本發(fā)明屬于分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種用于鑒定番茄萼片形態(tài)的SSR分子標(biāo)記、引物及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：番茄是目前世界上栽培和消費(fèi)最廣泛的蔬菜作物，萼片是番茄花和果實(shí)的重要組成部分，也是重要的商品品質(zhì)之一。健康平整的萼片不僅能夠體現(xiàn)出果實(shí)的新鮮度、增加其美觀度，而且在貯運(yùn)過程中平展的萼片有助于減少果實(shí)在運(yùn)輸過程中的機(jī)械損傷，從而保證其良好的外觀品質(zhì)、增加其商品價(jià)值，所以萼片形態(tài)特征的研究顯得尤為重要。一般番茄萼片形態(tài)有基平、上翹、直立、上卷四種類型，我們發(fā)現(xiàn)了一種新的番茄萼片包被形態(tài)，該形態(tài)進(jìn)一步提升了番茄的商品品質(zhì)。但番茄萼片包被形態(tài)的遺傳規(guī)律還不是很清楚，控制形態(tài)基因的遺傳定位也有待深入研究。SSR分子標(biāo)記技術(shù)是研究植物分子遺傳水平差異的一項(xiàng)重要技術(shù)，根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶數(shù)、片段大小可以找到有差異的基因組EST。但是，并沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道用于鑒定番茄萼片形態(tài)的SSR分子標(biāo)記。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供的一種用于鑒定番茄萼片形態(tài)的SSR分子標(biāo)記、引物及應(yīng)用，適用于番茄外觀形態(tài)種質(zhì)資源的遺傳評(píng)價(jià)、種質(zhì)鑒定及分子標(biāo)記輔助育種研究，重復(fù)性好、可靠性高。本發(fā)明提供了一種用于鑒定番茄萼片形態(tài)的SSR分子標(biāo)記引物，所述SSR分子標(biāo)記引物的序列如下：正向引物：5’-TGGAAAGAAGCAGTAGCATTG-3’；反向引物：5’-CAACGAACATCCTCCGTTCT-3’。本發(fā)明還提供了一種利用上述SSR分子標(biāo)記引物擴(kuò)增得到的用于鑒定番茄萼片形態(tài)的SSR分子標(biāo)記，所述SSR分子標(biāo)記為SEQIDNO.3核苷酸序列和SEQIDNO.4所示的核苷酸序列，其中SEQIDNO.3所示的核苷酸序列是：5’-TGGAAAGAAGCAGTAGGCATTGTAAAGAAGAAACATCTAGATATACTCTAGAATAACTAAAACCCTGTTTTCTCTTTCCTTTTTTCTTCTTCTTCTTCTCTCTCTCTACTGTTCCGTCGTCTGCTCATTTTTATCTTTCAGTATGAGTAAGGAGAAAGAACGGAGGATGTTCGTTG-3’；SEQIDNO.4所示的核苷酸序列是：5’-TGGAAAGAAGCAGTAGGCATTGTAAAGAAGAAACATCTAGATATACTCTAGAATAACTAAAACCCTGTTTTCTCTTTCCTTTTTTCTTCTTCTTCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTACTGTTCCGTCGTCTGCTCATTTTTATCTTTCAGTATGAGTAAGGAGAAAGAACGGAGGATGTTCGTTG-3’。本發(fā)明的還提供了上述用于鑒定番茄萼片形態(tài)的SSR分子標(biāo)記引物在番茄分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。本發(fā)明的還提供了上述用于鑒定番茄萼片形態(tài)的SSR分子標(biāo)記在番茄分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用本發(fā)明的還提供了一種應(yīng)用上述SSR分子標(biāo)記引物鑒定番茄萼片形態(tài)的方法，包括以下步驟：步驟1，提取待檢測(cè)番茄材料的基因組DNA；步驟2，PCR擴(kuò)增：a.反應(yīng)體系：10μL體系，各組分物質(zhì)的含量分別為:1μL模板DNA、0.5μL所述正向引物、0.5μL所述反向引物、5μL2×TaqMasterMix、ddH2O補(bǔ)齊10μL，混勻，離心；b.