本發(fā)明屬于食品/基因檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)用多重pcr試劑盒及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

目前，國內(nèi)外報(bào)道的轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)技術(shù)主要分為三類，一類是基于核酸的檢測(cè)技術(shù)；二是基于蛋白質(zhì)的酶學(xué)和免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)；第三類是轉(zhuǎn)基因檢測(cè)新技術(shù)，包括向自動(dòng)化技術(shù)發(fā)展的生物傳感器與生物芯片、基于現(xiàn)代分析儀器的近紅外光譜和質(zhì)譜分析技術(shù)等。第二類基于蛋白質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)是對(duì)轉(zhuǎn)基因植物中外源基因表達(dá)的蛋白進(jìn)行檢測(cè)，這些蛋白在加工過程中易受到破壞而失活、分解或消失，檢查結(jié)果易出現(xiàn)假陰性且方法的重復(fù)性差。近些年發(fā)展的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)新技術(shù)如生物傳感器、色譜法和近紅外光譜法等，此類技術(shù)目前仍處于研究階段，存在一些暫時(shí)無法有效解決或客觀存在的缺點(diǎn)，如色譜法只適用于轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的成分發(fā)生重大變化時(shí)的定性檢測(cè)分析，該類檢測(cè)技術(shù)短期內(nèi)仍無法有效推廣應(yīng)用。因此，我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)以核酸檢測(cè)技術(shù)為主，該類檢測(cè)技術(shù)包括pcr技術(shù)、恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、southern雜交、基因芯片技術(shù)、熒光定量pcr等。

多重pcr是在普通pcr的基礎(chǔ)上，于同一個(gè)反應(yīng)體系中利用多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增多段靶序列的pcr技術(shù)。自多重pcr報(bào)道以來，由于其高效性、靈敏性和經(jīng)濟(jì)簡便性，已廣泛應(yīng)用于核酸診斷的多個(gè)領(lǐng)域，如遺傳疾病診斷、突變和多態(tài)性分析、病原體檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因鑒定等；多重pcr體系，一般包括以下試劑：pcr緩沖液、taq酶、dntp、mgcl2、多重引物、模板和去離子水。

我國目前允許進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因大豆高達(dá)12種（具體包括gts-40-3-2、mon87701、mon89788、mon87701×mon89788、cv127-9、a2704-12、dp356043、dp305423、a5547、305423×40-3-2、mon87769、mon87708，其中mon87701×mon89788和305423×40-3-2為復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因大豆）。

轉(zhuǎn)基因作物是利用基因工程技術(shù)將外源目的基因轉(zhuǎn)入植物中培育而出的，它們具有抗蟲、抗除草劑、抗逆和營養(yǎng)改良等優(yōu)良特性。全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積自1996年的0.17億公頃增加到2015年的1.797億公頃。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)化與商業(yè)化的程度不斷加深，我國陸續(xù)針對(duì)轉(zhuǎn)基因作物制定了相關(guān)法律法規(guī)，然而，公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因食品安全的擔(dān)憂及對(duì)所食用食品是否含有轉(zhuǎn)基因成分的知情權(quán)仍與日俱增，因此，快速、準(zhǔn)確、敏感的轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)技術(shù)是所有轉(zhuǎn)基因安全性評(píng)價(jià)等法律法規(guī)真正落到實(shí)處的基礎(chǔ)和關(guān)鍵之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆的多重pcr試劑盒，用于我國目前批準(zhǔn)進(jìn)口（即已頒發(fā)安全證書）的12種轉(zhuǎn)基因大豆的單一或者同時(shí)多重pcr檢測(cè)，通過設(shè)計(jì)公共引物及轉(zhuǎn)基因大豆特異性引物，限定多重pcr檢測(cè)體系和條件，可檢測(cè)食品（比如大豆、大豆制品、含有大豆成份的食物等）中是否含有轉(zhuǎn)基因大豆成分。

為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)用多重pcr試劑盒，包括公共引物、針對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆的嵌合引物；所述公共引物的序列為seqidno.1；所述針對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆的嵌合引物為seqidno.2至seqidno.18所示的核苷酸序列中的一種或幾種。

