本發(fā)明涉及分子生物學DNA標記技術與應用領域，具體涉及一種用于沙鑒定冬青及遺傳學分析的微衛(wèi)星分子標記、試劑盒及其應用。
背景技術：
：沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)，屬于豆科沙冬青屬又稱蒙古黃花木、冬青、蒙古沙冬青，分布于內(nèi)蒙古、寧夏和甘肅等地海拔1000至1200米低山地帶，是我國北方荒漠地區(qū)唯一的強旱生常綠闊葉灌木，因為具有極強的抗逆性，沙冬青是極其珍貴的荒漠地區(qū)種質(zhì)資源。沙冬青物種歷史久遠，是古地中海退縮、氣候旱化過程中幸存的孑遺種之一。在研究第三紀氣候特征、地理環(huán)境變遷、亞洲中部荒漠植被的起源和形成等方面有重要的研究價值。由于分布范圍狹小，生境嚴酷，又受到人類活動的影響，沙冬青數(shù)量正不斷減少，現(xiàn)已瀕臨滅絕，被列為國家二級保護植物。在阻止盜采和人為破壞等事件中，快速而準確的物種鑒定和個體識別手段是十分必要的。另外，為了制定合理的保護管理方法及輔助育種，也亟需對沙冬青開展種質(zhì)資源遺傳多樣性、種群結(jié)構(gòu)、種群歷史動態(tài)等遺傳學分析研究。微衛(wèi)星DNA(MicrosatelliteDNA)，也稱為簡單重復序列(SimpleSequenceRepeats,SSR)，廣泛分布于真核生物的基因組中，是一類由幾個核苷酸(一般為2-6個)為重復單位組成的串聯(lián)重復序列。由于其有數(shù)量多、特異的PCR擴增、穩(wěn)定性好、在基因組內(nèi)分布均勻、多態(tài)性信息豐富、易于檢測等特性等諸多優(yōu)點成為近年來應用廣泛的分子標記之一。微衛(wèi)星分子標記也成功和廣泛得應用于物種鑒定和遺傳學研究中。技術實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一組用于沙冬青鑒定的微衛(wèi)星分子標記。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案：本發(fā)明提供了用于鑒定沙冬青的微衛(wèi)星分子標記，包括AM-4，所述AM-4的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。優(yōu)選的，所述微衛(wèi)星分子標記還包括AM-6、AM-7、AM-8、AM-10、AM-15、AM-16、AM-17、AM-19和AM-20中的一種或幾種，上述核苷酸序列分別如SEQIDNO.2～10所示。本發(fā)明提供了一種用于鑒定沙冬青的試劑盒，包括根據(jù)上述技術方案所述微衛(wèi)星分子標記設計得到的濃度為10μM的引物對各1μL，2×TaqPCRSuperMix15μL，DNA模板1μL，用超純水補齊至30μL；所述引物對包括：AM-4引物對序列如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示。優(yōu)選的，所述試劑盒還包括以下引物對中的一對或多對：AM-6引物對序列如SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示；AM-7引物對序列如SEQIDNO.15和SEQIDNO.16所示；AM-8引物對序列如SEQIDNO.17和SEQIDNO.18所示；AM-10引物對序列如SEQIDNO.19和SEQIDNO.20所示；AM-15引物對序列如SEQIDNO.21和SEQIDNO.22所示；AM-16引物對序列如SEQIDNO.23和SEQIDNO.24所示；AM-17引物對序列如SEQIDNO.25和SEQIDNO.26所示；AM-19引物對序列如SEQIDNO.27和SEQIDNO.28所示；AM-20引物對序列如SEQIDNO.29和SEQIDNO.30所示。本發(fā)明還提供了上述技術方案所述的微衛(wèi)星分子標記在沙冬青鑒定中的應用。優(yōu)選的，所述沙冬青的鑒定包括以下步驟：以前述技術方案所述的試劑盒對待測樣品的基因組DNA進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物與微衛(wèi)星序列進行對比：若含有上述技術方案所述的至少一種微衛(wèi)星分子標記，則判定所述待測樣品為沙冬青；若不含有上述技術方案所述的任意一種微衛(wèi)星分子標記，則判定所述待測樣品為非沙冬青。更優(yōu)選的，所述PCR擴增的程序為：95℃預變性5min；95℃變性30sec，各引物最適退火溫度下退火30sec，72℃延伸15sec，反應32個循環(huán)；最后72℃延伸10min。本發(fā)明上述技術方案所述的微衛(wèi)星分子標記在沙冬青遺傳學分析研究中的應用。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：本發(fā)明首次提供了用于沙冬青鑒定的微衛(wèi)星分子標記以及用于鑒定沙冬青的試劑盒，能夠快速準確的鑒別沙冬青。本發(fā)明提供的用于鑒定沙冬青的微衛(wèi)星分子標記還能夠為沙冬青種質(zhì)資源的遺傳多樣性調(diào)查、種群遺傳結(jié)構(gòu)分析、個體識別以及親緣關系鑒定等遺傳學分析提供支持。具體實施方式本發(fā)明提供了用于鑒定沙冬青的微衛(wèi)星分子標記，包括AM-4，所述AM-4的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。