擴(kuò)增程序：包括第一循環(huán)程序和第二循環(huán)程序，其中第一循環(huán)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性1min；55-70℃退火45s，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.5℃；72℃延伸45s；20個(gè)循環(huán)后進(jìn)行第二循環(huán)程序；第二循環(huán)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性1min；45-60℃退火45s，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.5℃；72℃延伸45s；15個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min；最后4℃保存；步驟3，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳：將步驟2的擴(kuò)增產(chǎn)物與等體積的上樣緩沖液混合，95℃變性5min，之后在DNA測(cè)序電泳儀上進(jìn)行6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，65W條件下電泳1.5小時(shí)，電泳結(jié)束后，進(jìn)行銀染，并觀察擴(kuò)增結(jié)果；其中，銀染時(shí)使用的銀染液配方為：1gAgNO3、100ml無水乙醇、10ml冰醋酸加超純水定容至1L；步驟4，結(jié)果判斷：擴(kuò)增結(jié)果中如果能夠檢測(cè)到176bp、184bp兩條帶，則待檢測(cè)中含有萼片包被突變體的概率為95％以上。本發(fā)明的目的是針對(duì)已有序列但功能未知的番茄SSR分子標(biāo)記，利用新發(fā)現(xiàn)的番茄萼片包被突變體及其野生型材料，利用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，開發(fā)出能有效鑒定番茄萼片形態(tài)的SSR分子標(biāo)記。本發(fā)明SSR分子標(biāo)記差異性分析，篩選到鑒定番茄萼片形態(tài)的分子標(biāo)記，找到新型遺傳背景番茄材料在分子遺傳水平的多樣性，掘出SSR32分子標(biāo)記的功能，為番茄外觀形態(tài)育種提供資源，該SSR分子標(biāo)記適用于番茄外觀形態(tài)種質(zhì)資源的遺傳評(píng)價(jià)、種質(zhì)鑒定及分子標(biāo)記輔助育種研究，重復(fù)性好、可靠性高。為培育出新型外觀形態(tài)的番茄新品種提供行之有效的鑒定方法，從而增加鮮食番茄外觀多樣性及美觀度，同時(shí)本發(fā)明為番茄外觀形態(tài)種質(zhì)資源的遺傳評(píng)價(jià)提供新的依據(jù)。附圖說明圖1是待檢測(cè)番茄萼片包被野生型及番茄萼片包被突變體的外觀圖；其中，圖1A為萼片包被野生型的外觀圖，圖1B為番茄萼片包被突變體的外觀圖；圖2是本發(fā)明SSR分子標(biāo)記在待檢測(cè)番茄材料中的擴(kuò)增結(jié)果；其中，M泳道為Mark，1-10號(hào)泳道分別為10個(gè)番茄萼片包被野生型樣品，11-20號(hào)泳道分別為10個(gè)番茄萼片包被突變體樣品。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明的限制。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明提供的一種鑒定番茄萼片形態(tài)的SSR分子標(biāo)記引物，其序列如下：正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，為：5’-TGGAAAGAAGCAGTAGCATTG-3’；反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，為：5’-CAACGAACATCCTCCGTTCT-3’。本發(fā)明SSR分子標(biāo)記引物信息如表1所示。表1SSR分子標(biāo)記引物信息標(biāo)記SSR染色體2圖位(cM)58重疊基因Solyc02g082140.2正向引物5’-TGGAAAGAAGCAGTAGCATTG-3’反向引物5’-CAACGAACATCCTCCGTTCT-3’本發(fā)明還提供了一種利用上述SSR分子標(biāo)記引物擴(kuò)增得到的用于鑒定番茄萼片形態(tài)的SSR分子標(biāo)記，所述SSR分子標(biāo)記為SEQIDNO.3核苷酸序列和SEQIDNO.4所示的核苷酸序列，其中SEQIDNO.3核苷酸序列是：5’-TGGAAAGAAGCAGTAGGCATTGTAAAGAAGAAACATCTAGATATACTCTAGAATAACTAAAACCCTGTTTTCTCTTTCCTTTTTTCTTCTTCTTCTTCTCTCTCTCTACTGTTCCGTCGTCTGCTCATTTTTATCTTTCAGTATGAGTAAGGAGAAAGAACGGAGGATGTTCGTTG-3’。SEQIDNO.4所示的核苷酸序列是：5’-TGGAAAGAAGCAGTAGGCATTGTAAAGAAGAAACATCTAGATATACTCTAGAATAACTAAAACCCTGTTTTCTCTTTCCTTTTTTCTTCTTCTTCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTACTGTTCCGTCGTCTGCTCATTTTTATCTTTCAGTATGAGTAAGGAGAAAGAACGGAGGATGTTCGTTG-3’。