上述技術(shù)方案中，所述轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)用多重pcr試劑盒還包括taq聚合酶、dntp、mgcl2、pcr緩沖液、去離子水、陽性對(duì)照引物對(duì)；其中所述陽性對(duì)照引物對(duì)的序列優(yōu)選為seqidno.19、seqidno.20；可用來檢測(cè)dna模板質(zhì)量和反應(yīng)體系擴(kuò)增效率；

seqidno.19：gccctctactccacccccatcc

seqidno.20：gcccatctgcaagcctttttgtg。

上述技術(shù)方案中，進(jìn)行pcr反應(yīng)時(shí)，采用兩步退火溫度法，前10個(gè)循環(huán)退火溫度為61℃；后30個(gè)循環(huán)退火溫度為54℃。第一步退火溫度高于第二步的退火溫度5～10℃；比如前10個(gè)循環(huán)的退火溫度高于后30個(gè)循環(huán)退火溫度7℃，可有效提高檢測(cè)的特異性；進(jìn)行多重pcr反應(yīng)時(shí)，針對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆的每條嵌合引物的終濃度在8～80nm之間，公共引物的終濃度為1600nm。

本發(fā)明還公開了一種檢測(cè)產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因大豆成分的方法，提取待檢測(cè)產(chǎn)品基因組dna作為模板（比如轉(zhuǎn)基因大豆的插入基因與大豆基因組的連接區(qū)為靶標(biāo)序列），在嵌合引物與公共引物存在下采用兩步退火溫度法進(jìn)行pcr反應(yīng)，對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析即完成產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因大豆成分的檢測(cè)；最后對(duì)pcr產(chǎn)物擴(kuò)增進(jìn)行電泳分析，即完成產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因大豆成分的檢測(cè)；所述公共引物的序列為seqidno.1；所述嵌合引物為seqidno.2至seqidno.18所示的核苷酸序列中的一種或幾種。

上述技術(shù)方案中，第一步（即前10個(gè)循環(huán)）多重pcr擴(kuò)增的退火溫度高于第二步（即后30個(gè)循環(huán)）多重pcr擴(kuò)增的退火溫度5～10℃；每條嵌合引物的終濃度在8～80nm之間，公共引物的終濃度為1600nm；所述產(chǎn)品為包含大豆成分的食品。具體可包括以下步驟：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，共10個(gè)循環(huán)；72℃延伸2min；95℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min。前10個(gè)循環(huán)，在高退火溫度下，低濃度的嵌合引物中特異引物擴(kuò)增靶標(biāo)序列，產(chǎn)生帶有公共引物末端的pcr產(chǎn)物；后30個(gè)循環(huán)，在低退火溫度下，高濃度的公共引物以早期產(chǎn)生的帶有公共引物末端的pcr產(chǎn)物為模板進(jìn)行大量擴(kuò)增。根據(jù)本發(fā)明的方法可以有效、簡便的檢測(cè)產(chǎn)品中，尤其是食品中是否含有轉(zhuǎn)基因大豆成分，為國民知情權(quán)以及食品安全做出巨大貢獻(xiàn)。

本發(fā)明公開的轉(zhuǎn)基因大豆成分核酸檢測(cè)方法準(zhǔn)確，可同時(shí)檢測(cè)12中目標(biāo)基因，而且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，可解決公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因食品安全的擔(dān)憂及對(duì)所食用食品是否含有轉(zhuǎn)基因成分的知情權(quán)。

本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)用引物，包括公共引物、針對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆的嵌合引物；所述公共引物的序列為seqidno.1；所述針對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆的嵌合引物為seqidno.2至seqidno.18所示的核苷酸序列中的一種或幾種。

本發(fā)明還公開了上述轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)用引物在制備檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆的多重pcr試劑盒中的應(yīng)用或者權(quán)利要求8所述轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)用引物在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆中的應(yīng)用。

本發(fā)明中，所述公共引物的序列seqidno.1及所述嵌合引物的核苷酸序列如下所示：

所述嵌合引物為針對(duì)12種轉(zhuǎn)基因大豆的嵌合引物；a2704與a5547共用上游引物seqidno.11，mon89788、mon87769和mon87708共用下游引物seqidno.18。305423×40-3-2、mon87701×mon89788是兩種基因堆疊的轉(zhuǎn)基因大豆，若樣品中同時(shí)檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因大豆dp305423和gts40-3-2，則樣品中有可能含有轉(zhuǎn)基因大豆305423×40-3-2；若樣品中同時(shí)檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因大豆mon87701和mon89788，則樣品中有可能含有轉(zhuǎn)基因大豆mon87701×mon89788。

上述技術(shù)方案中，公共引物與轉(zhuǎn)基因大豆相關(guān)基因組無同源性，當(dāng)以轉(zhuǎn)基因大豆基因組為模板進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，不論條件如何，均應(yīng)沒有特異性產(chǎn)物；當(dāng)以嵌合引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板時(shí)，公共引物可以擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物；并且公共引物的tm比轉(zhuǎn)基因大豆靶特異性引物的tm值低5～10℃。

