本發(fā)明屬于惡性腫瘤技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種抑制hif-1α的抗腫瘤候選藥物及制備方法。

背景技術(shù)：

腫瘤是一種常見且發(fā)生頻繁的疾病，其中惡性腫瘤目前對(duì)人類健康具有最嚴(yán)重的危害。血管為腫瘤生長(zhǎng)和存活提供足夠了的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并消除代謝廢物。因此，腫瘤血管靶向治療成為有效的腫瘤治療策略。腫瘤血管抑制劑的研究進(jìn)展上世紀(jì)70年代初，folkman首次提出，腫瘤新生血管對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)及擴(kuò)散起重要作用。bergers等進(jìn)一步的研究也表明:腫瘤細(xì)胞在增殖和轉(zhuǎn)移過程中需新生血管及功能性血管的支持；而且，近年來的大量研究已證實(shí):腫瘤的生長(zhǎng)與生存均需由血管提供充足的氧氣和養(yǎng)分，并排除代謝廢物，若無血管及新生血管的支持，腫瘤的生長(zhǎng)不會(huì)超過2mm，因此，腫瘤血管靶向療法應(yīng)運(yùn)而生，成為一種有效的腫瘤治療策略。與選擇性差、毒性大且易產(chǎn)生耐藥性的傳統(tǒng)抗腫瘤藥物不同，腫瘤血管靶向療法具有選擇性強(qiáng)、毒性小、抗瘤譜廣等諸多優(yōu)勢(shì)，能直接作用于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制依賴于血管系統(tǒng)的各類腫瘤生長(zhǎng)。此外，靶向血管治療對(duì)機(jī)體的正常生理功能影響很小，且相對(duì)于正常組織血管而言，腫瘤血管結(jié)構(gòu)不完整，內(nèi)皮細(xì)胞處于增殖狀態(tài)，更易遭受血管靶向藥物的攻擊。

在臨床用藥中，單獨(dú)使用血管阻斷劑的效果不好，腫瘤在血管阻斷后仍可以存活，認(rèn)為原因可能是warburg效應(yīng)。warburg效應(yīng)是觀察到大多數(shù)癌細(xì)胞在有氧或無氧的情況下主要通過高速率的糖酵解產(chǎn)生能量，而在大多數(shù)正常細(xì)胞產(chǎn)生能量主要通過在線粒體中進(jìn)行有氧呼吸。惡性快速生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞通常具有高達(dá)其正常來源組織的糖酵解速率的200倍的糖酵解速率，即使氧氣充足也會(huì)發(fā)生這種情況。

腫瘤細(xì)胞的能量主要來自糖酵解。缺氧是實(shí)體腫瘤的一個(gè)普遍特征，對(duì)于腫瘤的進(jìn)展起著關(guān)鍵作用。ottowarburg學(xué)者發(fā)現(xiàn)許多腫瘤細(xì)胞即使是在常氧的情況下也產(chǎn)生過多的乳酸，稱之為假缺氧。腫瘤的快速增殖需要持續(xù)的氧與營(yíng)養(yǎng)的供應(yīng)。當(dāng)組織生長(zhǎng)的速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過周圍血管供應(yīng)這些營(yíng)養(yǎng)成分的能力時(shí)，缺氧便應(yīng)運(yùn)而生。缺氧與腫瘤的血管新生、侵襲轉(zhuǎn)移、放化療抵抗和預(yù)后不良等密切相關(guān)。糖酵解途徑產(chǎn)生的丙酮酸可直接進(jìn)入三羧酸循環(huán)途徑或者由乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，ldh)轉(zhuǎn)化為乳酸。在葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑生成乳酸的過程中，hk、pfk、pk和ldh等關(guān)鍵代謝酶與腫瘤有關(guān)，且受到致癌因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中轉(zhuǎn)錄因子如乏氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxiainduciblefactor-1α，hif-1α)等的調(diào)控。(1)低氧誘導(dǎo)因子抑制劑低氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-induciblefactor1，hif-1)是缺氧效應(yīng)調(diào)控中最為關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。.hif-1在實(shí)體腫瘤組織內(nèi)選擇性持續(xù)高表達(dá)，下游關(guān)鍵調(diào)控基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如促進(jìn)血管生成、細(xì)胞存活、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、代謝重塑以及ph穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。缺氧時(shí)糖酵解是腫瘤細(xì)胞獲得能量的一個(gè)重要手段。hif-1α通過與靶基因上的dna結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，誘導(dǎo)糖酵解酶類基因的表達(dá)，增加糖酵解，促進(jìn)無氧代謝，故有利于腫瘤細(xì)胞在缺氧下的生存。影響hif-1α的合成及降解的藥物黃酮類化合物白楊素通過增加其脯氨酰羥化增加的泛素化和降解hif-1α。此外，白楊素之間的相互干擾hif-1α和熱休克蛋白90。白楊素也被發(fā)現(xiàn)通過akt信號(hào)途徑抑制hif-1α的表達(dá)。白楊素可通過抑制hif-1α抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)水平。mirzoeva等發(fā)現(xiàn)，在人前列腺癌細(xì)胞系pc3-m中，芹菜素下調(diào)hif-1α的mrna和蛋白表達(dá)水平，并降低其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，進(jìn)而阻止hif-1下游靶基因vegf的激活，下調(diào)vegf的mrna和蛋白表達(dá)水平，抑制前列腺癌新生血管的形成。liu等也發(fā)現(xiàn)，金合歡素(acacetin)雖然對(duì)hif-1αmrna的表達(dá)水平?jīng)]有明顯影響，但通過下調(diào)其蛋白表達(dá)水平而抑制vegf的激活，從而阻止卵巢癌新生血管形成，并且這種對(duì)vegf的抑制作用可以通過過表達(dá)hif-1α而消除。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種抑制hif-1α抗腫瘤候選藥物其制備方法，旨在解決在臨床用藥中，單獨(dú)使用血管阻斷劑的效果不好，腫瘤血管阻斷后仍可以存活的問題。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種抑制hif-1α抗腫瘤候選藥物，所述抑制hif-1α抗腫瘤候選藥物具有如下通式：