優(yōu)選的，所述微衛(wèi)星分子標記還包括AM-6、AM-7、AM-8、AM-10、AM-15、AM-16、AM-17、AM-19和AM-20中的一種或幾種，上述核苷酸序列分別如SEQIDNO.2～10所示。在本發(fā)明中，所述用于鑒定沙冬青的微衛(wèi)星分子標記更優(yōu)選的包括AM-4、AM-6、AM-7、AM-8、AM-10、AM-15、AM-16、AM-17、AM-19和AM-20。本發(fā)明還提供了一種根據(jù)上述技術方案所述微衛(wèi)星分子標記得到的用于鑒定沙冬青的試劑盒，包括2×TaqPCRSuperMix15μL，10μM引物對各1μL，DNA模板1μL，用超純水補齊至30μL；所述引物對包括：AM-4引物對序列如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示。優(yōu)選的，所述試劑盒還包括以下引物對中的一對或多對：AM-6引物對序列如SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示；AM-7引物對序列如SEQIDNO.15和SEQIDNO.16所示；AM-8引物對序列如SEQIDNO.17和SEQIDNO.18所示；AM-10引物對序列如SEQIDNO.19和SEQIDNO.20所示；AM-15引物對序列如SEQIDNO.21和SEQIDNO.22所示；AM-16引物對序列如SEQIDNO.23和SEQIDNO.24所示；AM-17引物對序列如SEQIDNO.25和SEQIDNO.26所示；AM-19引物對序列如SEQIDNO.27和SEQIDNO.28所示；AM-20引物對序列如SEQIDNO.29和SEQIDNO.30所示。在本發(fā)明中，所述用于鑒定沙冬青的試劑盒中，引物對更優(yōu)選的包括AM-4、AM-6、AM-7、AM-8、AM-10、AM-15、AM-16、AM-17、AM-19和AM-20的引物對序列，所述序列如SEQIDNO.11～30所示。在本發(fā)明中，所述試劑盒中一對引物對中的上下游引物各加入1μL；當試劑盒中存在多對引物時，采用每一對引物對單獨進行PCR擴增。在本發(fā)明中，所述沙冬青的微衛(wèi)星分子標記以及所述試劑盒中的微衛(wèi)星分子標記對應引物對由以下方法得到：1)對沙冬青樣品進行基因組DNA抽提，得到沙冬青基因組DNA；2)對所述步驟1)得到的沙冬青基因組DNA進行DNA-seq高通量測序；3)采用batchprimer3在線分析工具對所述步驟2)得到的DNA序列進行微衛(wèi)星序列篩選，將篩選得到的序列用Primer3軟件在微衛(wèi)星的側(cè)翼序列上進行引物設計；4)對步驟3)得到的引物對進行初步篩選，將初步篩選得到的引物對進行跨近緣種擴增檢測，得到用于沙冬青鑒定的微衛(wèi)星分子標記。本發(fā)明將8份沙冬青樣品進行基因組DNA抽提，得到沙冬青基因組DNA。本發(fā)明所述基因組DNA的抽提方法優(yōu)選為CTAB法。在本發(fā)明中，所述沙冬青樣品是將沙冬青采集后使用硅膠保存。本發(fā)明所述沙冬青樣品優(yōu)選的采集于阿拉善右旗的野外沙冬青種群。本發(fā)明對沙冬青采集部位沒有任何限定，采用沙冬青的任意部分均可，包括葉片、根或莖的任意組織。得到沙冬青基因組DNA后，本發(fā)明對基因組DNA進行DNA-seq高通量測序。在本發(fā)明的實施例中，所述DNA-seq高通量測序優(yōu)選委托晶能生物技術(上海)有限公司進行；具體使用illuminaHiseq測序平臺進行高通量測序，進一步優(yōu)選的采用illuminaHiseq測序平臺的雙端測序模式。高通量測序后，本發(fā)明采用batchprimer3在線分析工具對測序得到的基因序列進行篩選，得到微衛(wèi)星序列。在本發(fā)明中，所述微衛(wèi)星序列篩選的條件為：重復單元為2個堿基時，重復次數(shù)需大于等于6；重復單元為3個堿基時，重復次數(shù)需大于等于5；重復單元為4、5和6個堿基時，重復次數(shù)需大于等于4。本發(fā)明對篩選得到的微衛(wèi)星序列用Primer3軟件在微衛(wèi)星的側(cè)翼序列上進行引物設計，得到微衛(wèi)星分子標記對應的擴增引物。本發(fā)明所述引物設計的原則為：擴增目的片段為100～200bp，引物GC含量為40～60％，上下游引物退火溫度(Tm)在50～60℃之間且差異小于5℃。對本發(fā)明中設計得到的上述引物進行擴增穩(wěn)定性的初步篩選。在本發(fā)明中，所述初步篩選的條件為：能夠在8個沙冬青個體中均得到穩(wěn)定擴增，且擴增條帶單一并符合目的片段大小。具體的，本發(fā)明以引物設計得到的引物對對隨機挑選的1份沙冬青樣品進行梯度PCR擴增，確定引物對的最適退火溫度。在本發(fā)明中，所述梯度PCR反應體系如下：2×TaqPCRSuperMix(北京全式金生物技術有限公司)15μL，10μM上下游引物各1μL，DNA模板1μL，用超純水補齊至30μL。在本發(fā)明中，所述梯度PCR反應條件如下：95℃預變性5min；95℃變性30sec，45～65℃范圍內(nèi)12個梯度溫度下退火30sec，72℃延伸15sec，反應32個循環(huán)；最后72℃延伸10min。本發(fā)明所述12個梯度優(yōu)選為45℃、46℃、48℃、50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃以及65℃。本發(fā)明將所述梯度PCR得到的擴增產(chǎn)物使用2％的瓊脂糖-EB凝膠電泳檢測，選取擴增產(chǎn)物為單一條帶的引物對，并將得到符合目的片段大小的單一條帶時的退火溫度確認為該引物對的最適退火溫度。