上述技術(shù)方案中，進(jìn)行pcr反應(yīng)時(shí)，公共引物的終濃度為1600nm，針對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆的嵌合引物的終濃度為8～80nm，用于擴(kuò)增12種轉(zhuǎn)基因大豆mon87701、gts40-3-2、mon89788、cv127、a2704、a5547、dp356043、dp305423、mon87769、mon87708、305423×40-3-2、mon87701×mon89788，比如seqidno.2/3:80nm，seqidno.4/5:60nm，seqidno.6/7:64nm，seqidno.8/9:8nm，seqidno.10:32nm，seqidno.11:48nm，seqidno.12:16nm，seqidno.13/14:24nm，seqidno.15/16:8nm，seqidno.17:16nm,seqidno.18:32nm；進(jìn)行pcr反應(yīng)時(shí)，采用兩步退火溫度法，第一步退火溫度比第二步退火溫度高5～10℃。

本發(fā)明公開的試劑盒可用于產(chǎn)品尤其是食品中轉(zhuǎn)基因大豆成分的檢測(cè)，本發(fā)明公開的多重pcr是公共引物介導(dǎo)的多重pcr結(jié)合兩步退火溫度法。具體比如采用兩步退火溫度法，以轉(zhuǎn)基因大豆插入基因序列與大豆基因連接區(qū)序列為靶標(biāo)序列，用嵌合引物先擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)，退火溫度為61℃，進(jìn)行第一步多重pcr擴(kuò)增，可產(chǎn)生公共引物末端的pcr產(chǎn)物；公共引物以第一步擴(kuò)增的帶有公共引物末端的pcr產(chǎn)物為模板，進(jìn)行后30個(gè)循環(huán)的第二步多重pcr擴(kuò)增，退火溫度為54℃；即完成轉(zhuǎn)基因大豆的多重pcr擴(kuò)增；前10個(gè)循環(huán)的多重pcr擴(kuò)增退火溫度比后面30個(gè)循環(huán)的多重pcr擴(kuò)增退火溫度高5～10℃。循環(huán)早期，在高退火溫度下，低濃度的嵌合引物擴(kuò)增靶標(biāo)序列，產(chǎn)生帶有公共引物末端的pcr產(chǎn)物；循環(huán)后期，在低退火溫度下，高濃度的公共引物以早期產(chǎn)生的pcr產(chǎn)物為模板進(jìn)行大量擴(kuò)增。多重pcr采用的25μl反應(yīng)體系包括：10μm的公共引物4μl，不同濃度的嵌合引物混合物2μl，2×dreamtaqgreenmix12.5μl，dna模板1μl，滅菌ddh2o4.5μl；pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，共10個(gè)循環(huán)；72℃延伸2min；95℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min。最后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果表明本發(fā)明的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆的多重pcr試劑盒可同時(shí)或者獨(dú)立特異性檢測(cè)10種轉(zhuǎn)基因大豆的基因組；利用構(gòu)建的質(zhì)粒模板，本發(fā)明的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆的多重pcr試劑盒的敏感性最高可達(dá)0.1%（w/w）轉(zhuǎn)基因大豆成分含量，即0.1ng/100ngdna樣品。

由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：

（1）本發(fā)明公開的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆的多重pcr試劑盒，可同時(shí)也可單獨(dú)檢測(cè)我國批準(zhǔn)進(jìn)口的的12種轉(zhuǎn)基因大豆，即mon87701、gts40-3-2、mon89788、cv127、a2704、a5547、dp356043、dp305423、mon87769、mon87708、305423×40-3-2、mon87701×mon89788，不僅可以節(jié)約試劑使用量和降低檢測(cè)成本，同時(shí)提高了檢測(cè)效率，具有靈敏度高，經(jīng)濟(jì)、快速、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)；

（2）本發(fā)明公開的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，降低嵌合引物濃度，最低至8nm/每條，公共引物濃度為1600nm；降低嵌合引物的濃度有利于加入更多對(duì)嵌合引物，提高多重pcr檢測(cè)通量；采用單條公共引物，有利于減少二聚體的形成，高濃度有利于擴(kuò)增特異性產(chǎn)物的量，進(jìn)而提高檢測(cè)敏感性；

（3）本發(fā)明公開的試劑盒采用一個(gè)pcr反應(yīng)中的兩步退火溫度法，前10個(gè)循環(huán)擴(kuò)增采用高退火溫度（61℃）有利于嵌合引物的特異性結(jié)合，減少非特異性產(chǎn)物；后30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增低退火溫度（54℃）使公共引物發(fā)揮放大作用；中間額外增加72℃延伸2min，有利于為公共引物獲得足夠的模板；

