本發(fā)明屬于樹(shù)形大分子的合成與改性技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型樹(shù)形化殺菌微球及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

水是生命之源，是人類(lèi)賴(lài)以生存和發(fā)展的基礎(chǔ)，是世界經(jīng)濟(jì)發(fā)展所必需的重要自然資源之一。目前，世界人均可獲得的水量每年平均為7300立方米，較1970年已經(jīng)下降了37％。在80年代后期地球?qū)嶋H淡水利用量大約為3000億m³/年，占可利用水源總量的1-3％，但是隨著現(xiàn)代社會(huì)工業(yè)和人口數(shù)量的迅速發(fā)展，人們對(duì)水的需求量以?xún)|合計(jì)數(shù)增長(zhǎng)，對(duì)水質(zhì)的要求也越來(lái)越高。而全球可供人類(lèi)直接使用的水?dāng)?shù)量占不到世界淡水資源的1％，約為地球全部水的0.007％。我國(guó)淡水資源總量居世界第四位，但人均可獲水量世界排名121位，是全球13個(gè)人均水資源最匱乏的國(guó)家之一。水資源短缺已成為不可改變的事實(shí)。

在工業(yè)飛速發(fā)展的時(shí)代，環(huán)境污染也隨之而來(lái)，空氣污染和水污染是當(dāng)前人們最關(guān)注的兩個(gè)方面。針對(duì)水污染如此嚴(yán)重的污染狀況，國(guó)家積極采取實(shí)施了“十二五”水污染防治戰(zhàn)略與政策，水污染情況有了明顯的改善。對(duì)于工業(yè)污水的排放，城鎮(zhèn)污水的處理以及飲用水水源的保護(hù)都有了明確的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，切實(shí)提高了污水治理情況。近幾年，鮮有關(guān)于河流大面積污染造成居民身體健康損傷的報(bào)道，但由于飲用不合格水給人們的健康造成威脅的消息卻還是層出不窮。這主要是由于人民經(jīng)濟(jì)水平提高，生活方式發(fā)生改變，由過(guò)去主要飲用煮沸的涼開(kāi)水變?yōu)轱嬘霉扪b水。眾所周知，罐裝水從制作到銷(xiāo)售要經(jīng)過(guò)繁多的工序和運(yùn)輸才能到達(dá)消費(fèi)者的手中，雖然都經(jīng)過(guò)嚴(yán)格把關(guān)，但難免會(huì)在某些環(huán)節(jié)出現(xiàn)紕漏造成污染。罐裝水的污染大多是病原體污染物引起的中毒或感染事件，病原體污染物主要是病毒、病菌、寄生蟲(chóng)等，若水資源沒(méi)有經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)膬艋幚恚磿?huì)流入水體，引起痢疾、傷寒、傳染性肝炎及血吸蟲(chóng)病等。

病原微生物即致病菌是指能引起疾病的微生物，包括細(xì)菌、病毒、螺旋體、立克次氏體、衣原體、支原體、真菌及放線菌等。一般所說(shuō)的致病菌單指的是細(xì)菌，細(xì)菌引發(fā)疾病的原因與毒力、侵入數(shù)量及侵入門(mén)戶(hù)有關(guān)。飲用水的檢測(cè)中常用作指示微生物的有：大腸桿菌噬菌體、總大腸菌群、類(lèi)大腸菌群、糞鏈球菌、葡萄球菌屬、雙歧桿菌屬、腸道病毒、產(chǎn)氣莢膜梭菌、銅綠假單胞菌、沙門(mén)氏菌屬、志賀氏菌屬、副溶血弧菌等。因?yàn)榇竽c桿菌是人體和哺乳動(dòng)物腸道中的常見(jiàn)細(xì)菌，若在飲用水和食物中檢出大量菌群，可當(dāng)作是被糞便污染的證據(jù)。大腸菌群數(shù)也常列入飲水、食物或藥物的衛(wèi)生學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。內(nèi)毒素、莢膜、外毒素和黏附素等是大腸桿菌的主要毒力因子。大腸桿菌入侵人體后可能會(huì)引起感染，引發(fā)腹膜炎、膽囊炎、膀胱炎及腹瀉等，癥狀大多表現(xiàn)為胃痛、嘔吐、腹瀉和發(fā)熱；感染嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致病患死亡，尤其是對(duì)免疫力差的小孩和老人。金黃色葡萄球菌作為一種重要病原菌，廣泛分布于自然界，可以引起局部性化膿感染，也能引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。金黃色葡萄球菌不僅會(huì)引起感染，還會(huì)分泌腸毒素導(dǎo)致食物污染引起食物中毒，為人類(lèi)的公共衛(wèi)生帶來(lái)嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。