本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述抑制hif-1α抗腫瘤候選藥物的制備方法，所述抑制hif-1α抗腫瘤候選藥物的制備方法包括以下步驟：

步驟一，在250ml圓底燒瓶中依次加入白楊素，無水碳酸鉀及丙酮，加熱攪拌回流，再逐滴加入1，2-二溴乙烷或1，3-二溴丙烷或1，4-二溴丁烷，60℃加熱冷凝回流，溶液變澄清再變渾濁；檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，柱色譜純化，洗脫劑為：甲醇：二氯甲烷＝1:50；

步驟二，在250ml三口燒瓶中加入苯并咪唑衍生物，使其溶于100ml丙酮，加入碳酸鉀，攪拌10min后，加入步驟一所得純化的白楊素衍生物，四丁基溴化銨，加熱至60℃攪拌反應(yīng)，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水洗，然后用無水硫酸鈉干燥，溶劑減壓蒸干后用硅膠柱分離即得到目標(biāo)化合物，洗脫劑為：甲醇：二氯甲烷＝1:50。

進(jìn)一步，所述步驟一中：在250ml圓底燒瓶中依次加入白楊素2.54g，0.01(已改)mol，無水碳酸鉀5.52g，0.04mol及丙酮100ml；1，2-二溴乙烷或1，3-二溴丙烷或1，4-二溴丁烷0.04mol。

進(jìn)一步，所述步驟二中：在250ml圓底燒瓶中依次加入苯并咪唑衍生物0.015mol，無水碳酸鉀5.52g，0.04mol，步驟一所得純化的白楊素衍生物0.01mol，四丁基溴化銨0.03g，0.0001mol及丙酮100ml。

本發(fā)明提供的抑制hif-1α抗腫瘤候選藥物及其制備方法，擬設(shè)計(jì)合成化合物能抑制腫瘤細(xì)胞的糖酵解能力，糖酵解抑制以低氧誘導(dǎo)因子1α為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成以黃酮天然化合物為母核，修飾苯并咪唑衍生物合成系列白楊素衍生物，采用體外抗腫瘤活性、靶點(diǎn)蛋白的抑制水平進(jìn)行篩選，篩選出作用于抑制低氧誘導(dǎo)因子1α的化合物。挑選出作用于抑制糖酵解的候選藥物，為治療腫瘤提供潛在的新的候選藥物。從降低腫瘤細(xì)胞糖酵解方面，最重要的為hif-1α，hif-1α抑制劑的種類很多，發(fā)現(xiàn)抑制hif-1α合成的抑制劑中發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物和苯并咪唑類化合物，且最早發(fā)現(xiàn)的血管阻斷劑為醋酸黃酮，所以擬以黃酮為母核結(jié)構(gòu)，另一側(cè)引入苯并咪唑或苯并咪唑衍生物，合成期望能通過抑制hif-1α而抑制糖酵解。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的抑制hif-1α抗腫瘤候選藥物的制備方法流程圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。

