病、甜瓜葉斑病、西葫蘆葉斑病、卷心菜黑斑病、煙草赤星病、人參鏈格孢菌、小麥葉斑病、大白菜黑斑病、馬鈴薯早疫病、番茄早疫病、花椒早疫病、茄子早疫病、龍葵早疫病、鴨梨黑斑病、葡萄穗軸褐枯病、杏果實(shí)黑斑病、櫻桃黑色輪斑病、棉花黃萎病、茄子黃萎病。根據(jù)本發(fā)明所述的用途，其中，使用時(shí)，將上述復(fù)合生物制劑稀釋成適宜濃度，定植前噴于土壤表面后翻耕，或者灌根，或者噴施于作物葉面。根據(jù)本發(fā)明所述的用途，其中，所述稀釋倍數(shù)為100～500倍。優(yōu)選地，所述稀釋倍數(shù)為100～400倍；更優(yōu)選地，稀釋倍數(shù)為100～300倍；以及，最優(yōu)選地，所述稀釋倍數(shù)為100～200倍。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，在液體深層發(fā)酵后，取混合發(fā)酵液中一小塊菌絲體接種于pda平板上，28℃培養(yǎng)4天后發(fā)現(xiàn)既出現(xiàn)了葡枝根霉的白色菌絲和黑色孢子，也出現(xiàn)了綠色木霉的菌絲和綠色孢子。這證明混合發(fā)酵后兩種真菌在發(fā)酵液中均存活。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，在液體深層發(fā)酵后，取混合發(fā)酵液中一小塊菌絲體在400倍顯微鏡下觀察，并與葡枝根霉和綠色木霉單獨(dú)發(fā)酵液中的菌絲進(jìn)行對比。結(jié)果表明，混合發(fā)酵液中的菌絲更加致密，產(chǎn)孢子量更多。這種現(xiàn)象可能是因?yàn)槠现Ω沟募尤雽?dǎo)致綠色木霉生長繁殖加快，并產(chǎn)生次生代謝物。高效液相色譜法(hplc)證實(shí)了上述結(jié)果。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有下列有益技術(shù)效果：(1)本發(fā)明的復(fù)合生物制劑具有穩(wěn)定、定殖能力強(qiáng)的特點(diǎn)，并且利用微生物之間的協(xié)同作用，不僅導(dǎo)致混合發(fā)酵液相對于單獨(dú)發(fā)酵液或者單獨(dú)發(fā)酵液的簡單混合產(chǎn)生了質(zhì)變(產(chǎn)生新的或更多的拮抗物質(zhì))，同時(shí)也產(chǎn)生了量變(菌絲更加致密，產(chǎn)孢子量更多)，進(jìn)而提高植物病害的防治效果；(2)本發(fā)明的復(fù)合生物制劑在液體深層發(fā)酵過程中兩種微生物繁殖速度很快且具有極高的胞外分泌活性，不僅實(shí)現(xiàn)了單純復(fù)合無法達(dá)到的技術(shù)效果，同時(shí)也實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模化生產(chǎn)，大幅度的減輕了勞動(dòng)投入，并可以快速獲得大量菌體和孢子，降低了生產(chǎn)成本，使用方便；(3)與肥料組分一起使用時(shí)，本發(fā)明的復(fù)合生物制劑能夠改善土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)植物根系的生長，增強(qiáng)根系對營養(yǎng)成分的吸收能力，并且可與土壤微粒牢固地附著和纏繞，提高土壤穩(wěn)定性和孔隙度；(4)本發(fā)明的復(fù)合生物制劑對鏈格孢屬真菌具有較強(qiáng)的殺菌活性，因此可以有效防治枯萎病或黃萎病等土傳病害。附圖說明圖1是本發(fā)明實(shí)施例1與比較例1-2所得發(fā)酵液的hplc圖譜(自上向下依次為：實(shí)施例1、比較例2和比較例1)。圖2是實(shí)施例1-3和比較例1-2所得樣品對蘋果鏈格孢菌抑制效果圖(圖2-1：對照組；圖2-2：比較例1；圖2-3：比較例2；圖2-4：實(shí)施例2；圖2-5：實(shí)施例1；圖2-6：實(shí)施例3)。圖3是本發(fā)明實(shí)施例1和比較例1-2發(fā)酵液中的菌絲體在400倍顯微鏡下觀察所得圖像(左右為一對，由下至上依次為實(shí)施例1、比較例1和比較例2)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施方式僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。