日常水處理常用的傳統(tǒng)殺菌劑主要有氧化型和非氧化型兩大類(lèi)：氧化型殺菌劑是利用產(chǎn)生的次氯酸、原子態(tài)氧等，使微生物體內(nèi)一些與代謝有密切關(guān)系的酶發(fā)生氧化作用而殺滅微生物；由于氧化型殺菌劑具有殺菌力強(qiáng)、價(jià)格低廉、來(lái)源廣泛等一系列優(yōu)點(diǎn)，至今仍是應(yīng)用最廣泛的一類(lèi)殺菌劑，其中最常用的是氯氣、漂粉精和二氧化氯。而非氧化型殺菌劑是以致毒作用于微生物的特殊部位來(lái)達(dá)到殺菌效果的，其種類(lèi)較多，主要包括氯酚類(lèi)，戊二醛，有機(jī)硫類(lèi)，有機(jī)胺類(lèi)，殼聚糖等。殺菌指殺滅物體中的致病菌，可能物體中還存在芽孢或嗜熱菌等非致病菌，以上兩種類(lèi)型的物質(zhì)均能達(dá)到殺菌的效果，但傳統(tǒng)殺菌劑也有著不可克服的缺點(diǎn)：當(dāng)水源中有機(jī)物含量稍高，氧化型殺菌劑如氯氣殺菌將產(chǎn)生氯代有機(jī)物，可致癌；且穩(wěn)定性欠佳，易分解，運(yùn)輸貯藏成本高，存在爆炸等潛在威脅；在工業(yè)水處理時(shí)，對(duì)菌垢、粘泥的剝離和洗滌作用差。由于水溶性殺菌劑使用在水和液體食品中會(huì)殘留產(chǎn)生一定的危害，氧化型殺菌劑會(huì)產(chǎn)生毒性副產(chǎn)物，非氧化性殺菌劑則是余毒問(wèn)題，均存在“二次污染”的風(fēng)險(xiǎn)。因此，開(kāi)發(fā)一種高效安全、使用方便、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，同時(shí)又能不破壞營(yíng)養(yǎng)成分，無(wú)殘留的殺菌劑成了提高水質(zhì)的關(guān)鍵問(wèn)題之一。

針對(duì)傳統(tǒng)殺菌劑存在上述種種弊端，近年來(lái)，人們著眼于新型固定化殺菌劑的開(kāi)發(fā)，將非氧化型殺菌劑或其有效基團(tuán)引入大分子固體載體上，制成具有殺菌功能的水不溶性的殺菌劑。固定化殺菌劑具有殺菌時(shí)間短，持續(xù)時(shí)間久，基團(tuán)不易從載體中脫落等優(yōu)點(diǎn)，比小分子殺菌劑有更好的殺菌性能。同時(shí)，它還較難進(jìn)入動(dòng)植物體內(nèi)，可以有效避免“二次污染”。另一方面，固定化殺菌劑操作簡(jiǎn)單，回收方便，能夠重復(fù)使用，增加污水處理量，降低成本，使用范圍廣泛，其應(yīng)用前景十分廣闊。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明的新型樹(shù)形化殺菌微球，其結(jié)構(gòu)式如下：

其中代表大孔型交聯(lián)氯甲基化聚苯乙烯微球，俗稱(chēng)氯球，它的交聯(lián)度為8％dvb，含氮量19.15％，比表面43m²·g^-1，購(gòu)于南開(kāi)大學(xué)化工廠，是一種極易改性修飾的高分子樹(shù)脂。

本發(fā)明的新型樹(shù)形化殺菌微球的制備方法，以氯甲基化聚苯乙烯微球(以下簡(jiǎn)稱(chēng)氯球)為引發(fā)核，以乙二胺和丙烯酸甲酯為分子鏈，采用發(fā)散法通過(guò)micheal加成反應(yīng)進(jìn)行3代pamam樹(shù)形大分子的合成與固定，然后以對(duì)氨基苯磺酰胺(以下簡(jiǎn)稱(chēng)sa)為功能基進(jìn)行季銨化改性得到樹(shù)形化殺菌微球。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，本發(fā)明的新型樹(shù)形化殺菌微球的制備方法，括如下步驟：

(1)g0.5的合成：將氯球置于反應(yīng)溶劑dmf中浸泡使其充分溶脹，加入乙二胺及催化劑，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，90℃-110℃反應(yīng)10-12小時(shí)，將反應(yīng)后的g0.5濾出，洗滌后烘干備用；

(2)g1.0的合成：將步驟(1)得到的g0.5置于反應(yīng)溶劑甲醇中浸泡10-15h，在0℃～25℃溫度下，逐滴加入丙烯酸甲酯，n2保護(hù)下反應(yīng)20-24h，反應(yīng)完成后，將g1.0濾出，洗滌后烘干備用；

(3)g1.5的合成：將步驟(2)得到的g1.0置于反應(yīng)溶劑甲醇中浸泡使其充分溶脹，加入乙二胺及催化劑，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下40℃～60℃反應(yīng)10-12小時(shí)，將反應(yīng)后的g1.5濾出，洗滌后烘干備用；

(4)g2.0的合成：將步驟(3)得到的g1.5置于反應(yīng)溶劑甲醇中浸泡10-15h，在0℃～20℃溫度下，逐滴加入丙烯酸甲酯，n2保護(hù)下反應(yīng)20-24h，反應(yīng)完成后，將g2.0濾出，洗滌后烘干備用；

(5)g2.5的合成：將步驟(4)得到的g2.0置于反應(yīng)溶劑dmf中浸泡使其充分溶脹，加入乙二胺及催化劑，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下90℃～110℃反應(yīng)10-12小時(shí)，將反應(yīng)后的g2.5濾出，洗滌后烘干備用；