具體按照以下方法鑒定番茄萼片形態(tài)：一、番茄材料種植本研究使用的番茄材料為本研究組得到的番茄萼片包被野生型及番茄萼片包被突變體，其外觀視圖見圖1，圖1A為萼片包被野生型的外觀圖，圖1B為番茄萼片包被突變體的外觀圖，萼片包被突變體為萼片向下彎曲、包裹果實(shí)生長(zhǎng)，萼片包被野生型為萼片平展生長(zhǎng)。上述番茄材料定植于西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院試驗(yàn)大棚內(nèi)，每份材料定植12株，株距35cm，行距60cm。二、鑒定番茄萼片形態(tài)步驟1，提取待檢測(cè)番茄材料的基因組DNA；采用改良CTAB法提取待檢測(cè)番茄材料的基因組DNA，所述改良CTAB法參考DNA提取文獻(xiàn)的記載，所述DNA提取文獻(xiàn)的出處為：孫亞東.2012.番茄果實(shí)主要品質(zhì)性狀的動(dòng)態(tài)變化及QTL定位.[博士學(xué)位論文].楊陵：西北農(nóng)林科技大學(xué)。步驟2，PCR擴(kuò)增：a.反應(yīng)體系：10μL體系，各組分物質(zhì)的含量分別為:1μL模板DNA、0.5μL正向引物、0.5μL反向引物、5μL2×TaqMasterMix、ddH2O補(bǔ)齊10μL，混勻，離心，其中，正向引物的序列為TGGAAAGAAGCAGTAGCATTG(SEQIDNO.1所示)，反向引物的序列為CAACGAACATCCTCCGTTCT(SEQIDNO.2所示)；其中模板DNA是待檢測(cè)番茄材料的基因組DNA，濃度為30ng/μL，正向引物和反向引物的濃度均為10μmol/L。b.擴(kuò)增程序：利用降落(Touchdown)PCR，包括第一循環(huán)程序和第二循環(huán)程序，其中第一循環(huán)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性1min；55-70℃退火45s，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.5℃；72℃延伸45s；20個(gè)循環(huán)后進(jìn)行第二循環(huán)程序；第二循環(huán)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性1min；45-60℃退火45s，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.5℃；72℃延伸45s；15個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min；最后4℃保存；步驟3，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳：將步驟2的擴(kuò)增產(chǎn)物與等體積的上樣緩沖液混合，95℃變性5min，之后在DNA測(cè)序電泳儀上進(jìn)行6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，65W條件下電泳1.5小時(shí)，電泳結(jié)束后，進(jìn)行銀染，并觀察擴(kuò)增結(jié)果；具體步驟如下：步驟3.1，電泳試劑配制：(1)0.5mol/LEDTA(pH8.0)配制：18.61gEDTA加蒸餾水80ml，磁力攪拌，用10mol/LNaOH(或固體NaOH)調(diào)節(jié)溶液至pH＝8.0，最終定容至100ml，121℃、25min高壓滅菌，備用。(2)10×TBE配制：108gTris、55g硼酸、40ml的0.5mol/LEDTA(pH8.0)、加水定容至1L；1×TBE緩沖液配制：10×TBE稀釋10倍；(3)6％聚丙烯酰胺凝膠配制：57g丙烯酰胺、3g甲叉雙丙烯酰胺、100ml10×TBE、420.24g尿素、加水定容至1L，加熱攪拌溶解。濾紙過濾，4℃避光保存。(4)凝膠的上樣緩沖液(LoadingBuffer)配制：49ml去離子甲酰胺、1ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)、0.05g二甲苯青FF、0.05g溴酚藍(lán)，混勻。(5)10％過硫酸銨：1g過硫酸銨，加水定容至10ml，4℃保存。(6)0.5％親和硅烷：親和硅烷15μL、冰醋酸15μL、無水乙醇3mL，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。(7)2％剝離硅烷：49ml氯仿(分析純)、1ml剝離硅烷，混勻，室溫保存。步驟3.2，銀染試劑配制(1)銀染液配方為：1gAgNO3、100ml無水乙醇、10ml冰醋酸加超純水定容至1L；(2)顯影液的配方為：30g氫氧化鈉、10ml甲醛、2L蒸餾水，混勻。步驟3.3，具體操作步驟3.3.1，擴(kuò)增產(chǎn)物變性：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入5μL上樣緩沖液，95℃變性5min后立即置于冰上待用；步驟3.3.2，變性聚丙烯酰胺凝膠制備(1)玻璃板清洗：用洗滌劑將玻璃板洗凈，用自來水徹底沖洗，用酒精擦凈，晾干，必要時(shí)用KOH/甲醇溶液清洗板上的舊污漬。