本發(fā)明涉及一種天然的植物提取物，具體涉及一種從喙果皂帽花莖中提取的阿樸啡生物堿及提取方法。

背景技術：

喙果皂帽花（dasymaschalonrostratum）是番荔枝科喙果皂帽花屬（dasymaschalon）植物。近年來藥理篩選表明其具有很好的生物活性。例如周立冬等（喙果皂帽花的a環(huán)具酮基黃酮類化合物和氧化阿樸咔類生物堿【j】.中國中藥雜志，2001.26（1）：39）從其莖中分離得3個a環(huán)具酮基黃酮類化合物和1個氧化阿樸咔類生物堿，均具有抗腫瘤活性。宋煌旺、宋鑫明等（喙果皂帽花揮發(fā)油gc-ms分析及活性研究，中國實驗方劑學雜志，第19卷第16期，2013年8月）經過gc-ms分析喙果皂帽花葉揮發(fā)油得到91個化合物，堅定了73個化合物，占總含量的90.25%，主要為烯類化合物。喙果皂帽花葉的揮發(fā)油中含有很多活性成分，β-欖香烯能有效抑制多種腫瘤細胞的增殖，抑制腫瘤細胞核酸合成，誘導腫瘤細胞凋亡和分化，而且能增強腫瘤的免疫原性。α-石竹烯可強烈誘導小鼠肝和小腸中的解毒酶谷胱甘肽s-轉移酶活性而對化學致癌起抑制作用。

對喙果皂帽花進一步的化學成分分離、結構鑒定和物質用途的工作還需繼續(xù)進行。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種從喙果皂帽花中提取的阿樸啡生物堿及提取方法。

實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術方案是一種由下述式（ⅰ）表示的阿樸啡生物堿：

（?。?。

上述阿樸啡生物堿從喙果皂帽花中提取，包括以下步驟：

①將自然風干的喙果皂帽花的莖粉碎后用乙醇浸泡回流提取，將收集到的回流液合并、減壓蒸餾，得到乙醇總浸膏，然后將上述乙醇總浸膏均勻分散于蒸餾水中，用石油醚進行萃取，得到石油醚部位浸膏；對石油醚萃取后的水相進行酸堿處理，先用hcl調節(jié)水相ph值為1～2，用乙酸乙酯進行萃取，得到非生物堿層的乙酸乙酯部位浸膏；接著用naoh調節(jié)乙酸乙酯萃取后得到的水相的ph值為10～11，用氯仿進行萃取，得到生物堿層氯仿部位浸膏；

②將步驟①得到的生物堿層氯仿部位浸膏經過硅膠柱層析，采用氯仿-甲醇溶劑體系進行梯度洗脫，收集、濃縮、合并相同流分；

③將步驟②硅膠柱分離得到的第二大段組份依次進行硅膠柱色譜分離和sephadexlh-20葡聚糖凝膠柱層析分離，最后經高效液相色譜分離得到目標提取物阿樸啡生物堿。

上述步驟③中硅膠柱色譜分離使用的溶劑體系為氯仿∶甲醇=10∶1，sephadexlh-20葡聚糖凝膠柱層析分離使用的溶劑體系為氯仿∶甲醇=1∶3，高效液相色譜分離使用的流動相體系組成為60%乙腈和40%水。