(6)g3.0的合成：將步驟(5)得到的g2.5置于反應(yīng)溶劑甲醇中浸泡10-15h，在0℃～20℃溫度下，逐滴加入丙烯酸甲酯，n2保護(hù)下反應(yīng)24h，反應(yīng)完成后，將g3.0濾出，洗滌后烘干備用；

(7)g3.0的季銨化改性：

將g3.0置于反應(yīng)溶劑水中浸泡使其充分溶脹，加入對(duì)氨基苯磺酰胺，攪拌反應(yīng)并全程通入n2保護(hù)，反應(yīng)12h后，從三頸燒瓶?jī)?nèi)將微球?yàn)V出；洗滌得到新型樹(shù)形化殺菌微球。

所述的催化劑為金屬鈉，加入量為氯球加入量的5％。

步驟(1)中氯球與乙二胺的摩爾比為1:3～5；步驟(3)中g(shù)1.0與乙二胺的摩爾比為1:3～5；步驟(5)中g(shù)2.0與乙二胺的摩爾比為1:4～6。

步驟(2)中g(shù)0.5與丙烯酸甲酯的摩爾比為1:3～5；步驟(4)中g(shù)1.5與丙烯酸甲酯的摩爾比為1:4～6；步驟(6)中g(shù)2.5與丙烯酸甲酯的摩爾比為1:4～6。

步驟(7)中g(shù)3.0與對(duì)氨基苯磺酰胺的摩爾比為1：1～5，反應(yīng)溫度為90℃。

本發(fā)明的制備方法所制備的樹(shù)形化殺菌微球在日常飲用水的殺菌工作中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果如下：

1、本發(fā)明的原材料氯球來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉，具有耐溶脹，耐氧化，耐磨損，耐溫度變化，不易碎裂，再生方便等優(yōu)點(diǎn)。而且氯球易改性與修飾，使其具有特定的化學(xué)特性，能固定更多不同類(lèi)型的殺菌功能基，性能穩(wěn)定，固載量大，殺菌效果也能夠更高。同時(shí)，氯球合成操作簡(jiǎn)單方便，更適合新型殺菌微球研發(fā)成功后的工業(yè)化生產(chǎn)。配體功能基則屬于季銨鹽類(lèi)樹(shù)形大分子，本身具有很好的殺菌性能，可極大的提高該新化合物的殺菌力。

2、本發(fā)明提供的以氯球?yàn)橐l(fā)核，以乙二胺和丙烯酸甲酯為支化單元合成的樹(shù)形殺菌劑是一種可高效殺菌的新型材料。它有效地增加了殺菌劑所帶的正電荷數(shù)量，增強(qiáng)了殺菌劑對(duì)細(xì)菌表面負(fù)電荷的作用力，增大與細(xì)菌的接觸面積，可達(dá)到快速高效批量殺菌的目的。

3、本發(fā)明提供的殺菌微球避免了殺菌劑對(duì)水體的“二次污染”，能夠有效克服可溶性殺菌劑殘留水體的問(wèn)題，從而確保食品安全，擴(kuò)大殺菌劑的應(yīng)用廣度。

4、本發(fā)明提供的殺菌微球可回收，可重復(fù)使用，能夠有效地提高資源的利用率。

附圖說(shuō)明

圖1是微球合成裝置搭建示意圖；

圖2是反應(yīng)溫度對(duì)g0.5～g1.0接枝率的影響示意圖；

圖3是反應(yīng)摩爾比對(duì)g0.5～g1.0接枝率的影響示意圖；

圖4是反應(yīng)溫度對(duì)g1.5～g2.0接枝率的影響示意圖；

圖5是反應(yīng)摩爾比對(duì)g1.5～g2.0接枝率的影響示意圖；

圖6是反應(yīng)溫度對(duì)g2.5～g3.0接枝率的影響示意圖；

圖7是反應(yīng)摩爾比對(duì)g2.5～g3.0接枝率的影響示意圖；

圖8是g0.5～g1.0微球紅外光譜分析圖；

圖9是g1.5～g2.0微球紅外圖譜分析圖；

圖10是g2.5～g3.0微球紅外圖譜分析；

圖11是g3.0、sa、sa-r的紅外光譜圖；

圖12是不同ph下殺菌微球?qū)u²⁺的負(fù)載量示意圖；

圖1中，1-三頸瓶，2-冷凝管，3-攪拌棒，4-溫度計(jì)，5-氮?dú)夤艿馈?/p>

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

本實(shí)施例中樹(shù)形化殺菌微球按照下述方法制備：

(1)g0.5的合成：稱(chēng)取15mg氯球置于100ml三頸瓶，并量取25ml反應(yīng)溶劑dmf加入，浸泡12h使載體充分溶脹。然后向三頸瓶?jī)?nèi)加入乙二胺及2.25g催化劑金屬鈉，氯球與乙二胺的摩爾比是1:3，通入n2保護(hù)，在90℃下攪拌反應(yīng)10h，將反應(yīng)后的g0.5濾出。先用反應(yīng)溶劑dmf沖洗3遍，置于1mol/lnaoh中浸泡8h。再依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)沖洗3次，放入50℃真空干燥箱烘干備用；