(2)長(zhǎng)板涂上0.5％親和硅烷3mL，用紙巾涂抹均勻，晾干。短板涂上2％剝離硅烷mL，用紙巾涂抹均勻，晾干。在玻璃板邊緣放置邊條，合上兩塊玻璃板使兩個(gè)涂抹硅烷面相對(duì)朝內(nèi)，用夾子夾住兩塊玻璃板邊緣，放置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，使灌膠口一側(cè)略翹起。(3)凝膠制備：將6％聚丙烯酰胺凝膠60ml、TEMED50μL、10％APS500μL置于灌膠瓶中，充分混勻。(4)灌膠:把膠沿灌膠口緩緩灌入兩玻璃板空隙間，防止出現(xiàn)氣泡，灌膠完畢后在灌膠口插入梳子，梳齒朝外，插入梳子時(shí)需注意防止氣泡產(chǎn)生。凝膠聚合1h以上。步驟3.3.3，電泳(1)取下玻璃板上的鐵夾，將膠板安裝在電泳槽內(nèi)，利用1×TBE緩沖液將上下槽加滿。下槽緩沖液高度應(yīng)剛好沒過膠的下邊緣，上槽液緩沖液高度應(yīng)剛好沒過短板上沿。(2)用洗耳球吹凈點(diǎn)樣孔，輕輕地將梳齒插入加樣孔，向下推至剛好穿透凝膠表面。(3)取2-5μL變性后的擴(kuò)增產(chǎn)物加樣于點(diǎn)樣孔，65W功率電泳1.5h，電泳槽為北京六一廠DYCZ-20EDNA序列分析電泳槽，至溴酚藍(lán)染料到底時(shí)電泳結(jié)束。(4)回收電泳緩沖液，取下玻璃板平放置于桌面，小心將兩塊玻璃分開。步驟3.3.4，銀染(1)漂洗：將帶膠的長(zhǎng)板放入蒸餾水中，膠面朝上，漂洗兩次去除電泳緩沖液。(2)改良銀染：將玻璃板放入銀染液中，膠面朝上，輕遙振蕩約15min，直至二甲苯青顏色褪去，取出玻璃板用蒸餾水漂洗2次。(3)顯影：將玻璃板放入顯影液中，緩慢振蕩約7-10min，直至出現(xiàn)清晰條帶。取出玻璃板用水沖洗，用數(shù)碼相機(jī)對(duì)凝膠進(jìn)行照相。步驟4，結(jié)果判斷：擴(kuò)增結(jié)果中如果能夠檢測(cè)到176bp、184bp兩條帶，則待檢測(cè)中含有萼片包被突變體的概率為95％以上；其中176bp條帶的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，184bp條帶的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。我們分別對(duì)10個(gè)番茄萼片包被樣品和10個(gè)番茄萼片包被突變體樣品進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示，其中，M泳道為Mark，1-10號(hào)泳道分別為10個(gè)番茄萼片包被野生型樣品，11-20號(hào)泳道分別為10個(gè)番茄萼片包被突變體樣品。由圖2可以明顯看出，1-10號(hào)泳道只有176bp一條帶，而11-20號(hào)泳道有176bp、184bp兩條帶，番茄萼片包被突變體的檢出率為100％，大于95％。盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對(duì)這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型在內(nèi)。序列表<110>西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院<120>一種用于鑒定番茄萼片形態(tài)的SSR分子標(biāo)記、引物及應(yīng)用<160>4<170>PatentInversion3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1tggaaagaagcagtagcattg21<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2caacgaacatcctccgttct20<210>3<211>176<212>DNA<213>人工序列<400>3tggaaagaagcagtaggcattgtaaagaagaaacatctagatatactctagaataactaa60aaccctgttttctctttccttttttcttcttcttcttctctctctctactgttccgtcgt120ctgctcatttttatctttcagtatgagtaaggagaaagaacggaggatgttcgttg176<210>4<211>184<212>DNA<213>人工序列<400>4tggaaagaagcagtaggcattgtaaagaagaaacatctagatatactctagaataactaa60aaccctgttttctctttccttttttcttcttcttcttctctctctctctctctctactgt120tccgtcgtctgctcatttttatctttcagtatgagtaaggagaaagaacggaggatgttc180gttg184當(dāng)前第1頁1 2 3