本發(fā)明實(shí)施例提供的抑制hif-1α抗腫瘤候選藥物具有如下通式：

如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例提供的抑制hif-1α抗腫瘤候選藥物的制備方法包括以下步驟：

s101：在250ml圓底燒瓶中依次加入白楊素(2.54g，0.01mol)，無水碳酸鉀(5.52g，0.04mol)及丙酮(100ml)，加熱攪拌回流，再逐滴加入1，2-二溴乙烷或1，3-二溴丙烷或1，4-二溴丁烷(0.04mol)，60℃加熱冷凝回流，溶液變澄清再變渾濁。tcl(薄層色譜法)檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，柱色譜純化，洗脫劑為：甲醇：二氯甲烷＝1:50。

s102：在250ml三口燒瓶中加入苯并咪唑衍生物(0.015mol)，使其溶于100ml丙酮，加入碳酸鉀(5.52g，0.04mol)，攪拌10min后，加入步驟一所得純化的白楊素衍生物(0.01mol)，四丁基溴化銨(tbab)(0.03g，0.0001mol)，加熱至60℃攪拌反應(yīng)，(tcl檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程)，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水洗，然后用無水硫酸鈉干燥，溶劑減壓蒸干后用硅膠柱分離即得到目標(biāo)化合物，洗脫劑為：甲醇：二氯甲烷＝1:50。

本發(fā)明實(shí)施例提供的抑制hif-1α抗腫瘤候選藥物的制備方法反應(yīng)方程式如下：

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步的描述。

實(shí)施例1：7-(2-溴乙氧基)-5-羥基-2-苯基-4h-苯并吡喃酮-4-酮

在250ml圓底燒瓶中依次加入白楊素(2.54g，0.01mol)，無水碳酸鉀(5.52g，0.004mol)及丙酮(100ml)，加熱攪拌回流，再逐滴加入1，2-二溴乙烷(0.04mol)，60℃加熱冷凝回流，溶液變澄清再變渾濁。tcl(薄層色譜法)檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，柱色譜純化，洗脫劑為：甲醇：二氯甲烷＝1:50。

實(shí)施例2：7-(3-溴丙氧基)-5-羥基-2-苯基-4h-苯并吡喃酮-4-酮

在250ml圓底燒瓶中依次加入白楊素(2.54g，0.01mol)，無水碳酸鉀(5.52g，0.004mol)及丙酮(100ml)，加熱攪拌回流，再逐滴加入1，3-二溴丙烷(0.04mol)，60℃加熱冷凝回流，溶液變澄清再變渾濁。tcl(薄層色譜法)檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，柱色譜純化，洗脫劑為：甲醇：二氯甲烷＝1:50。

實(shí)施例3：7-(4-溴丁氧基)-5-羥基-2-苯基-4h-苯并吡喃酮-4-酮

在250ml圓底燒瓶中依次加入白楊素(2.54g，0.01mol)，無水碳酸鉀(5.52g，0.004mol)及丙酮(100ml)，加熱攪拌回流，再逐滴加入1，4-二溴丁烷(0.04mol)，60℃加熱冷凝回流，溶液變澄清再變渾濁。tcl(薄層色譜法)檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，柱色譜純化，洗脫劑為：甲醇：二氯甲烷＝1:50。

實(shí)施例4：5-羥基-7-(2-(2-氯-1h-苯并[d]咪唑-1-基)乙氧基)-2-苯基-4h-色烯-4-酮

在100ml三口燒瓶中加入2-氯苯并咪唑(0.0015mol)，使其溶于30ml丙酮，加入碳酸鉀(0.552g，0.004mol)，攪拌10min后，加入實(shí)施例1得到的淡黃色固體7-(2-溴乙氧基)-5-羥基-2-苯基-4h-苯并吡喃酮-4-酮(0.36g，0.001mol)，四丁基溴化銨(tbab)(0.03g，0.0001mol)，加熱至60℃攪拌反應(yīng)，(tcl檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程)，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水洗，然后用無水硫酸鈉干燥，溶劑減壓蒸干后用硅膠柱分離即得到目標(biāo)化合物，洗脫劑為：甲醇：二氯甲烷＝1:50。淡黃色粉末，產(chǎn)率為56％。¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ12.71(s，1h)，7.84(dd，j＝8.1，1.6hz，2h)，7.69(d，j＝7.6hz，1h)，7.55–7.47(m，3h)，7.44(d，j＝7.3hz，1h)，7.37–7.26(m，2h)，6.64(s，1h)，6.39(d，j＝2.2hz，1h)，6.28(d，j＝2.3hz，1h)，4.64(t，j＝5.3hz，2h)，4.37(t，j＝5.4hz，2h)。