通過下述實(shí)施方式將有助于理解本發(fā)明，但不能限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1：葡枝根霉的孢子懸浮液按照如下方法制備：首先，用接種環(huán)將冷藏保存的菌種接種于平板pda培養(yǎng)基，所述pda培養(yǎng)基為：馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂18g，蒸餾水1000ml，轉(zhuǎn)接3代；然后用接種環(huán)挑取邊緣菌絲轉(zhuǎn)接于pdb培養(yǎng)基中，所述pdb培養(yǎng)基為：馬鈴薯200g，蔗糖20g，蒸餾水1000ml，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為10天，發(fā)酵液過濾得到葡枝根霉的孢子懸浮液，活孢子濃度為(5～9)×108個(gè)/ml。所述綠色木霉的孢子懸浮液按照如下方法制備：首先，用接種環(huán)將冷藏保存的菌種接種于平板pda培養(yǎng)基，所述pda培養(yǎng)基為：馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂18g，蒸餾水1000ml，轉(zhuǎn)接3代；然后用接種環(huán)挑取邊緣菌絲轉(zhuǎn)接于pdb培養(yǎng)基中，所述pdb培養(yǎng)基為：馬鈴薯200g，蔗糖20g，蒸餾水1000ml，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為10天，發(fā)酵液過濾得到綠色木霉的孢子懸浮液，活孢子濃度為(5～9)×108個(gè)/ml。將葡枝根霉的孢子懸浮液和綠色木霉的孢子懸浮液按照重量比例1：4同時(shí)接種到發(fā)酵罐中進(jìn)行液體深層發(fā)酵；所述發(fā)酵罐盛有pdb培養(yǎng)基；所述pdb培養(yǎng)基為：馬鈴薯200g，蔗糖20g，蒸餾水1000ml；所述液體深層發(fā)酵的溫度為30℃；所述液體深層發(fā)酵的時(shí)間為48h。最終得到本發(fā)明實(shí)施例1的復(fù)合生物制劑。取發(fā)酵液中一小塊菌絲體在400倍顯微鏡下觀察，結(jié)果參見圖1?？咕钚圆捎脤χ艑?shí)驗(yàn)測定，具體方法如下：在超凈工作臺(tái)上將蘋果鏈格孢菌用滅菌后的接種器(φ5mm)接種到pda培養(yǎng)基的一側(cè)，同時(shí)將實(shí)施例1的復(fù)合生物制劑接種到pda培養(yǎng)基的另一側(cè)，28℃恒溫培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)三到四個(gè)平行，觀察記錄抑制效果，用十字交叉法測量蘋果鏈格孢菌的菌落半徑，以只接種蘋果鏈格孢菌的平板作對照。28℃恒溫培養(yǎng)5-6天后，計(jì)算生防微生物對蘋果鏈格孢菌的抑菌率，計(jì)算方法如下：抑菌率(％)＝[(對照組菌落半徑-實(shí)驗(yàn)組菌落半徑)/對照組菌落半徑]×100。結(jié)果參見圖2。用濾紙過濾本發(fā)明實(shí)施例1的復(fù)合生物制劑，5000r/min離心，收集上清液。用濾器(濾膜φ0.22um)過濾，然后用所得發(fā)酵液和固體pda培養(yǎng)基按照1:1的比例混合均勻，倒入培養(yǎng)皿中。用滅菌的打孔器制成蘋果鏈格孢菌菌餅接種到含發(fā)酵液的培養(yǎng)基中央(每皿一塊菌餅，菌絲面朝下)每個(gè)處理設(shè)3-4個(gè)平行，并設(shè)對照組。28℃恒溫培養(yǎng)5-6天后，用十字交叉法測菌落直徑，計(jì)算真菌菌絲生長相對抑制率，比較抑制結(jié)果。計(jì)算公式如下：相對抑制率(％)＝(對照組菌落平均直徑-實(shí)驗(yàn)組菌落平均直徑)/(對照組菌落平均直徑-菌餅直徑)×100。結(jié)果參見表1。將一部分實(shí)施例1的復(fù)合生物制劑經(jīng)離心過濾去除固體雜質(zhì)后進(jìn)行濃縮、凈化，得到色譜分析樣品。用高效液相色譜法對樣品進(jìn)行分析。結(jié)果參見圖3。實(shí)施例2：將葡枝根霉的孢子懸浮液和綠色木霉的孢子懸浮液按照重量比例1：1同時(shí)接種到發(fā)酵罐中進(jìn)行液體深層發(fā)酵；其余步驟和工藝參數(shù)同實(shí)施例1。