確定各引物對最適退火溫度后，本發(fā)明采用所述引物對對隨機挑選的8份沙冬青樣品進行PCR擴增，以篩選初選引物對。所述PCR擴增時以上述梯度PCR擴增時確定的最適退火溫度進行反應。在本發(fā)明中，所述篩選初選引物對時，PCR反應體系如下：2×TaqPCRSuperMix(北京全式金生物技術有限公司)15μL，10μM上下游引物各1μL，DNA模板1μL，用超純水補齊至30μL。在本發(fā)明中，所述篩選初選引物對時，PCR反應條件如下：95℃預變性5min；95℃變性30sec，45～65℃退火30sec，72℃延伸15sec，反應32個循環(huán)；最后72℃延伸10min。本發(fā)明將PCR擴增的產(chǎn)物用2％瓊脂糖-EB凝膠電泳進行檢測，選取在8份沙冬青樣品中均擴增得到條帶單一且大小一致的引物對作為初選引物對，本發(fā)明共獲得20對引物作為初選引物對。所述初選引物對對應的微衛(wèi)星分子標記分別命名為AM-1～AM-20。初步篩選后，本發(fā)明對初步篩選得到的引物進行跨近緣種擴增檢測，得到用于鑒定沙冬青的微衛(wèi)星分子標記。在本發(fā)明中，所述跨近緣種擴增檢測包括以下步驟：(1)以初選引物對對沙冬青及其近緣物種進行PCR擴增；(2)對步驟(1)得到的擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測，選取僅能夠?qū)ι扯鄻悠愤M行擴增的引物對所對應的微衛(wèi)星分子標記，即得到用于鑒定沙冬青的微衛(wèi)星分子標記。在本發(fā)明中，所述沙冬青的近緣物種優(yōu)選的包括沙冬青屬的小沙冬青(Ammopiptanthusnanus)、槐屬(近緣屬)的國槐(SophorajaponicaLinn.)和白刺花(Sophoradavidii)、銀砂槐屬(近緣屬)的銀砂槐(Ammodendronbifolium)、野決明屬(近緣屬)的蒙古野決明(ThermopsismongolicaCzefr.)和披針葉野決明(ThermopsislanceolataR.Br.)、黃花木屬(近緣屬)的尼泊爾黃花木(Piptanthusnepalensis)和黃花木(Piptanthusnepalensis)、伴生種霸王(SarcozygiumxanthoxylonBunge)和檸條(CaraganaKorshinskiiKom)。在本發(fā)明中，所述特異性PCR擴增的反應體系如下：2×TaqPCRSuperMix(北京全式金生物技術有限公司)15μL，10μM上下游引物各1μL，DNA模板1μL，用超純水補齊至30μL。在本發(fā)明中，所述跨近緣種擴增檢測時，PCR擴增的反應條件如下：95℃預變性5min；95℃變性30sec，在確定的各初選引物對最適退火溫度下退火30sec，72℃延伸15sec，反應32個循環(huán)；最后72℃延伸10min。本發(fā)明將所述跨近緣種擴增檢測時PCR擴增得到的擴增產(chǎn)物使用2％的瓊脂糖-EB凝膠電泳檢測，選取僅能夠?qū)ι扯鄻悠愤M行擴增得到單一目的條帶的引物對，將選取的引物對對應的微衛(wèi)星分子標記作為用于鑒定沙冬青的微衛(wèi)星分子標記，本發(fā)明提供的用于沙冬青鑒定的試劑盒中包括所述選取的引物對。本發(fā)明還提供了上述技術方案所述的試劑盒在沙冬青鑒定中的應用。優(yōu)選的，所述沙冬青的鑒定包括以下步驟：以前述技術方案所述的試劑盒對待測樣品的基因組DNA進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物與微衛(wèi)星序列進行對比：若含有上述技術方案所述的至少一種微衛(wèi)星分子標記，則判定所述待測樣品為沙冬青；若不含有上述技術方案所述的任意一種微衛(wèi)星分子標記，則判定所述待測樣品為非沙冬青。更優(yōu)選的，所述PCR擴增的程序為：95℃預變性5min；95℃變性30sec，各引物最適退火溫度下退火30sec，72℃延伸15sec，反應32個循環(huán)；最后72℃延伸10min。本發(fā)明還提供了上述技術方案所述的微衛(wèi)星分子標記在沙冬青遺傳學分析研究中的應用。具體的，采用所述用于鑒定沙冬青的微衛(wèi)星分子標記對不同沙冬青種群的遺傳多樣性進行研究，所述沙冬青遺傳多樣性的研究方法包括以下步驟：①對所述用于鑒定沙冬青的微衛(wèi)星分子標記對應的引物對上游引物進行熒光標記，使用標記后的上游引物和對應的下游引物對16份沙東青樣品的基因組DNA進行PCR擴增；②將所述步驟①得到的PCR產(chǎn)物進行基因分型，基因分型的結(jié)果使用GENMARKER軟件進行讀取，并輸入Excel文件；使用ExcelMircosatelliteToolkit程序統(tǒng)計各微衛(wèi)星位點的期望雜合度(ExpectedHeterozygosity,HE)、觀測雜合度(ObservedHeterozygosity，HO)和多態(tài)性信息含量(Polymorphicinformationcontent,PIC)，以檢測所述微衛(wèi)星位點的多態(tài)性狀況，選擇上述三個多態(tài)性數(shù)值均大于0.5的位點來進行沙冬青種群的遺傳多樣性研究；③分別在不同地區(qū)各采集10～30份沙冬青樣品，用CTAB法抽提基因組DNA后，以步驟②篩選的高多態(tài)性微衛(wèi)星分子標記進行PCR擴增；④將所述步驟③得到的PCR產(chǎn)物進行基因分型，基因分型的結(jié)果使用GENMARKER軟件進行讀取，并輸入Excel文件；使用ExcelMircosatelliteToolkit程序統(tǒng)計各種群的平均等位基因數(shù)(MeanNumberofAlleles，MNA)、期望雜合度(ExpectedHeterozygosity,HE)、觀測雜合度(ObservedHeterozygosity，HO)，結(jié)合統(tǒng)計數(shù)據(jù)對不同種群來源的沙冬青遺傳多樣性進行研究。