本發(fā)明涉及一株鼠源的雜交瘤細(xì)胞株ab2及其分泌的能識(shí)別阿米卡星的單克隆抗體，可用于食品中阿米卡星殘留的檢測(cè)，屬于免疫化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

阿米卡星(amikacin，amk)是一種半合成的氨基糖苷類抗生素，由卡那霉素a衍生而來，也稱為丁胺卡那霉素。與其他氨基糖苷類抗生素一樣，阿米卡星也是通過與細(xì)菌的30s核糖體結(jié)合來阻斷蛋白質(zhì)的合成。

阿米卡星被用于人類和動(dòng)物臨床治療，用來治療革蘭氏陰性菌感染。其突出的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)許多腸道革蘭氏陰性桿菌所產(chǎn)生的氨基糖苷類鈍化酶穩(wěn)定，不會(huì)為此類酶鈍化失去活性。阿米卡星廣泛用于腎臟疾病的治療，但是由于其潛在的毒性已經(jīng)被控制使用劑量。在牛乳房炎的治療中，需要足夠長(zhǎng)的休藥期來避免牛奶中阿米卡星藥物的殘留。阿米卡星被報(bào)道過潛在的腎毒性和耳毒性，除此之外還會(huì)導(dǎo)致耐藥性。所以，對(duì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中阿米卡星使用的監(jiān)管，以及動(dòng)物性食品中阿米卡星的殘留監(jiān)督十分重要。

在食品中藥物殘留的檢測(cè)中，借助儀器分析的方法比較多。以前報(bào)道的食品中阿米卡星殘留的檢測(cè)主要運(yùn)用的是毛細(xì)管電泳法和液相色譜方法。但是這些方法昂貴、耗時(shí)、需要專業(yè)的人員來操作。另外，阿米卡星和其他氨基糖苷類抗生素一樣，其結(jié)構(gòu)中沒有發(fā)色團(tuán)，揮發(fā)性很差，親水性很強(qiáng)。這一特性使得直接依賴紫外吸收檢測(cè)的高效液相色譜法十分復(fù)雜，因?yàn)橐獙?duì)阿米卡星進(jìn)行衍生化獲得一些有紫外吸收或者熒光吸收的基團(tuán)。因此，食品中阿米卡星的檢測(cè)需要一種更為快捷、高通量的檢測(cè)方法來替代。

酶聯(lián)免疫分析方法（elisa）是一種半定量的、簡(jiǎn)單、靈敏、快捷和高通量的檢測(cè)方法，對(duì)于食品中藥物殘留的檢測(cè)有重要意義。之前有報(bào)道，在抗阿米卡星的多克隆抗體的基礎(chǔ)來建立表面質(zhì)子共振免疫分析方法和熒光偏振免疫分析方法，用來檢測(cè)阿米卡星殘留。但兩個(gè)研究都沒有提供具體的關(guān)于多克隆抗體制備的信息和其交叉反應(yīng)率。另外也有關(guān)于抗阿米卡星多克隆抗體的研究。但目前沒有抗阿米卡星單克隆抗體制備的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是開發(fā)針對(duì)阿米卡星的單克隆抗體，并在此基礎(chǔ)上建立elisa方法。此發(fā)明內(nèi)容包括兩個(gè)方面：?jiǎn)慰寺】贵w的制備和其應(yīng)用。

抗阿米卡星單克隆抗體是通過小鼠免疫阿米卡星免疫原獲得。免疫原通過戊二醛方法合成，包被通過碳二亞胺法合成。篩選血清陽(yáng)性高抑制好的小鼠取脾臟，將脾細(xì)胞與sp2/0瘤細(xì)胞融合。融合后用間接elisa方法檢測(cè)細(xì)胞上清，篩選對(duì)陽(yáng)性高且對(duì)阿米卡星抑制好的細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，進(jìn)行三次亞克隆，獲得純的細(xì)胞株。將細(xì)胞株注射進(jìn)打過石蠟油的小鼠的腹腔制備腹水，獲得的腹水用辛酸-硫酸銨方法進(jìn)行純化。測(cè)定單克隆抗體對(duì)阿米卡星的半數(shù)抑制濃度(ic50),以及對(duì)其結(jié)構(gòu)類似物的ic50,計(jì)算交叉反應(yīng)率。將阿米卡星藥物分別添加入牛奶和雞蛋中，進(jìn)行樣本添加回收實(shí)驗(yàn)，計(jì)算回收率。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一株分泌抗阿米卡星單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株ab2,已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱cgmcc，保藏編號(hào)為cgmccno.13086。

抗阿米卡星單克隆抗體，由所述的保藏編號(hào)為cgmccno.13086的抗阿米卡星單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株ab2分泌產(chǎn)生，其ic50為0.65μg/l。

所述的抗阿米卡星單克隆抗體的應(yīng)用，在于對(duì)食品中阿米卡星殘留檢測(cè)中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：采用間接競(jìng)爭(zhēng)elisa測(cè)定細(xì)胞株ab2分泌的單克隆抗體，對(duì)阿米卡星的ic50為0.65μg/l。對(duì)牛奶和雞蛋中阿米卡星的回收率范圍分別為73.55%～84.61%及73.70%～105.75%。為動(dòng)物性食品中阿米卡星殘留的免疫檢測(cè)提供了原料，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

生物材料樣品保藏：?jiǎn)慰寺〖?xì)胞株ab2，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱cgmcc，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為cgmccno.13086，保藏日期2016年10月31日。

附圖說明

圖1單克隆抗體ab2對(duì)阿米卡星的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明下面的實(shí)施例僅作為本發(fā)明內(nèi)容的進(jìn)一步說明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi)容或范圍。下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1：免疫原和包被原合成