實(shí)施例5:5-羥基-7-(2-(5-硝基-1h-苯并[d]咪唑-1-基)乙氧基)-2-苯基-4h-色烯-4-酮

在100ml三口燒瓶中加入6-硝基苯并咪唑(0.0015mol)，使其溶于30ml丙酮，加入碳酸鉀(0.0552g，0.004mol)，攪拌10min后，加入實(shí)施例1得到的淡黃色固體7-(2-溴乙氧基)-5-羥基-2-苯基-4h-苯并吡喃酮-4-酮(0.36g，0.001mol)，四丁基溴化銨(tbab)(0.03g，0.0001mol)，加熱至60℃攪拌反應(yīng)，(tcl檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程)，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水洗，然后用無水硫酸鈉干燥，溶劑減壓蒸干后用硅膠柱分離即得到目標(biāo)化合物，洗脫劑為：甲醇：二氯甲烷＝1:50。淡黃色粉末，產(chǎn)率為52％。¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ12.75(d，j＝3.9hz，1h)，8.74(s，1h)，8.52(s，1h)，8.33–8.18(m，2h)，7.86(dd，j＝13.7，8.3hz，2h)，7.58(d，j＝9.0hz，1h)，7.52(t，j＝8.1hz，2h)，6.65(s，1h)，6.43(dd，j＝17.4，2.2hz，1h)，6.30(s，1h)，4.74–4.64(m，2h)，4.41(dd，j＝10.4，5.3hz，2h)。

實(shí)施例6:5-羥基-7-(2-(5-硝基-1h-苯并[d]咪唑-1-基)丙氧基)-2-苯基-4h-色烯-4-酮

在100ml三口燒瓶中加入6-硝基苯并咪唑(0.0015mol)，使其溶于30ml丙酮，加入碳酸鉀(0.552g，0.004mol)，攪拌10min后，加入實(shí)施例2得到的淡黃色固體7-(3-溴丙氧基)-5-羥基-2-苯基-4h-苯并吡喃酮-4-酮(0.37g，0.001mol)，四丁基溴化銨(tbab)(0.03g，0.0001mol)，加熱至60℃攪拌反應(yīng)，(tcl檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程)，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水洗，然后用無水硫酸鈉干燥，溶劑減壓蒸干后用硅膠柱分離即得到目標(biāo)化合物，洗脫劑為：甲醇：二氯甲烷＝1:50。淡黃色粉末，產(chǎn)率為47％。¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ12.75(d，j＝3.8hz，1h)，8.73(d，j＝2.1hz，1h)，8.41(d，j＝2.1hz，1h)，8.22(dd，j＝13.0，5.8hz，1h)，8.10(d，j＝18.5hz，1h)，7.89–7.83(m，2h)，7.52(dd，j＝15.8，8.4hz，2h)，6.67(d，j＝1.6hz，1h)，6.47(d，j＝2.2hz，1h)，6.41(d，j＝2.2hz，1h)，6.36–6.32(m，1h)，4.57–4.48(m，2h)，4.00(dd，j＝11.8，6.0hz，2h)，2.42(dd，j＝11.1，5.3hz，2h)。

實(shí)施例7:5-羥基-7-(2-(2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-1-基)丙氧基)-2-苯基-4h-色烯-4-酮

在100ml三口燒瓶中加入2-甲基苯并咪唑(0.0015mol)，使其溶于30ml丙酮，加入碳酸鉀(0.552g，0.004mol)，攪拌10min后，加入實(shí)施例2得到的淡黃色固體7-(3-溴丙氧基)-5-羥基-2-苯基-4h-苯并吡喃酮-4-酮(0.37g，0.001mol)，四丁基溴化銨(tbab)(0.03g，0.0001mol)，加熱至60℃攪拌反應(yīng)，(tcl檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程)，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水洗，然后用無水硫酸鈉干燥，溶劑減壓蒸干后用硅膠柱分離即得到目標(biāo)化合物，洗脫劑為：甲醇：二氯甲烷＝1:50。淡黃色粉末，產(chǎn)率為49％。¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ12.73(s，1h)，7.94–7.81(m，2h)，7.68(d，j＝6.7hz，1h)，7.57–7.45(m，3h)，7.32–7.27(m，1h)，7.22–7.18(m，2h)，6.67(s，1h)，6.43(d，j＝2.2hz，1h)，6.36(d，j＝2.2hz，1h)，4.37(t，j＝6.6hz，2h)，3.96(t，j＝5.5hz，2h)，2.58(s，3h)，2.38–2.28(m，2h)。