(2)g1.0的合成：稱(chēng)取接枝量最大的g0.515mg置于100ml三頸瓶，并加入25ml反應(yīng)溶劑甲醇浸泡12h，在0-25℃下，逐滴加入丙烯酸甲酯，g0.5與丙烯酸甲酯的摩爾比為1:3，n2保護(hù)下反應(yīng)20h。反應(yīng)完成后，將g1.0濾出，用反應(yīng)溶劑甲醇沖洗3遍，然后再依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)洗滌數(shù)次，置于50℃真空干燥備用。據(jù)文獻(xiàn)記載，g1.0的合成溫度在0℃～25℃之間，溶劑一般為甲醇或乙醇；

(3)g1.5的合成：將步驟(2)得到的g1.015ml置于25ml反應(yīng)溶劑甲醇中，浸泡12h使其充分溶脹，加入乙二胺及2.25g催化劑金屬鈉，g1.0與乙二胺的摩爾比為1:3，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下40℃反應(yīng)10h，將反應(yīng)后的g1.5濾出，先用反應(yīng)溶劑甲醇沖洗3遍，置于1mol/lnaoh中浸泡8h。再依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)沖洗3次，放入50℃真空干燥箱烘干備用；

(4)g2.0的合成：將步驟(3)得到的g1.515mg置于25ml反應(yīng)溶劑甲醇中浸泡10h，在0℃～20℃溫度下，逐滴加入丙烯酸甲酯，g1.5與丙烯酸甲酯的摩爾比為1:4，在n2保護(hù)下反應(yīng)20h，反應(yīng)完成后，將g2.0濾出，用反應(yīng)溶劑甲醇沖洗3遍，然后再依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)洗滌數(shù)次，置于50℃真空干燥備用；

(5)g2.5的合成：將步驟(4)得到的g2.015mg置于25ml反應(yīng)溶劑dmf中，浸泡12h使其充分溶脹，加入乙二胺及2.25g催化劑金屬鈉，g2.0與乙二胺的摩爾比為1:4，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下90℃反應(yīng)10小時(shí)，將反應(yīng)后的g2.5濾出，先用反應(yīng)溶劑dmf沖洗3遍，置于1mol/lnaoh中浸泡8h。再依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)沖洗3次，放入50℃真空干燥箱烘干備用；

(6)g3.0的合成：將步驟(5)得到的g2.515mg置于反應(yīng)溶劑甲醇中浸泡10h，在0℃～20℃溫度下，逐滴加入丙烯酸甲酯，g2.5與丙烯酸甲酯的摩爾比為1:4，在n2保護(hù)下反應(yīng)24h，反應(yīng)完成后，將g3.0濾出，用反應(yīng)溶劑甲醇沖洗3遍，然后再依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)洗滌數(shù)次，置于50℃真空干燥備用；

(7)g3.0的季銨化改性：量取25ml反應(yīng)溶劑水加入容積為100ml的三頸燒瓶中，并將15mgg3.0浸泡過(guò)夜。g3.0充分溶脹后，向三頸燒瓶?jī)?nèi)加入對(duì)氨基苯磺酰胺(sa)，g3.0與對(duì)氨基苯磺酰胺的摩爾比為1：1，在90℃下攪拌反應(yīng)并全程通入n2保護(hù)，反應(yīng)12h后，從三頸燒瓶?jī)?nèi)將微球?yàn)V出。然后用反應(yīng)溶劑水浸泡洗滌直至洗滌液無(wú)色或微球表面無(wú)明顯附著物，用蒸餾水洗滌后，再用naoh水溶液浸泡，水洗，再依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)洗滌數(shù)次后，過(guò)濾微球置于50℃下真空干燥備用。

實(shí)施例2

本實(shí)施例中樹(shù)形化殺菌微球按照下述方法制備：

(1)g0.5的合成：稱(chēng)取15mg氯球置于100ml三頸瓶，并量取25ml反應(yīng)溶劑dmf加入，浸泡12h使載體充分溶脹。然后向三頸瓶?jī)?nèi)加入乙二胺及2.25g催化劑金屬鈉，氯球與乙二胺的摩爾比是1:4，通入n2保護(hù)，在100℃下攪拌反應(yīng)11h，將反應(yīng)后的g0.5濾出。先用反應(yīng)溶劑dmf沖洗3遍，置于1mol/lnaoh中浸泡8h。再依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)沖洗3次，放入50℃真空干燥箱烘干備用；

(2)g1.0的合成：稱(chēng)取接枝量最大的g0.515mg置于100ml三頸瓶，并加入25ml反應(yīng)溶劑甲醇浸泡12h，在0-25℃下，逐滴加入丙烯酸甲酯，g0.5與丙烯酸甲酯的摩爾比為1:4，n2保護(hù)下反應(yīng)22h。反應(yīng)完成后，將g1.0濾出，用反應(yīng)溶劑甲醇沖洗3遍，然后再依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)洗滌數(shù)次，置于50℃真空干燥備用。據(jù)文獻(xiàn)記載，g1.0的合成溫度在0℃～25℃之間，溶劑一般為甲醇或乙醇；