在本發(fā)明中，所述對上游引物進行熒光標記具體為對上游引物的5’端進行熒光標記；所述熒光標記優(yōu)選為FAM、HEX或TAMRA，更優(yōu)選為FAM。在本發(fā)明中，步驟①和步驟③所述引物對的基因序列如SEQIDNO:11～30所示。本發(fā)明所述PCR反應體系如下：2×TaqPCRSuperMix(北京全式金生物技術有限公司)15μL，10μM引物對各1μL，DNA模板1μL，用超純水補齊至30μL。本發(fā)明所述PCR反應條件如下：95℃預變性5min；95℃變性30sec，在各引物對確定的最適退火溫度下退火30sec，72℃延伸15sec，反應32個循環(huán)；最后72℃延伸10min。所述退火溫度選自各引物對確定的最適退火溫度。在本發(fā)明中，步驟②和步驟④所述基因分型優(yōu)選的將PCR擴增產(chǎn)物以GS500熒光分子量標準在ABI3730DNA測序儀中使用聚丙烯酰胺凝膠進行基因分型測定。下面將結(jié)合本發(fā)明中的實施例，對本發(fā)明中的技術方案進行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。實施例11、在阿拉善右旗的野外沙冬青種群采集沙冬青葉片，使用硅膠保存。取8份沙冬青樣品以CTAB法抽提基因組DNA，得到沙冬青基因組DNA。2、委托晶能生物技術(上海)有限公司對步驟1得到的沙冬青基因組DNA使用illuminaHiseq測序平臺的雙端測序模式進行DNA-seq高通量測序，共得到1828271條DNA序列，所述高通量測序得到的DNA序列平均長度為380bp。3、采用batchprimer3在線分析工具對步驟2得到的DNA序列進行微衛(wèi)星序列篩選，共篩選得到60174條含有微衛(wèi)星分子標記的序列；將篩選得到的序列用Primer3軟件在微衛(wèi)星的側(cè)翼序列上進行引物設計，共設計引物33740對。所述篩選條件為：重復單元為2個堿基時，重復次數(shù)大于等于6；重復單元為3個堿基時，重復次數(shù)大于等于5；重復單元為4、5和6個堿基時，重復次數(shù)大于等于4。所述引物設計要求為：產(chǎn)物片段長度在100～300bp之間，上下游引物間退火溫度相差不大于5℃且引物GC含量小于60％。4、對步驟3得到的引物對進行初步篩選，將初步篩選得到的引物對進行跨近緣種擴增檢測，得到用于沙冬青鑒定的微衛(wèi)星分子標記。所述初步篩選的條件為：能夠在8個沙冬青個體中均得到穩(wěn)定擴增，且擴增條帶單一并大小符合目的片段大小。所述初步篩選包括以下步驟：(1)以初步篩選得到的引物對對隨機挑選的1份沙冬青樣品進行梯度PCR擴增以確定引物對的退火溫度。所述梯度PCR反應體系如下：2×TaqPCRSuperMix(北京全式金生物技術有限公司)15μL，10μM上下游引物各1μL，DNA模板1μL，用超純水補齊至30μL。所述梯度PCR反應條件如下：95℃預變性5min；95℃變性30sec，45～65℃范圍內(nèi)12個梯度溫度下退火30sec，72℃延伸15sec，反應32個循環(huán)；最后72℃延伸10min。將所述梯度PCR得到的擴增產(chǎn)物使用2％的瓊脂糖-EB凝膠電泳檢測，選取擴增產(chǎn)物為單一條帶的引物對，并將得到單一條帶的退火溫度確認為該引物對的最適退火溫度。(2)以初步篩選得到的引物對對隨機挑選的8份沙冬青樣品進行PCR擴增以測試引物對的擴增穩(wěn)定性，將PCR擴增的產(chǎn)物用2％瓊脂糖-EB凝膠電泳進行檢測，選取在8份沙冬青樣品中均擴增得到條帶單一且大小一致的引物對，共得到20對初選引物對，將所述初選引物對對應的微衛(wèi)星分子標記分別命名為AM-1～AM-20。所述PCR反應體系如下：2×TaqPCRSuperMix(北京全式金生物技術有限公司)15μL，10μM上下游引物各1μL，DNA模板1μL，用超純水補齊至30μL。所述PCR反應條件如下：95℃預變性5min；95℃變性30sec，各引物對在步驟(1)中確定的最適退火溫度下退火30sec，72℃延伸15sec，反應32個循環(huán)；最后72℃延伸10min。所述跨近緣種擴增檢測包括以下步驟：(1)以初選引物對對沙冬青及其近源物種進行PCR擴增；樣本選?。阂陨扯酁閷嶒灅颖荆陨扯嗟慕壩锓N以及沙冬青的近源物種為對照樣本。所述對照樣本為：同為沙冬青屬的小沙冬青(Ammopiptanthusnanus)、槐屬(近緣屬)的國槐(SophorajaponicaLinn.)和白刺花(Sophoradavidii)、銀砂槐屬(近緣屬)的銀砂槐(Ammodendronbifolium)、野決明屬(近緣屬)的蒙古野決明(ThermopsismongolicaCzefr.)和披針葉野決明(ThermopsislanceolataR.Br.)、黃花木屬(近緣屬)的尼泊爾黃花木(Piptanthusnepalensis)和黃花木(Piptanthusnepalensis)、伴生種霸王(SarcozygiumxanthoxylonBunge)和檸條(CaraganaKorshinskiiKom)。