實(shí)施例8：5-羥基-7-(2-(1h-苯并[d]咪唑-1-基)丁氧基)-2-苯基-4h-色烯-4-酮

在100ml三口燒瓶中加入苯并咪唑(0.0015mol)，使其溶于30ml丙酮，加入碳酸鉀(0.552g，0.004mol)，攪拌10min后，加入實(shí)施例3得到的淡黃色固體7-(4-溴丁氧基)-5-羥基-2-苯基-4h-苯并吡喃酮-4-酮(0.39g，0.001mol)，四丁基溴化銨(tbab)(0.03g，0.0001mol)，加熱至60℃攪拌反應(yīng)，(tcl檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程)，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水洗，然后用無水硫酸鈉干燥，溶劑減壓蒸干后用硅膠柱分離即得到目標(biāo)化合物，洗脫劑為：甲醇：二氯甲烷＝1:50。淡黃色粉末，產(chǎn)率為51％。¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ12.71(s，1h)，7.92(s，1h)，7.89–7.83(m，2h)，7.81(d，j＝7.2hz，1h)，7.55–7.47(m，3h)，7.41(d，j＝7.1hz，1h)，7.34–7.25(m，3h)，6.65(s，1h)，6.44(d，j＝2.2hz，1h)，6.33(d，j＝2.2hz，1h)，4.28(t，j＝7.0hz，2h)，4.03(t，j＝6.0hz，2h)，2.11(dt，j＝14.7，7.4hz，2h)，1.85(dd，j＝15.2，5.8hz，2h)。

實(shí)施例9：5-羥基-7-(2-(2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-1-基)丁氧基)-2-苯基-4h-色烯-4-酮

在100ml三口燒瓶中加入2-甲基苯并咪唑(0.0015mol)，使其溶于30ml丙酮，加入碳酸鉀(0.552g，0.004mol)，攪拌10min后，加入實(shí)施例3得到的淡黃色固體7-(4-溴丁氧基)-5-羥基-2-苯基-4h-苯并吡喃酮-4-酮(0.39g，0.001mol)，四丁基溴化銨(tbab)(0.03g，0.0001mol)，加熱至60℃攪拌反應(yīng)，(tcl檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程)，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水洗，然后用無水硫酸鈉干燥，溶劑減壓蒸干后用硅膠柱分離即得到目標(biāo)化合物，洗脫劑為：甲醇：二氯甲烷＝1:50。淡黃色粉末，產(chǎn)率為48％。¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ12.72(s，1h)，7.89–7.84(m，2h)，7.72–7.65(m，1h)，7.52(t，j＝7.2hz，3h)，7.33–7.27(m，1h)，7.24–7.18(m，2h)，6.65(s，1h)，6.44(d，j＝2.2hz，1h)，6.33(d，j＝2.1hz，1h)，4.21(t，j＝7.1hz，2h)，4.03(t，j＝6.0hz，2h)，2.63(s，3h)，2.02(dd，j＝15.0，7.7hz，2h)，1.88(dd，j＝14.8，5.7hz，2h)。

實(shí)施例10：本發(fā)明化合物的體外抗腫瘤活性試驗(yàn)

對(duì)本發(fā)明的化合物進(jìn)行抗腫瘤細(xì)胞增殖活性試驗(yàn)，試驗(yàn)方法采用常規(guī)的mtt法。

細(xì)胞株選用人胃癌細(xì)胞mgc-803、人肝癌細(xì)胞hepg2和人乳腺癌細(xì)胞mcf-7。培養(yǎng)液為dmem+15％nbs+雙抗。

藥物溶液的配制方法：用dmso(merck)溶解后，加入pbs(-)配成1mmol/ml的溶液或均勻的混懸液，然后用dmso的pbs(-)稀釋，最終濃度分別為384μmol/l、192μmol/l、96μmol/l、48μmol/l、24μmol/l、12μmol/l、6μmol/l、3μmol/l。