(3)g1.5的合成：將步驟(2)得到的g1.015ml置于25ml反應(yīng)溶劑甲醇中，浸泡12h使其充分溶脹，加入乙二胺及2.25g催化劑金屬鈉，g1.0與乙二胺的摩爾比為1:4，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下50℃反應(yīng)11h，將反應(yīng)后的g1.5濾出，先用反應(yīng)溶劑甲醇沖洗3遍，置于1mol/lnaoh中浸泡8h。再依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)沖洗3次，放入50℃真空干燥箱烘干備用；

(4)g2.0的合成：將步驟(3)得到的g1.515mg置于25ml反應(yīng)溶劑甲醇中浸泡13h，在0℃～20℃溫度下，逐滴加入丙烯酸甲酯，g1.5與丙烯酸甲酯的摩爾比為1:5，在n2保護(hù)下反應(yīng)22h，反應(yīng)完成后，將g2.0濾出，用反應(yīng)溶劑甲醇沖洗3遍，然后再依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)洗滌數(shù)次，置于50℃真空干燥備用；

(5)g2.5的合成：將步驟(4)得到的g2.015mg置于25ml反應(yīng)溶劑dmf中，浸泡12h使其充分溶脹，加入乙二胺及2.25g催化劑金屬鈉，g2.0與乙二胺的摩爾比為1:5，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下100℃反應(yīng)11h，將反應(yīng)后的g2.5濾出，先用反應(yīng)溶劑dmf沖洗3遍，置于1mol/lnaoh中浸泡8h。再依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)沖洗3次，放入50℃真空干燥箱烘干備用；

(6)g3.0的合成：將步驟(5)得到的g2.515mg置于反應(yīng)溶劑甲醇中浸泡13h，在0℃～20℃溫度下，逐滴加入丙烯酸甲酯，g2.5與丙烯酸甲酯的摩爾比為1:5，在n2保護(hù)下反應(yīng)24h，反應(yīng)完成后，將g3.0濾出，用反應(yīng)溶劑甲醇沖洗3遍，然后再依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)洗滌數(shù)次，置于50℃真空干燥備用；

(7)g3.0的季銨化改性：量取25ml反應(yīng)溶劑水加入容積為100ml的三頸燒瓶中，并將15mgg3.0浸泡過(guò)夜。g3.0充分溶脹后，向三頸燒瓶?jī)?nèi)加入對(duì)氨基苯磺酰胺(sa)，g3.0與對(duì)氨基苯磺酰胺的摩爾比為1：1～5，在90℃下攪拌反應(yīng)并全程通入n2保護(hù)，反應(yīng)12h后，從三頸燒瓶?jī)?nèi)將微球?yàn)V出。然后用反應(yīng)溶劑水浸泡洗滌直至洗滌液無(wú)色或微球表面無(wú)明顯附著物，用蒸餾水洗滌后，再用naoh水溶液浸泡，水洗，再依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)洗滌數(shù)次后，過(guò)濾微球置于50℃下真空干燥備用。

實(shí)施例3

本實(shí)施例中樹(shù)形化殺菌微球按照下述方法制備：

(1)g0.5的合成：稱(chēng)取15mg氯球置于100ml三頸瓶，并量取25ml反應(yīng)溶劑dmf加入，浸泡12h使載體充分溶脹。然后向三頸瓶?jī)?nèi)加入乙二胺及2.25g催化劑金屬鈉，氯球與乙二胺的摩爾比是1:5，通入n2保護(hù)，在110℃下攪拌反應(yīng)12h，將反應(yīng)后的g0.5濾出。先用反應(yīng)溶劑dmf沖洗3遍，置于1mol/lnaoh中浸泡8h。再依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)沖洗3次，放入50℃真空干燥箱烘干備用；

(2)g1.0的合成：稱(chēng)取接枝量最大的g0.515mg置于100ml三頸瓶，并加入25ml反應(yīng)溶劑甲醇浸泡12h，在0-25℃下，逐滴加入丙烯酸甲酯，g0.5與丙烯酸甲酯的摩爾比為1:5，n2保護(hù)下反應(yīng)24h。反應(yīng)完成后，將g1.0濾出，用反應(yīng)溶劑甲醇沖洗3遍，然后再依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)洗滌數(shù)次，置于50℃真空干燥備用。據(jù)文獻(xiàn)記載，g1.0的合成溫度在0℃～25℃之間，溶劑一般為甲醇或乙醇；

(3)g1.5的合成：將步驟(2)得到的g1.015ml置于25ml反應(yīng)溶劑甲醇中，浸泡12h使其充分溶脹，加入乙二胺及2.25g催化劑金屬鈉，g1.0與乙二胺的摩爾比為1:5，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下60℃反應(yīng)12小時(shí)，將反應(yīng)后的g1.5濾出，先用反應(yīng)溶劑甲醇沖洗3遍，置于1mol/lnaoh中浸泡8h。再依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)沖洗3次，放入50℃真空干燥箱烘干備用；

(4)g2.0的合成：將步驟(3)得到的g1.515mg置于25ml反應(yīng)溶劑甲醇中浸泡15h，在0℃～20℃溫度下，逐滴加入丙烯酸甲酯，g1.5與丙烯酸甲酯的摩爾比為1:6，在n2保護(hù)下反應(yīng)24h，反應(yīng)完成后，將g2.0濾出，用反應(yīng)溶劑甲醇沖洗3遍，然后再依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)洗滌數(shù)次，置于50℃真空干燥備用；