沙冬青的近緣物種選擇參考文獻：LeiXieandYongYang.2012.Mioceneoriginofthecharacteristicbroad-leavedevergreenshrubammopiptanthus(leguminosae)inthedesertfloraofeasterncentralasia.InternationalJournalofPlantSciences.173(8):944–955.所述10種對照樣本的詳細信息如表1所示。表1沙冬青近源物種樣本信息物種名樣本數(shù)量采集地小沙冬青3新疆伊犁白刺花3甘肅蘭州國槐3內(nèi)蒙古呼和浩特銀砂槐3新疆伊犁蒙古野決明3內(nèi)蒙古烏海披針葉決明3內(nèi)蒙古鄂爾多斯尼泊爾黃花木3內(nèi)蒙古鄂爾多斯黃花木3內(nèi)蒙古鄂爾多斯檸條3內(nèi)蒙古鄂爾多斯霸王3內(nèi)蒙古鄂爾多斯(2)分別取實驗樣本與對照樣本各3份樣品，使用CTAB法分別對上述樣品進行基因組DNA的抽提。(3)以初選引物對對上述樣品的DNA進行PCR擴增，以測試微衛(wèi)星分子標記的特異性。所述跨近緣種擴增檢測PCR反應體系如下：2×TaqPCRSuperMix(北京全式金生物技術有限公司)15μL，10μM上下游引物各1μL，DNA模板1μL，用超純水補齊至30μL。所述跨近緣種擴增檢測PCR反應條件如下：95℃預變性5min；95℃變性30sec，各初選引物對確定的最適退火溫度下退火30sec，72℃延伸15sec，反應32個循環(huán)；最后72℃延伸10min。(4)將所述擴增產(chǎn)物使用2％的瓊脂糖-EB凝膠電泳檢測，具體鑒定結(jié)果見表2。表2沙冬青20對初選引物對的鑒定結(jié)果注：“+”表示在該物種中產(chǎn)生目的條帶；“|”表示在該物種部分個體中產(chǎn)生目的條帶；“-”表示在該物種中不產(chǎn)生目的條帶。由表2數(shù)據(jù)可知，20個初選位點中有7個在小沙冬青中得到目標條帶，另有3個位點在近緣種的全部或部分樣本中存在目標條帶。有10個位點在上述樣本中均得不到目標產(chǎn)物，包括AM-4、AM-6、AM-7、AM-8、AM-10、AM-15、AM-16、AM-17、AM-19和AM-20，選取上述10個對應的微衛(wèi)星分子標記用于鑒定沙冬青，以區(qū)分沙冬青與其近緣物種。實施例2隨機選取3份沙冬青樣品以及3份小沙冬青樣品作為待測樣品，所述沙冬青與小沙冬青樣品的采集方法與實施例1相同。以包括AM-4微衛(wèi)星分子標記對應引物對的沙冬青鑒定試劑盒對待測樣品進行PCR擴增。所述沙冬青鑒定試劑盒組成為：2×TaqPCRSuperMix15μL，10μM引物對各1μL，DNA模板1μL，超純水12μL；所述引物對包括：AM-4的上下游引物序列，所述序列如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示。所述PCR擴增的程序為：95℃預變性5min；95℃變性30sec，54℃下退火30sec，72℃延伸15sec，反應32個循環(huán)；最后72℃延伸10min。將PCR擴增的產(chǎn)物用2％瓊脂糖-EB凝膠電泳進行檢測，若凝膠電泳檢測中含有單一條帶，則表明含有微衛(wèi)星分子標記AM-4序列，即鑒定該待測樣品為沙冬青；若凝膠電泳檢測中無條帶，表明不含有微衛(wèi)星分子標記AM-4序列，即鑒定該待測樣品為非沙冬青。本次試驗的結(jié)果顯示，3份沙冬青樣品均能夠成功鑒定，且小沙冬青樣品被鑒定為非沙冬青?？梢姡景l(fā)明提供的用于鑒定沙冬青樣品的試劑盒能夠結(jié)合微衛(wèi)星分子標記準確的鑒別沙冬青。實施例3隨機選取3份沙冬青樣品以及3份銀砂槐樣品作為待測樣品，所述沙冬青與銀砂槐樣品的采集方法與實施例1相同。以包括AM-4、AM-6、AM-10微衛(wèi)星分子標記對應的引物對的沙冬青鑒定試劑盒對待測樣品進行PCR擴增。所述沙冬青鑒定試劑盒組成為：2×TaqPCRSuperMix15μL，10μM引物對各1μL，DNA模板1μL，超純水12μL；所述引物對包括：AM-4的上下游引物，序列如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示；AM-6的上下游引物，，序列如SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示；AM-10的上下游引物，序列如SEQIDNO.19和SEQIDNO.20所示。所述PCR擴增的程序為：95℃預變性5min；95℃變性30sec，分別在54℃、56℃或58℃下對AM-4、AM-6或AM-10微衛(wèi)星分子標記對應的引物退火30sec，72℃延伸15sec，反應32個循環(huán)；最后72℃延伸10min。將PCR擴增的產(chǎn)物用2％瓊脂糖-EB凝膠電泳進行檢測，將待測樣品與對照樣品得到的條帶進行對比，若凝膠電泳檢測中AM-4、AM-6或AM-10的任一擴增產(chǎn)物含有單一條帶，則表明含有微衛(wèi)星分子標記AM-4、AM-6或AM-10序列，即鑒定該待測樣品為沙冬青；若凝膠電泳檢測中AM-4、AM-6和AM-10的擴增產(chǎn)物均無條帶，表明不含有微衛(wèi)星分子標記AM-4、AM-6和AM-10序列，即鑒定該待測樣品為非沙冬青。本次試驗的結(jié)果顯示，3份沙冬青樣品均能夠成功鑒定，且銀砂槐樣品被鑒定為非沙冬青。可見，本發(fā)明提供的用于鑒定沙冬青樣品的試劑盒能夠結(jié)合微衛(wèi)星分子標記準確的鑒別沙冬青。