本發(fā)明具有積極的效果：本發(fā)明從喙果皂帽花中提取獲得一種阿樸啡生物堿，該化合物對hiv-1型病毒具有較好的抑制活性。

附圖說明

圖1為本發(fā)明提取的阿樸啡生物堿的核磁共振氫譜圖。

圖2為本發(fā)明提取的阿樸啡生物堿的核磁共振碳譜圖。

圖3為本發(fā)明提取的阿樸啡生物堿的核磁共振無畸變極化轉移增強譜（dept）。

圖4為本發(fā)明提取的阿樸啡生物堿的氫氫相關譜(h-h-cosy譜)。

圖5為本發(fā)明提取的阿樸啡生物堿的hsqc譜。

圖6為本發(fā)明提取的阿樸啡生物堿的hmbc譜。

圖7為本發(fā)明提取的阿樸啡生物堿的x-ray單晶衍射圖。

圖8為本發(fā)明提取的阿樸啡生物堿的高分辨電噴霧電離質譜（hresims）圖。

具體實施方式

（實施例1）

本發(fā)明的從喙果皂帽花中提取的阿樸啡生物堿的分子式為c20h20n2o7，分子量為401.13443，外觀為無色油狀液體，易溶于氯仿、乙酸乙酯；其結構式如下式（ⅰ）：

（?。?。

從喙果皂帽花中提取上式阿樸啡生物堿的方法包括以下步驟：

①將22.5kg自然風干的喙果皂帽花的莖粉碎后，用體積分數(shù)為75%的乙醇浸泡回流提取3次，每次5天，將收集到的回流液合并、減壓蒸餾，得到920g的乙醇總浸膏，然后將上述乙醇總浸膏均勻分散于3.0l蒸餾水中，用石油醚（3×3.5l）進行萃取，得到石油醚部位浸膏（260g）；對石油醚萃取后的水相進行酸堿處理，先用1mol/l的hcl調節(jié)水相ph值為1～2，用乙酸乙酯（4×4.0l）進行萃取，得到非生物堿層乙酸乙酯部位浸膏（430g）；接著用1mol/l的naoh調節(jié)乙酸乙酯萃取后得到的水相的ph值為10～11，用氯仿（5×4.0l）進行萃取，得到生物堿層氯仿部位浸膏（35g）。

本實施例所用的喙果皂帽花的莖采自海南昌江縣霸王嶺國家森林保護區(qū)，標本存放于海南師范大學熱帶藥用植物化學省部共建教育部重點實驗室。

②將步驟①得到的35g生物堿部位的氯仿層浸膏經過硅膠柱層析，采用氯仿-甲醇溶劑體系，按照100∶0～0∶100（v/v）的梯度進行洗脫，每500ml收集流分，濃縮流分，通過tlc（薄層色譜）檢測，合并相同流分。

③將步驟②硅膠柱分離得到的第二大段組份依次進行硅膠柱色譜分離（溶劑體系氯仿∶甲醇=10∶1，v/v）和sephadexlh-20葡聚糖凝膠柱層析（溶劑體系為氯仿∶甲醇=1∶3，v/v）分離后，最后經高效液相色譜使用流動相60%乙腈和40%水（流動相中含0.1%二乙胺）分離得到目標提取物阿樸啡生物堿9.6mg。

目標提取物阿樸啡生物堿產品分析：

分離得到的目標提取物的旋光值為[α]²⁵d-158.2（檢測儀器為上海樸貝公司的jascop-1020型號的旋光儀）。

阿樸啡生物堿的核磁共振氫譜圖（布魯克(北京)科技有限公司av-iii400mhz型號核磁共振儀，以下檢測也使用該臺儀器，溶劑cdcl3，tms內標，400/100hz）見圖1。

阿樸啡生物堿的核磁共振碳譜圖（溶劑cdcl3，tms內標，100mhz）見圖2。

化合物的¹h和¹³c-nmr(400/100mhz,cdcl3)數(shù)據(jù)如下表1。

表1化合物1的¹h和¹³c-nmr(400/100mhz,cdcl3)數(shù)據(jù)(ppm)

阿樸啡生物堿的核磁共振無畸變極化轉移增強（dept）譜見圖3，溶劑cdcl3。

阿樸啡生物堿的氫氫相關譜(h-h-cosy譜)見圖4，溶劑cdcl3。

阿樸啡生物堿的hsqc譜見圖5，溶劑cdcl3。

阿樸啡生物堿的hmbc譜見圖6，溶劑cdcl3。

阿樸啡生物堿的x-ray衍射見圖7。

阿樸啡生物堿的高分辨電噴霧電離質譜圖（q-traplc/ms/mssystem質譜儀，esi源）見圖8，圖中[m+h]⁺的calc.mass—理論分子量為401.13445，實測分子量401.13443。