將上市的抗腫瘤藥物5-氟尿嘧啶和白楊素以同樣的條件配成對(duì)照品溶液。

試驗(yàn)步驟

96孔板每孔加入濃度為3×10⁴個(gè)/ml的細(xì)胞懸液100μl，即3000個(gè)細(xì)胞/孔，置37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)。24小時(shí)后，分別加入樣品液和對(duì)照品液，10μl/孔，37℃作用72小時(shí)。每孔加入5mg/ml的mtt(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑翁溴化物)溶液20μl，作用4小時(shí)后加入溶解液dmso，100μl/孔，置培養(yǎng)箱內(nèi)，次日用mk-2全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)570nmod值。計(jì)算半數(shù)抑制濃度ic50。

試驗(yàn)結(jié)果詳見表1，其中，樣品是指新合成的白楊素苯并咪唑衍生物1-21，實(shí)施例1-9只是其中一部分化合物的具體合成方法與結(jié)果。

表1化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度ic50(單位：μmol/l)

anti-proliferativeactivityofcompoundsagainstthecancercelllines

sd＝standarddeviation,

n.d＝notdetected

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的化合物具有良好的抗腫瘤活性，白楊素苯并咪唑衍生物對(duì)人胃癌細(xì)胞mgc-803、人肝癌細(xì)胞hepg2、人乳腺癌細(xì)胞mcf-7有均顯示出一定程度的抑制活性，其中化合物16對(duì)人胃癌細(xì)胞mgc-803、人肝癌細(xì)胞hepg2、人乳腺癌細(xì)胞mcf-7效果均比較顯著，故將以16號(hào)化合物做進(jìn)一步的體內(nèi)抗腫瘤活性試驗(yàn)。因新合成化合物對(duì)人胃癌細(xì)胞mgc-803的效果較其他好，故體內(nèi)抗腫瘤活性試驗(yàn)中選用鼠源性胃癌細(xì)胞mfc建正常小鼠腫瘤模型。實(shí)施例11：本發(fā)明16號(hào)化合物的體內(nèi)抗腫瘤活性試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物38只健康雄性小鼠3～4周齡隨機(jī)分為5組：給藥組(高中低三種劑量各7只)、陽性對(duì)照組(五氟尿嘧啶)7只、陰性對(duì)照組10只，飼以高壓滅菌水和飼料，飼養(yǎng)室相對(duì)濕度55％±10％，溫度(22±2)℃，光照12h，明暗交替。

細(xì)胞培養(yǎng)過程中所需dmem培養(yǎng)基、胎牛血清等均購(gòu)自美國(guó)gibco公司。顯微外科實(shí)驗(yàn)手術(shù)器械購(gòu)自上海市醫(yī)療器械總公司，高壓滅菌后使用。

將凍存的鼠源性胃癌細(xì)胞mfc細(xì)胞復(fù)蘇后，于含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基中，在37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，胰酶消化后用生理鹽水重懸成1×10⁷/ml細(xì)胞懸液，在小鼠左側(cè)腹側(cè)中部皮下注射細(xì)胞懸液，形成一皮丘，內(nèi)含0.2ml細(xì)胞懸液(2×10⁶個(gè))，共接種38只，在腫瘤體積達(dá)到約125mm³(定義為第0天)時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。

觀察與取材：所有小鼠模型均自由食水，每?jī)商煊^察小鼠體質(zhì)量、精神狀態(tài)、攝食、活動(dòng)與營(yíng)養(yǎng)情況。造模后每?jī)商煊^察小鼠皮下成瘤情況，測(cè)量皮下瘤長(zhǎng)徑(a)和寬徑(b)，計(jì)算體積(v＝a×b²)，以腫瘤體積和生長(zhǎng)時(shí)間作為坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。同時(shí)記錄成瘤時(shí)間，腫瘤形狀，腫瘤表面皮膚情況。2周后，處死所有小鼠并切取腫瘤，觀察腫瘤大小。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果16化合物對(duì)小鼠腫瘤的生長(zhǎng)有較好的抑制作用，并呈濃度依賴性，可進(jìn)一步對(duì)化合物的作用機(jī)制進(jìn)行研究與探討。

圖2為以腫瘤體積和生長(zhǎng)時(shí)間為坐標(biāo)，繪制的生長(zhǎng)曲線。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。