實施例4微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性分析本次實驗用于鑒定沙冬青的微衛(wèi)星分子標記進行多態(tài)性分析，選取AM-4、AM-6、AM-7、AM-8、AM-10、AM-15、AM-16、AM-17、AM-19和AM-20進行多態(tài)性分析。所述多態(tài)性信息分析具體為：(1)對上述微衛(wèi)星分子標記對應的引物對上游引物的5’段標記熒光分子FAM，采用標記后的上游引物和對應的下游引物對16份沙東青樣品的基因組DNA進行PCR擴增。所述引物對的基因序列如SEQIDNO:11～30所示。所述PCR擴增的反應體系如下：2×TaqPCRSuperMix(北京全式金生物技術有限公司)15μL，10μM引物對各1μL，DNA模板1μL，用超純水補齊至30μL。所述PCR擴增的反應條件如下：95℃預變性5min；95℃變性30sec，在各引物對確定的最適退火溫度下退火30sec，72℃延伸15sec，反應32個循環(huán)；最后72℃延伸10min。所述退火溫度選自各引物對確定的最適退火溫度。(2)將所述步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物進行基因分型，基因分型的結(jié)果使用GENMARKER軟件進行讀取，并輸入Excel文件；使用ExcelMircosatelliteToolkit程序統(tǒng)計各微衛(wèi)星位點的期望雜合度(ExpectedHeterozygosity,HE)、觀測雜合度(ObservedHeterozygosity，HO)和多態(tài)性信息含量(Polymorphicinformationcontent,PIC)，以檢測所述微衛(wèi)星位點的多態(tài)性狀況，選擇上述三個多態(tài)性數(shù)值均大于0.5的位點來進行沙冬青種群的遺傳多樣性研究。具體的微衛(wèi)星分子標記多態(tài)性測試結(jié)果見表3。表3用于鑒定沙冬青的微衛(wèi)星位點的特征及其多態(tài)性數(shù)據(jù)由表3數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明提供的用于鑒定的微衛(wèi)星分子標記多態(tài)性數(shù)據(jù)均大于0.5，均可以用于遺傳多樣性調(diào)查、種群遺傳結(jié)構(gòu)分析、個體識別以及親緣關系鑒定等遺傳學分析。實施例5對沙冬青種群的遺傳多樣性分析本次試驗采用用于沙冬青鑒定的高多態(tài)性微衛(wèi)星分子標記對沙冬青進行遺傳多樣性分析。分別在鄂托克旗(ETK)和阿拉善右旗(ALS)各采集20份沙冬青樣品，以實施例4得到的10個高多態(tài)性微衛(wèi)星分子標記對40份沙冬青樣品進行遺傳多樣性調(diào)查。將沙冬青樣品分別用CTAB法抽提基因組DNA后，使用實施例4篩選得到可以用于遺傳學分子的10個高多態(tài)性微衛(wèi)星分子標記對應的引物對上游引物5’端標記熒光分子FAM，對每個樣品的基因組DNA進行PCR擴增，所述引物對的序列如SEQIDNO.11～30所示。所述PCR反應體系如下：2×TaqPCRSuperMix(北京全式金生物技術有限公司)15μL，10μM引物對各1μL，DNA模板1μL，超純水4μL。所述引物對為AM-4、AM-6、AM-7、AM-8、AM-10、AM-15、AM-16、AM-17、AM-19和AM-20微衛(wèi)星分子標記對應的上下游引物，序列如SEQIDNO.11～30所示。所述PCR反應條件如下：95℃預變性5min；95℃變性30sec，各引物對在表3中對應的退火溫度下退火30sec，72℃延伸15sec，反應32個循環(huán)；最后72℃延伸10min。將PCR擴增產(chǎn)物以GS500熒光分子量標準在ABI3730DNA測序儀中使用聚丙烯酰胺凝膠進行基因分型?；蚍中偷慕Y(jié)果使用GENMARKER軟件進行讀取，并輸入Excel文件。使用ExcelMircosatelliteToolkit程序統(tǒng)計各種群的平均等位基因數(shù)(MeanNumberofAlleles，MNA)、期望雜合度(ExpectedHeterozygosity,HE)、觀測雜合度(ObservedHeterozygosity，HO)。具體結(jié)果見表4。表4沙冬青兩個野生種群的遺傳多樣性調(diào)查種群MNAHEHOETK5.250.6860.775ALS4.900.6600.761表4的數(shù)據(jù)顯示，來源不同的兩個沙冬青種群的遺傳多樣性指標較為接近，且多樣性均較高，表明沙冬青目的的遺傳多樣性較高，盡管沙冬青已經(jīng)在瀕危物種行列，但仍然能夠作為優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。SEQUENCELISTING<110>內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院<120>一種用于沙冬青鑒定的微衛(wèi)星分子標記、試劑盒及其應用<130>1<160>30<170>PatentInversion3.5<210>1<211>366<212>DNA<213>人工序列<400>1aagagaaaccgtaggatgaaaaagttgctgacactgttcacacaattatctatcaatatt60tttttcataattttacaaaaaaaataaattaaaattataatcattcacacacacacacac120acacacacacacacccccacgctggatacaacttgttgagtcaatgagagaatgaagaag180tagaagtgctaacttacttgcatctttctttctttctttcttcttcttctcttgaattaa240ggtatctctcttgttttcctcactcatatacccgggtcttccgtttttctctctctgttc300tgtctctctgttcggtttctgaaaagaaaaaaacagagaaagagaaacaatggctaaatc360gagcac366<210>2<211>347<212>DNA<213>人工序列<400>2aagccctgctcagaaacagaaatacttaccaaaggttctagttctgcctattttgatctt60atttattatcagtgcaatatatcctgccttgccctattggcgatgacatgtaaggataga120ctttatcagccaaaaatgctcattgttggtctttgctttccacccatttcttgtgctatc180tatctatctatctatctatcttaaggctaagtctttttttcccttcaatcttgaagctta240tctctggggatcatgtgggagctttggcaatgagtgagcccaattgtaagatatgtgaaa300ctgaacagttgtatcttacattttttttgtatttcaattttgaagga347<210>3<211>336<212>DNA<213>人工序列<400>3ttcttgaataaggtttaagacctaagttaagcatgtttgaatgctgaataatgttcctta60tggcttgaggaaactatggtccaaatttgagacaatttgacattagaacgagtccagaaa120gtgcaaaacacatggaataacggatccagaacacgaagcaacgctaatcgcgcaattaat180taattaattaattaatgaagggttagaatattaaaatttgacggggacttcagtacaata240gggcttttaggttacctaaaaataatacagaaaatattctaccagtaggttacgcggaaa300atgaggaagaaaatactcggacgtgttgacggggaa336<210>4<211>355<212>DNA<213>人工序列<400>4gggaaattcattggccttggataaggatcaacttctggattctctacctcttttcaagag60caacggcagagcctcaccggaacaccatcaacagcggccaccgacaaatactctctttcc120ttttggggtacgaagggactactattatcttctcttctattctctttctttctttctttc180tttctttttaatttaattttgttaggtgttagggagatgaaggggttgggcgggaaggag240agacattgagaaatccgcctaacaaatttgaggctccaccacccatgaatcccgaaaatg300acatcctctgtacgacggtagttaggtgaaagaagttttgtgtattgtattgggg355<210>5<211>357<212>DNA<213>人工序列<400>5ctccaatggcagcgagttggtgcctgacgttggaatcgagtgggttttgttgctgctcca60tgcatatactctctatcatcctctccaccgacgccggaagaatcacttcctctgtcatca120tgttgttcgccaacttgatcttcaagaacaagaaatgaaagtgaagggatgatggaggaa180attcaaattcaaaagaaggggaaagatgagtgagtgagtgagtgagagagtgtcacttcc240tcgttaagttgcttgtagttgcttacttattatgaatgtgaaatggaatgaagcccatca300tcatattctatattctatcattattatttcccgctcaacttttgcaaagacaagaca357<210>6<211>311<212>DNA<213>人工序列<400>6acagcccaaaaaatgaaacacagttaaagagagagaaggggagagagagagagagaaaga60aagaaagaaagaaagaaagaaagaagatacaagaaggaacacgcccgagcttcggagtat120agaaagaaagaacaatttttattttcaaaaatgtttgtttttagaaaataattaaatttt180aataacctagtcaagtgtgatagagggtgtgtctagcattccccttactttatttagtag240tagtaggatcgagaatttttaggagaaattttgtgggaaaatataataaaacttttttct300atttgcaactc311<210>7<211>360<212>DNA<213>人工序列<400>7tagtaacagtagtcgctgcatggttatcttcaacttgcagttttctcgtggaactttcct60caaacaccttacgacgcggaaatcaacaacactctgtcagtacaaatccataagcagcac120cactctctcccacttcggaaccctaacttcccgccagaaagaccagattcatctctacgt180tgacgctcttcttcaatggaacaaggtatccattcattcattcattcattcattctccta240ttctctctctcggttgatgtaatctgattgatcatattgcagcgcatgaatctgaccgca300gttaaagatgttgacgaagttatggaaaggcacgtggaggattcccttgcgattttgcct360<210>8<211>349<212>DNA<213>人工序列<400>8aggttaaattgttttatatgattgttctgttttgttgttggtatcagatttctataccca60ctcgagtgagtgtttttcaaataaataaataaataaataaaacgtttatagtttccgcaa120cgtgttaccatgtgatgtcccagaagggggtgtcacaacatgcatatagggattagtatc180ctttgtagaggtttgatctgagagagtgattgtgagatggttgtattgtgtgacccaaga240gatgattgttggcgtgttatatgttttctatgtgttgtgtgctgcatgtctatgtactgt300actattacccctctcccatatttgatgatgcatgtttcttatctccctg349<210>9<211>352<212>DNA<213>人工序列<400>9caatctccctccattccctcattgaaacttccaaataatttgagtggtatacttttactg60tttccactccagtccactctaaatcactccattactaaccactctactccatttccatca120aaactcccaaaagtaaagtattaacaagtttatagaaatctctaggtgatcaaataaata180aataaataaataaataaaaaatgtgaaacgaaaagataagagacatatgaagcagcaggc240ttacatacataggattcgagattttggagagcggcaagagcctcttctggcgaacccatt300tcgacaaacgccaatcccctgtttcgtgtcttgttatacatagaaagcttaa352<210>10<211>348<212>DNA<213>人工序列<400>10tctcaatctgatagatattattatacttactagtaattattatgcacaaacaaacaaaca60aagaagatgaaacacaccgtcactcaaaataggtcggagggaggattggatatggattac120ggtcacagctcctctcattcttccatcatcaccggggctaggctaccgtaaataaaaatc180aattattaattaattaattaattaaattaaagcattgggctgcctcctcatttcacctgg240gctagatacgcctactactagtacgtgggcctgacaagtccgcttggactacagtcgaaa300aagatccatctgacccaaccccatttcaagccagaagccgacacaccc348<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>11atcattcacacacacacacac21<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>12tgagtgaggaaaacaagagag21<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>13gcgatgacatgtaaggataga21<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>14cccagagataagcttcaaga20<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>15ttagaacgagtccagaaagtg21<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>16ggtaacctaaaagccctattg21<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>17accgacaaatactctctttcc21<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>18ggatttctcaatgtctctcct21<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>19gaatcacttcctctgtcatca21<210>20<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>20ctacaagcaacttaacgagga21<210>21<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>21ttaaagagagagaaggggaga21<210>22<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>22acacaccctctatcacacttg21<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>23gtacaaatccataagcag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