總結：根據(jù)化合物的圖8高分辨質譜數(shù)據(jù)401.13443[m+h]⁺，推算出該化合物的分子式為c20h20n2o7，不飽和度為12。

¹hnmr譜中顯示，在低場區(qū)有3個單峰的質子信號δh6.51(1h,s,h-10),6.00(1h,s,och2o),5.84(1h,s,och2o),3個甲氧基信號δh4.02(3h,s,ch3o-3),3.93(3h,s,ch3o-9)和3.94(3h,s,ch3o-11),1個次甲基信號δh3.71(1h,dt,j=14.8,2.0hz,h-6a),此外，還有3個亞甲基信號δh3.35(1h,m,h-5),2.87(1h,m,h-5),2.83(2h,m,h-4),2.78(1h,dd,j=14.8,4.0hz,h-7),2.44(1h,t,j=14.8hz,h-7)。¹³cnmr和dept顯示20個碳信號，包括2個苯環(huán)和8個sp³雜化碳(3個甲氧基，4個亞甲基，1個次甲基碳)。分析光譜數(shù)據(jù)可知該化合物是一個阿樸啡類生物堿化合物。結合¹h-¹hcosy,hsqc和hmbc譜分析可以進一步證實該化合物是一個阿樸啡類生物堿化合物。在hmbc譜中，通過h-och3-3與c-3、h-och3-9與c-9、h-och3-11與c-11的相關確定三個甲氧基分別連在c-3、c-9和c-11位。

從化合物hresims401.13443[m+h]⁺判定化合物中含兩個氮原子，且c-8位少了一個質子氫信號，推測c-8連有一個硝基。以上推測通過hmbc譜h-10,h-7與c-8的相關得到確認。同時，通過緩慢的揮發(fā)甲醇溶劑得到該化合物的單晶，圖7的x-ray衍射清晰證實了該化合物中c-8位連有一個硝基。通過x-ray衍射和左旋旋光值[α]²⁵d-158.2(c0.25,meoh)確定該化合物的絕對構型為6ar.因此，該化合物是一個含有硝基的阿樸啡生物堿，是一種天然化合物，結構式如上式（?。?。發(fā)明人將其命名為dasymaroinea。

（試驗例1、化合物的體外抗hiv活性評價）

試驗方法：取實施例1分離得到的阿樸啡生物堿對hiv-1進行活性測試。以hiv-1病毒感染的mt4細胞為實驗模型，以病毒引起合胞體的產生為評價指標，觀察藥物的作用。

將8×10⁵/mlc8166細胞50μl/孔接種到含有100μl/孔梯度倍比稀釋藥物的96孔細胞培養(yǎng)板上，然后加入50μl的hiv-1iiib稀釋上清，1300tcid50/孔(tcid5050%tissuecultureinfectivedose，即感染50%培養(yǎng)細胞所需病毒量)。設3個重復孔，同時設置不含藥物的正常細胞對照孔。置37℃，5%co2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)3天，倒置顯微鏡下(100×)計數(shù)合胞體的形成。ec50(50%effectiveconcentration)為抑制合胞體形成50%時的化合物濃度。mtt法測定細胞活性，確定cc50值。azt(3?-azido-3?-deoxythymidine)為陽性藥物對照。

試驗結果如下：

上表中：^acc50:半數(shù)細胞毒性濃度(50%cytotoxicconcentration)。

^bec50:半數(shù)有效濃度(50%effectiveconcentration)。

^cti治療指數(shù)(therapeuticindex)=cc50/ec50。

^dazt(3?-azido-3?-deoxythymidine)為陽性對照。

試驗結果表明該化合物有一定的細胞毒性，對hiv-1型病毒具有較好的抑制活性，ec50為4.50μm，治療指數(shù)(ti)為6.38。