(5)g2.5的合成：將步驟(4)得到的g2.015mg置于25ml反應(yīng)溶劑dmf中，浸泡12h使其充分溶脹，加入乙二胺及2.25g催化劑金屬鈉，g2.0與乙二胺的摩爾比為1:6，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下110℃反應(yīng)12小時(shí)，將反應(yīng)后的g2.5濾出，先用反應(yīng)溶劑dmf沖洗3遍，置于1mol/lnaoh中浸泡8h。再依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)沖洗3次，放入50℃真空干燥箱烘干備用；

(6)g3.0的合成：將步驟(5)得到的g2.515mg置于反應(yīng)溶劑甲醇中浸泡15h，在0℃～20℃溫度下，逐滴加入丙烯酸甲酯，g2.5與丙烯酸甲酯的摩爾比為1:6，在n2保護(hù)下反應(yīng)24h，反應(yīng)完成后，將g3.0濾出，用反應(yīng)溶劑甲醇沖洗3遍，然后再依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)洗滌數(shù)次，置于50℃真空干燥備用；

(7)g3.0的季銨化改性：量取25ml反應(yīng)溶劑水加入容積為100ml的三頸燒瓶中，并將15mgg3.0浸泡過(guò)夜。g3.0充分溶脹后，向三頸燒瓶?jī)?nèi)加入對(duì)氨基苯磺酰胺(sa)，g3.0與對(duì)氨基苯磺酰胺的摩爾比為1：5，在90℃下攪拌反應(yīng)并全程通入n2保護(hù)，反應(yīng)12h后，從三頸燒瓶?jī)?nèi)將微球?yàn)V出。然后用反應(yīng)溶劑水浸泡洗滌直至洗滌液無(wú)色或微球表面無(wú)明顯附著物，用蒸餾水洗滌后，再用naoh水溶液浸泡，水洗，再依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)洗滌數(shù)次后，過(guò)濾微球置于50℃下真空干燥備用。

1.本發(fā)明中g(shù)3.0的合成路線如下：

g0.5的合成：

g1.0的合成：

g1.5的合成：

g2.0的合成：

g2.5的合成：

g3.0的合成：

季銨化改性：

2.本發(fā)明g0.5～g1.0微球接枝條件探討及表征

2.1反應(yīng)試劑對(duì)g0.5～g1.0微球接枝率的影響

本發(fā)明選用甲醇、n，n-二甲基甲酰胺(dmf)、乙醇、水、甲苯作為反應(yīng)溶劑進(jìn)行探討。

表1反應(yīng)溶劑對(duì)g0.5～g1.0微球接枝率的影響

2.2反應(yīng)溫度對(duì)g0.5～g1.0微球接枝率的影響

反應(yīng)溫度對(duì)g0.5～g1.0接枝率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3反應(yīng)摩爾比對(duì)g0.5～g1.0微球接枝率的影響

反應(yīng)摩爾比對(duì)g0.5～g1.0接枝率的影響見(jiàn)圖3，由表1、圖2和圖3得g0.5微球與g1.0微球的最佳反應(yīng)條件，最佳反應(yīng)條件見(jiàn)表2。

表2g0.5～g1.0微球最佳反應(yīng)條件

3.g1.5～g2.0微球接枝條件探討及表征

3.1反應(yīng)試劑對(duì)g1.5～g2.0微球接枝率的影響

表3反應(yīng)溶劑對(duì)g1.5～g2.0微球接枝率的影響

3.2反應(yīng)溫度對(duì)g1.5～g2.0微球接枝率的影響

反應(yīng)溫度對(duì)g1.5～g2.0接枝率的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

3.3反應(yīng)摩爾比對(duì)g1.5～g2.0微球接枝率的影響

反應(yīng)摩爾比對(duì)g1.5～g2.0接枝率的影響結(jié)果見(jiàn)圖5，由表3、圖4和圖5可以得出g1.5～g2.0的最佳反應(yīng)條件，最佳反應(yīng)條件見(jiàn)表4。

表4g1.5～g2.0微球最佳反應(yīng)條件

4.g2.5～g3.0微球接枝條件探討及表征

4.1反應(yīng)試劑對(duì)g2.5～g3.0微球接枝率的影響

反應(yīng)溶劑對(duì)g2.5～g3.0微球接枝率的影響結(jié)果見(jiàn)表5。

表5反應(yīng)溶劑對(duì)g2.5～g3.0微球接枝率的影響

4.2反應(yīng)溫度對(duì)g2.5～g3.0微球接枝率的影響

反應(yīng)溫度對(duì)g2.5～g3.0接枝率的影響結(jié)果見(jiàn)圖6。

4.3反應(yīng)摩爾比對(duì)g2.5～g3.0微球接枝率的影響

反應(yīng)摩爾比對(duì)g2.5～g3.0接枝率的影響結(jié)果見(jiàn)圖7，表5、由圖6和圖7可得g2.5～g3.0微球的最佳反應(yīng)條件，最佳反應(yīng)條件見(jiàn)表6。