免疫原通過戊二醛方法偶聯(lián)：35mg阿米卡星溶解于4ml0.01mpbs中，邊攪拌邊逐滴加入200μl1%戊二醛水溶液，活化15min。20mg牛血清白蛋白（bsa）溶解于2ml0.01mpbs中，將活化好的液體緩慢加入蛋白溶液中，4℃反應(yīng)一小時(shí)。加入適量的硼氫化鈉終止反應(yīng)。反應(yīng)物用0.01mpbs溶液透析三天。得到的免疫原儲(chǔ)存在-20℃。包被原通過碳二亞胺法合成：10mg卵清白蛋白（ova）溶解于1ml0.1mmes中，ph4.7,2mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和1.2mgn-羥基琥珀酰亞胺(nhs)溶解于1ml0.05mkh2po4中,ph8.6。將edc和nhs的混合物加入蛋白溶液中，室溫下活化反應(yīng)2小時(shí)。20.85mg阿米卡星溶解于1ml0.05mkh2po4溶液中，將活化好的蛋白溶液緩慢加入阿米卡星溶液中，室溫下反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)液用0.01mpbsa透析三天，得到的包被原儲(chǔ)存于-20℃。

實(shí)施例2：小鼠免疫

免疫原用生理鹽水稀釋到合適的濃度，再與等量的弗氏佐劑乳化，在6-8周齡的balb/c小鼠的背上進(jìn)行多點(diǎn)注射。首次免疫用的是弗氏完全佐劑，劑量為100μg。后面的四次加強(qiáng)免疫用的是弗氏不完全佐劑，免疫劑量為50μg，免疫間隔為21天。第三次免疫后，通過小鼠的尾靜脈采血，并通過間接elisa來檢測(cè)血清。第五次免疫后篩選效價(jià)高抑制好的小鼠進(jìn)行腹腔沖刺免疫，三天以后取出小鼠脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合。

實(shí)施例3：細(xì)胞融合與篩選

小鼠脾細(xì)胞和瘤細(xì)胞在peg1500的作用下融合形成雜交瘤細(xì)胞。融合后第七天進(jìn)行檢測(cè)，篩選效價(jià)高且對(duì)阿米卡星識(shí)別性好的細(xì)胞株進(jìn)行亞克隆，以此類推，進(jìn)行3次亞克隆獲得純的細(xì)胞株。

實(shí)施例4：?jiǎn)慰寺】贵w的純化

篩選出的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后，注射進(jìn)已經(jīng)打過石蠟油的小鼠腹腔內(nèi)，7到14天后可以從小鼠腹腔抽取腹水。腹水用辛酸-硫酸銨方法進(jìn)行純化，儲(chǔ)存在-20℃。

實(shí)施例5：?jiǎn)慰寺】贵w的性質(zhì)

抗體的靈敏度和特異性通過間接elisa來測(cè)定。

1、單克隆抗體的交叉

將包被原amk-edc-ova用0.05mph9.6碳酸鹽緩沖液稀釋，100μl/孔，37℃反應(yīng)2h。包被原濃度為（0.3μg/ml）和單克隆抗體濃度（0.5μg/ml）通過棋盤法確定。將板內(nèi)溶液傾去，甩干，并用洗滌液pbst洗滌3次，每次3min。拍干后，加入200μl/孔封閉液，37℃反應(yīng)2h。洗滌后烘干備用。酶標(biāo)板的每孔里加入50μl標(biāo)準(zhǔn)物溶液和50μl抗體，在37℃下培養(yǎng)30min后洗滌三次后拍干，每孔加入1︰3000稀釋二抗100μl，在37℃下培養(yǎng)30min后洗滌4次后拍干，加入已配制好的tmb顯色液100μl，37℃培養(yǎng)15min,最后每孔加入50μl2m硫酸溶液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光值。

單克隆抗體的交叉實(shí)驗(yàn)測(cè)定了其他的氨基糖苷類抗生素：卡那霉素(kanamycin)、妥布霉素（tobramycin）、慶大霉素(gentamycin)、安普霉素(apramycin)、巴龍霉素（paromomycin）、林可霉素(lincomycin)新霉素(neomycin)，大觀霉素(spectinomycin)和鏈霉素(streptomycin)。交叉反應(yīng)率為類似物的ic50與阿米卡星ic50的比值。其交叉實(shí)驗(yàn)如表1所示。

表1.單克隆抗體ab2的交叉

2、添加回收實(shí)驗(yàn)

向陰性牛奶（bovinemilk），雞蛋(wholeegg)中添加阿米卡星，用單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算回收率。添加回收實(shí)驗(yàn)見表2。

表2.添加回收實(shí)驗(yàn)

溶液配制：

碳酸鹽緩沖液（cbs）：稱取na2co31.59g，nahco32.93g，分別溶于少量雙蒸水后混合，加雙蒸水至約800ml混勻，調(diào)ph至9.6，加雙蒸水定容至1000ml，4℃貯存?zhèn)溆茫?/p>

磷酸鹽緩沖液（pbs）：8.00gnacl，0.2gkcl，0.2gkh2po4，2.9gna2hpo4·12h2o，溶于800ml純水中，用naoh或hcl調(diào)ph到7.2～7.4，定容至1000ml；

pbst：含0.05%吐溫20的pbs；

tmb顯色液：a液：na2hpo4·12h2o18.43g，檸檬酸9.33g，純水定容至1000ml；b液：60mgtmb溶于100ml乙二醇中。a、b液按體積比1︰5混合即為tmb顯色液，現(xiàn)用現(xiàn)混。

綜上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用來限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。即凡依本發(fā)明申請(qǐng)范圍的內(nèi)容所作的等效變化與修飾，都應(yīng)為本發(fā)明的技術(shù)范疇。