最終得到本發(fā)明實(shí)施例2的復(fù)合生物制劑。按照與實(shí)施例1相同的方法測定其對蘋果鏈格孢菌的抑菌率和相對抑制率(％)。結(jié)果參見圖2和表1。實(shí)施例3：將葡枝根霉的孢子懸浮液和綠色木霉的孢子懸浮液按照重量比例1：9同時(shí)接種到發(fā)酵罐中進(jìn)行液體深層發(fā)酵；其余步驟和工藝參數(shù)同實(shí)施例1。最終得到本發(fā)明實(shí)施例3的復(fù)合生物制劑。按照與實(shí)施例1相同的方法測定其對蘋果鏈格孢菌的抑菌率和相對抑制率(％)。結(jié)果參見圖2和表1。比較例1：葡枝根霉的孢子懸浮液按照如下方法制備：首先，用接種環(huán)將冷藏保存的菌種接種于平板pda培養(yǎng)基，所述pda培養(yǎng)基為：馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂18g，蒸餾水1000ml，轉(zhuǎn)接3代；然后用接種環(huán)挑取邊緣菌絲轉(zhuǎn)接于pdb培養(yǎng)基中，所述pdb培養(yǎng)基為：馬鈴薯200g，蔗糖20g，蒸餾水1000ml，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為10天，發(fā)酵液過濾得到葡枝根霉的孢子懸浮液，活孢子濃度為(5～9)×108個(gè)/ml。將葡枝根霉的孢子懸浮液接種到發(fā)酵罐中進(jìn)行液體深層發(fā)酵；所述發(fā)酵罐盛有pdb培養(yǎng)基；所述pdb培養(yǎng)基為：馬鈴薯200g，蔗糖20g，蒸餾水1000ml；所述液體深層發(fā)酵的溫度為30℃；所述液體深層發(fā)酵的時(shí)間為48h。最終得到比較例1的復(fù)合生物制劑。按照與實(shí)施例1相同的方法測定其對蘋果鏈格孢菌的抑菌率和相對抑制率(％)；并且按照與實(shí)施例1相同的方法用高效液相色譜法對樣品進(jìn)行分析。結(jié)果參見圖1-3和表1。比較例2：所述綠色木霉的孢子懸浮液按照如下方法制備：首先，用接種環(huán)將冷藏保存的菌種接種于平板pda培養(yǎng)基，所述pda培養(yǎng)基為：馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂18g，蒸餾水1000ml，轉(zhuǎn)接3代；然后用接種環(huán)挑取邊緣菌絲轉(zhuǎn)接于pdb培養(yǎng)基中，所述pdb培養(yǎng)基為：馬鈴薯200g，蔗糖20g，蒸餾水1000ml，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為10天，發(fā)酵液過濾得到綠色木霉的孢子懸浮液，活孢子濃度為(5～9)×108個(gè)/ml。將綠色木霉的孢子懸浮液接種到發(fā)酵罐中進(jìn)行液體深層發(fā)酵；所述發(fā)酵罐盛有pdb培養(yǎng)基；所述pdb培養(yǎng)基為：馬鈴薯200g，蔗糖20g，蒸餾水1000ml；所述液體深層發(fā)酵的溫度為30℃；所述液體深層發(fā)酵的時(shí)間為48h。最終得到比較例2的復(fù)合生物制劑。按照與實(shí)施例1相同的方法測定其對蘋果鏈格孢菌的抑菌率和相對抑制率(％)；并且按照與實(shí)施例1相同的方法用高效液相色譜法對樣品進(jìn)行分析。結(jié)果參見圖1-3和表1。比較例3：葡枝根霉的孢子懸浮液按照如下方法制備：首先，用接種環(huán)將冷藏保存的菌種接種于平板pda培養(yǎng)基，所述pda培養(yǎng)基為：馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂18g，蒸餾水1000ml，轉(zhuǎn)接3代；然后用接種環(huán)挑取邊緣菌絲轉(zhuǎn)接于pdb培養(yǎng)基中，所述pdb培養(yǎng)基為：馬鈴薯200g，蔗糖20g，蒸餾水1000ml，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為10天，發(fā)酵液過濾得到葡枝根霉的孢子懸浮液，活孢子濃度為(5-9)×108個(gè)/ml。