表6g2.5～g3.0微球最佳反應(yīng)條件

5.紅外表征

5.1g0.5～g1.0微球紅外光譜分析

g0.5～g1.0微球紅外光譜分析如圖8所示，上圖三條曲線分別是(a)氯球(ps-cl)、(b)g0.5微球、(c)g1.0微球的紅外光譜圖。通過(guò)(a)(b)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，氯球中原本存在的1264.46cm^-1、674.72cm^-1表示c-cl鍵的紅外特征峰消失了，這表示在g0.5合成時(shí)，氯球中的芐氯基是反應(yīng)的主要活性位點(diǎn)。此外，3406.32cm^-1、3137.00cm^-1處峰形發(fā)生改變，由于此處主要是-oh及-nh的紅外峰，試驗(yàn)中并未引入其他反應(yīng)功能基，可以認(rèn)為芐氯基與乙二胺發(fā)生反應(yīng)引起氨基變化。(b)(c)相比較，主要是g1.0中，1736.90cm^-1處酯鍵中c＝o強(qiáng)吸收峰出現(xiàn)，證明g1.0中出現(xiàn)酯鍵，表示丙烯酸甲酯與g0.5合成反應(yīng)發(fā)生。而g0.5微球中的3460cm^-1處寬峰變?yōu)?545.26cm^-1，3460.00cm^-1和3415.79cm^-1三個(gè)窄峰也顯示了酰胺鍵的變化。

5.2g1.5～g2.0微球紅外圖譜分析

圖9分別是(a)g1.0微球紅外譜圖，(b)g1.5微球紅外譜圖，(c)g2.0微球紅外譜圖。與(a)(b)曲線相比，g1.0微球中代表末端酯基c＝o的1736.90cm^-1處在g1.5微球中減弱發(fā)生峰移至1733.67cm^-1。這說(shuō)明c＝o鍵發(fā)生變化，c-n鍵的形成減弱了c＝o鍵間的作用力。同時(shí)，3545.26cm^-1,3460.90cm^-1以及3415.29cm^-1的變化也驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)，-nh2發(fā)生改變。而1169.50cm^-1代表c-o-c鍵，在(b)中幾乎消失，只有1113.05cm^-1處有不明顯的峰型，這都表示g1.0微球末端的酯鍵發(fā)生變化且與乙二胺有關(guān)，推斷出g1.5微球的合成成立。(b)(c)的比較主要的變化也是在g2.0的1736.24cm^-1處又有酯端基生成，還有1669.58cm^-1處的c＝c鍵發(fā)生變化，表示g2.0的合成。

5.3g2.5～g3.0微球紅外圖譜分析

圖10中分別表示(a)g2.0微球(b)g2.5微球(c)g3.0微球紅外光譜，g2.5微球的1737.7cm^-1減弱，這表示c＝o鍵發(fā)生變化；3411cm^-1處單鍵變成3472.63cm^-1，3472.63cm^-1處雙鍵，表示有酰胺發(fā)生反應(yīng)，證明乙二胺與末端甲酯鍵發(fā)生反應(yīng)。接枝是乙二胺與丙烯酸甲酯反復(fù)加成所得，圖譜指紋區(qū)的很多特征峰被掩蓋，無(wú)法做出判斷只能通過(guò)簡(jiǎn)單的酰胺鍵與酯羰基鍵變化來(lái)判斷。g3.0的合成也是通過(guò)1738.8cm^-1處羰基的生成來(lái)判斷。

6.g3季銨化改性的最佳合成條件

表7季銨化改性的最佳合成條件

紅外表征：如圖11所示，對(duì)氨基苯磺酰胺(sa)的1164cm^-1、1122cm^-1、1037cm^-1、1009cm^-1是磺酸基的特征峰。在sa與g3.0發(fā)生反應(yīng)后，sa-r中1736cm^-1處c＝o鍵消失，說(shuō)明是g3.0中的末端的酯鍵參與。而且合成后微球的1617cm^-1處雙峰變?yōu)?623cm^-1處單峰，且在其紅外圖譜上出現(xiàn)1168cm-1，1122cm-1，1031cm-1等磺酸基的特征峰，表示與g3.0發(fā)生反應(yīng)的是-nh2而不是磺酸基。在最佳合成條件下所得微球的元素分析可計(jì)算出sa-r的功能基轉(zhuǎn)化率為92％左右，與紅外峰的完全消失基本吻合。

復(fù)合微球殺菌性能探究：

1.菌株處理與菌懸液制備

本實(shí)驗(yàn)以革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌(e.coli)和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌金黃色葡萄球菌(s.aureus)作為受試菌，具體實(shí)驗(yàn)操作步驟及評(píng)價(jià)方法如下：

所用菌株均作為儲(chǔ)備培養(yǎng)物置于輔以15％(v/v)甘油的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，保持于-20℃儲(chǔ)存。然后將菌株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(以下簡(jiǎn)稱(chēng)lb培養(yǎng)基)內(nèi)，37℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)12h；活化后用移液槍取出一定量菌液，在4000rpm下離心洗滌。將所得菌斑用0.85％的生理鹽水通過(guò)十倍稀釋法稀釋成濃度約為10⁶cfu·ml^-1的菌懸液備用。

2.新型殺菌微球的殺菌效果測(cè)試

在250ml的搖瓶中制備適當(dāng)?shù)木鷳乙?，將其分為?shí)驗(yàn)組與對(duì)照組。在實(shí)驗(yàn)組中加入充分溶脹的殺菌微球sa-r，對(duì)照組中不加入微球，振蕩混合。在充分接觸一定時(shí)間后，按照gb/t4789.3-2010提供的方法，將各組上清液分別逐級(jí)稀釋?zhuān)♂屩吝m宜濃度后用移液槍吸取1ml置于瓊脂培養(yǎng)基上用玻璃涂布棒涂勻，倒置平板于37℃下培養(yǎng)進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)。通過(guò)以下公式計(jì)算微球的殺菌率：

其中：b％表示殺菌率；n1為對(duì)照組活菌數(shù)；n2為實(shí)驗(yàn)組活菌數(shù)。

3.殺菌微球mic(minimuminhibitoryconcentration)的測(cè)定

在250ml搖瓶中配置100mllb培養(yǎng)基，于121℃20min條件下高溫殺菌。在搖瓶中各接入5％的受試菌液，振蕩搖勻后用5ml的移液槍分裝于不同的試管，每支試管加入5ml，做標(biāo)記。在實(shí)驗(yàn)組中按照二倍稀釋法加入不同質(zhì)量的微球，對(duì)照組不加微球。將兩組試管在37℃200r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，通過(guò)測(cè)定od600值來(lái)判斷最小抑菌濃度。

4.殺菌微球mbc(minimumbactericidalconcentration)的測(cè)定

預(yù)實(shí)驗(yàn)中殺菌微球?qū)κ茉嚲臍⒕阅軙?huì)受到lb培養(yǎng)基內(nèi)容物的影響，且殺菌率不會(huì)達(dá)到100％，未殺滅的菌株會(huì)在lb培養(yǎng)基中繼續(xù)生長(zhǎng)，只能看出微球具有抑菌作用。故在測(cè)定mbc值時(shí)，選用生理鹽水中作為殺菌環(huán)境。

取若干殺菌的18mm*18cm試管，每支試管加入10ml菌濃度為10⁶cfu·ml^-10.85％的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)組中加入不同量的殺菌微球，對(duì)照組不加微球，在37℃200r/min的振蕩培養(yǎng)箱中充分接觸12h，通過(guò)平板計(jì)數(shù)法計(jì)算殺菌率，得出最小殺菌濃度。

5.殺菌微球?qū)u²⁺的吸附測(cè)試

準(zhǔn)確稱(chēng)取15.0mg的殺菌微球于100ml的碘量瓶中，加入25.0ml不同ph的hac-naac緩沖液充分溶脹后，加入濃度為3.0mg·ml^-1的cu²⁺溶液5.0ml，以不加入微球組作為空白對(duì)照試驗(yàn)，常溫下恒溫振蕩，轉(zhuǎn)速100rpm·min^-1，至吸附平衡后取上清液測(cè)定溶液中剩余cu²⁺含量，根據(jù)以下公式推算吸附量q。

式中

co－吸附前金屬離子濃度(mg·ml^-1)，

ce－吸附平衡后金屬離子濃度(mg·ml^-1)，

q－樹(shù)脂的靜態(tài)飽和吸附量(mg·g^-1)，

v－溶液體積(ml)，

m－樹(shù)脂的干重(g)。

6.銅離子對(duì)殺菌微球的mic、mbc的影響

以負(fù)載銅離子后的殺菌微球作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，按照上述殺菌微球mic、mbc值的測(cè)定方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，觀察每種微球的mic值與mbc值的變化。

結(jié)果：1.

表8sa-r復(fù)合殺菌微球的mic和mbc

sa-r的mic與mbc基本呈現(xiàn)2倍關(guān)系的狀態(tài)，對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別是0.5mg/ml、1.0mg/ml和0.4mg/ml、0.78mg/ml，所以sa-r微球?qū)Υ竽c桿菌的殺菌效率更好。

2.殺菌微球?qū)u²⁺的吸附

本實(shí)驗(yàn)主要探討了ph值在2.0～6.0范圍內(nèi)對(duì)殺菌微球負(fù)載cu²⁺的影響，因?yàn)榻橘|(zhì)的ph是影響樹(shù)脂類(lèi)微球吸附量的主要因素之一，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖12所示。

3.負(fù)載cu²⁺殺菌微球的mic、mbc的測(cè)定

表9載cu²⁺殺菌微球的mic、mbc值

負(fù)載cu²⁺后殺菌微球?qū)Υ竽c桿菌和金黃色葡萄球菌的mic值均有所升高，殺菌效果有所降低?？赡苁怯捎谖絚u²⁺后占據(jù)了微球殺菌的活性位點(diǎn)，由于空間位阻效應(yīng)導(dǎo)致殺菌效果降低。

4.殺菌微球的重復(fù)利用

hcl與et(oh)以1：3的體積比混合成洗脫液可使微球再生，然后測(cè)定重生后微球的吸附量與殺菌率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下。

表10sa對(duì)cu²⁺、s.aureus、e.coil的重復(fù)利用率