所述綠色木霉的孢子懸浮液按照如下方法制備：首先，用接種環(huán)將冷藏保存的菌種接種于平板pda培養(yǎng)基，所述pda培養(yǎng)基為：馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂18g，蒸餾水1000ml，轉(zhuǎn)接3代；然后用接種環(huán)挑取邊緣菌絲轉(zhuǎn)接于pdb培養(yǎng)基中，所述pdb培養(yǎng)基為：馬鈴薯200g，蔗糖20g，蒸餾水1000ml，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為10天，發(fā)酵液過濾得到綠色木霉的孢子懸浮液，活孢子濃度為(5～9)×108個(gè)/ml。將葡枝根霉的孢子懸浮液和綠色木霉的孢子懸浮液按照重量比例1：4簡單混合，得到比較例3的復(fù)合生物制劑。按照與實(shí)施例1相同的方法測定其對蘋果鏈格孢菌的抑菌率和相對抑制率(％)。結(jié)果參見表1。圖1是本發(fā)明實(shí)施例1與比較例1-2所得發(fā)酵液的hplc圖譜(自上向下依次為：實(shí)施例1、比較例2和比較例1)。從圖1可以看出，本發(fā)明實(shí)施例1的混合發(fā)酵不是單一微生物發(fā)酵成分的簡單加合，而是有新物質(zhì)的產(chǎn)生。這種現(xiàn)象可能是因?yàn)槠现Ω沟募尤雽?dǎo)致綠色木霉生長繁殖加快，并產(chǎn)生次生代謝物。圖1充分反映出本發(fā)明的復(fù)合生物制劑的質(zhì)變現(xiàn)象。發(fā)明人還測定了比較例3所得發(fā)酵液的hplc曲線，出峰位置與比較例1和2一致性極高，基本相當(dāng)于后者的簡單疊加。圖2是實(shí)施例1-3和比較例1-2所得樣品對蘋果鏈格孢菌抑制效果圖(圖2-1：對照組；圖2-2：比較例1；圖2-3：比較例2；圖2-4：實(shí)施例2；圖2-5：實(shí)施例1；圖2-6：實(shí)施例3)。從圖中可以看出，相對于對照組，盡管葡枝根霉和綠色木霉對蘋果鏈格孢菌均有不同程度的抑制效果；然而，本發(fā)明實(shí)施例1-3的復(fù)合生物制劑對蘋果鏈格孢菌的抑制效果顯著更優(yōu)。表1是實(shí)施例1-3和比較例1-3所得樣品原液隨著時(shí)間變化對蘋果鏈格孢菌的抑菌率。表1時(shí)間/天23456實(shí)施例157.0％58.8％57.2％56.4％55.9％實(shí)施例263.2％65.7％67.1％65.5％66.3％實(shí)施例357.4％57.1％56.8％56.6％56.1％比較例153.9％51.7％53.2％51.4％51.0％比較例214.7％7.6％13.3％15.4％16.8％比較例352.2％51.5％50.5％51.1％52.0％從表1可以看出，本發(fā)明實(shí)施例1-3的混合發(fā)酵液不僅比比較例1-2的單獨(dú)發(fā)酵液的抑菌能力強(qiáng)，而且比比較例3的單獨(dú)發(fā)酵液簡單混合的抑菌能力強(qiáng)。而且，在實(shí)施例2中，葡枝根霉的孢子懸浮液和綠色木霉的孢子懸浮液的混合比例為1：4時(shí)，所得復(fù)合生物制劑對蘋果鏈格孢菌的抑菌率最高。圖3是本發(fā)明實(shí)施例1和比較例1-2發(fā)酵液中的菌絲體在400倍顯微鏡下觀察所得圖像(左右為一對，由下至上依次為實(shí)施例1、比較例1和比較例2)。結(jié)果表明，與葡枝根霉和綠色木霉單獨(dú)發(fā)酵液中的菌絲相比，本發(fā)明實(shí)施例1混合發(fā)酵液中的菌絲更加致密，產(chǎn)孢子量更多。這種現(xiàn)象可能是因?yàn)槠现Ω沟募尤雽?dǎo)致綠色木霉生長繁殖加快，并產(chǎn)生次生代謝物。這與前面的hplc結(jié)果一致。圖3充分反映出本發(fā)明的復(fù)合生物制劑的量變現(xiàn)象。從以上結(jié)果可以看出，本發(fā)明將葡枝根霉的孢子懸浮液和綠色木霉的孢子懸浮液按照一定重量比例同時(shí)接種到發(fā)酵罐中進(jìn)行液體深層發(fā)酵，不僅導(dǎo)致混合發(fā)酵液相對于單獨(dú)發(fā)酵液或者單獨(dú)發(fā)酵液的簡單混合產(chǎn)生了質(zhì)變(產(chǎn)生新的或更多的拮抗物質(zhì))，同時(shí)也產(chǎn)生了量變(菌絲更加致密，產(chǎn)孢子量更多)。這種質(zhì)變和量變導(dǎo)致本發(fā)明所得復(fù)合生物制劑對蘋果鏈格孢菌的抑菌效果顯著提高。也就是說，本發(fā)明的復(fù)合生物制劑不僅體現(xiàn)了葡枝根霉和綠色木霉的協(xié)同效應(yīng)，而且體現(xiàn)出混合液體深層發(fā)酵的獨(dú)特效果。這種效果是單獨(dú)的微生物菌株所無法達(dá)到的，并且也不是兩種微生物菌株效果的簡單疊加。在液體深層發(fā)酵過程中的兩種微生物繁殖速度很快且具有極高的胞外分泌活性，利用液體深層發(fā)酵技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了單純復(fù)合無法達(dá)到的技術(shù)效果，同時(shí)也實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模化生產(chǎn)，大幅度的減輕了勞動(dòng)投入，并可以快速獲得大量菌體和孢子，降低了生產(chǎn)成本，使用方便。進(jìn)一步地，本發(fā)明通過將80重量份的實(shí)施例2的復(fù)合生物制劑與2重量份的水溶性甲殼素和2重量份的黃腐酸鉀制成土壤改良劑1，使其用于作物生長，研究該土壤改良劑對改善土壤的理化性質(zhì)和枯萎病防治效果的影響。試驗(yàn)實(shí)施例1試驗(yàn)組1為施用1000ml/畝的本發(fā)明土壤改良劑1(稀釋100倍)，試驗(yàn)組2為施用1000ml/畝的含相同有效孢子數(shù)量的單一綠色木霉發(fā)酵液制劑，翻耕前均勻噴施于土壤表面，對照組噴灑等量清水，后續(xù)追肥處理相同，小區(qū)面積100㎡，小麥?zhǔn)斋@后測定計(jì)算土壤理化性質(zhì)。結(jié)果如表2所示。表2土壤容重(g/cm3)ph對照組1.775.2試驗(yàn)組11.426.7試驗(yàn)組21.496.2結(jié)果表明，施用本發(fā)明土壤改良劑1和綠色木霉菌制劑后相對于對照組土壤容重下降，ph值接近中性，土壤酸化狀況得到逆轉(zhuǎn)，適于作物生長，土壤改良劑1的效果優(yōu)于單一綠色木霉菌制劑。試驗(yàn)實(shí)施例2試驗(yàn)組1為定植前土壤表面噴灑1000ml/畝的本發(fā)明土壤改良劑1(稀釋100倍)，試驗(yàn)組2噴施等量具有相同有效菌體數(shù)量的現(xiàn)有綠色木霉菌和枯草芽孢桿菌復(fù)合制劑，對照組噴施等量清水。由于土壤中的微生物不僅可以調(diào)節(jié)植株生長，而且在土壤肥力的保持和提高以及能量轉(zhuǎn)化和物質(zhì)循環(huán)等方面具有重要作用，因此是土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)。結(jié)果如表3所示。表3放線菌(cfu/g)細(xì)菌(cfu/g)真菌(cfu/g)對照組3.4×1062.3×1063.9×103試驗(yàn)組14.5×1066.7×1064.2×104試驗(yàn)組23.7×1064.2×1066.3×103結(jié)果表明，本發(fā)明土壤改良劑1和相同有效菌體數(shù)量的綠色木霉菌和枯草芽孢桿菌復(fù)合制劑相比于對照組處理均提高了土壤中微生物數(shù)量，增加了微生物多樣性，且本發(fā)明土壤改良劑1對細(xì)菌和真菌的數(shù)量提升最為顯著，明顯高于試驗(yàn)組2。試驗(yàn)實(shí)施例3挑選160棵大小相同、長勢一致的番茄植株，分為四組同時(shí)接種枯萎病原菌。試驗(yàn)組1和2分別用稀釋100倍、200倍的本發(fā)明土壤改良劑1進(jìn)行噴施，對照組噴施含相同有效菌體數(shù)量的枯草芽孢桿菌單一菌種的制劑。結(jié)果如表4所示。表4發(fā)病率(％)病指(％)防治效果(％)對照組2394.6試驗(yàn)組18885.3試驗(yàn)組2202066.4結(jié)果表明，與普通枯草芽孢桿菌制劑相比，本發(fā)明的生物制劑對枯萎病的防治效果顯著提高，其中100倍液防治效果最佳，其次為200倍液。以上田間試驗(yàn)實(shí)施例結(jié)果表明，與肥料組分一起使用時(shí)，本發(fā)明的復(fù)合生物制劑能夠改善土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)植物根系的生長，增強(qiáng)根系對營養(yǎng)成分的吸收能力，并且可與土壤微粒牢固地附著和纏繞，提高土壤穩(wěn)定性和孔隙度；此外，本發(fā)明的復(fù)合生物制劑可以有效防治枯萎病或黃萎病等土傳病害。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12