（4）本發(fā)明公開的試劑盒中，公共引物與每條多重pcr特異引物的5'末端連接，一起構(gòu)成了嵌合引物；公共引物介導(dǎo)的多重pcr可以降低引物對(duì)的濃度，減少二聚體的形成，從而提高多重pcr的檢測(cè)通量；通過創(chuàng)造性的設(shè)計(jì)克服了現(xiàn)有多重pcr體系存在的非特異性擴(kuò)增、易存在二聚體的缺陷；

（5）本發(fā)明的多重pcr檢測(cè)體系特異性高，敏感性高達(dá)0.1%（w/w）(轉(zhuǎn)基因大豆成分含量)，即0.1ng/100ngdna樣品；單管進(jìn)行，操作簡單，且具有靈敏度高、經(jīng)濟(jì)、快速等優(yōu)點(diǎn)，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值；

（6）本發(fā)明公開的多重pcr(mutiplexpcr)在一個(gè)pcr管中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)分子，比southern雜交、基因芯片方法更加簡便快捷，比熒光定量pcr更經(jīng)濟(jì)，與恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法）相比不易污染及高通量。由于該技術(shù)所具有的高效性、敏感性和經(jīng)濟(jì)簡便性等優(yōu)點(diǎn)，可以在核酸檢測(cè)技術(shù)中受到廣泛關(guān)注。

附圖說明

圖1是本發(fā)明公共引物的特異性檢測(cè)電泳圖；

圖2是本發(fā)明公共引物敏感性結(jié)果圖；

圖3是本發(fā)明多重體系的特異性檢測(cè)的電泳結(jié)果圖；

圖4是本發(fā)明檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆測(cè)序結(jié)果圖；

圖5是本發(fā)明多重檢測(cè)體系的敏感性結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例與附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述

實(shí)施例

1.公共引物的篩選及其檢測(cè)的敏感性

公共引物作為整個(gè)技術(shù)體系中的核心技術(shù)，其質(zhì)量好壞直接影響著技術(shù)的成敗。本發(fā)明所采用的公共引物seqidno.1與轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，在退火溫度梯度45℃--65℃范圍內(nèi)均不能擴(kuò)增特異產(chǎn)物，如圖1，a-k為公共引物與轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆基因組dna擴(kuò)增結(jié)果，結(jié)果顯示，公共引物均不能擴(kuò)增特異產(chǎn)物，其中，泳道0為空白對(duì)照，泳道m(xù)為100bpdnamarker，泳道1-8為退火溫度梯度45℃--65℃；a模板為非轉(zhuǎn)基因大豆基因組dna，b模板為gts40-3-2基因組dna，c模板為a2704-12基因組dna，d模板為mon89788基因組dna，e模板為dp356043基因組dna，f模板為dp305423基因組dna，g模板為cv127-9基因組dna，h模板為mon87701基因組dna，i模板為a5547-127基因組dna，j模板為mon87708基因組dna，k模板為mon87769基因組dna。

通過構(gòu)建的重組質(zhì)粒模板，進(jìn)一步檢測(cè)公共引物seqidno.1檢測(cè)的敏感性，其檢測(cè)敏感性達(dá)到100個(gè)拷貝，如圖2，泳道m(xù)為100bpdnamarker，泳道0為空白對(duì)照，泳道1-8模板對(duì)應(yīng)的質(zhì)?？截悢?shù)依次為10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸。

本發(fā)明中，當(dāng)以轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆基因組dna為模板進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，不論擴(kuò)增條件如何優(yōu)化，均應(yīng)沒有擴(kuò)增產(chǎn)物；當(dāng)帶有公共引物的多重嵌合引物有擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，通過公共引物一定可以擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物。

2.檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆的多重pcr試劑盒，包括常規(guī)多重pcr組件，還包括針對(duì)這10種轉(zhuǎn)基因大豆的嵌合引物和公共引物；嵌合引物和公共引物序列見表1，常規(guī)多重pcr組件包括taq聚合酶、dntp、mgcl2、pcr緩沖液、去離子水、陽性對(duì)照引物對(duì)；陽性對(duì)照引物對(duì)可用來檢測(cè)dna模板質(zhì)量和反應(yīng)體系擴(kuò)增效率，具體序列為：seqidno.19：gccctctactccacccccatcc、

seqidno.20：gcccatctgcaagcctttttgtg。

表1針對(duì)我國進(jìn)口的12種轉(zhuǎn)基因大豆嵌合引物和公共引物

3.多重體系的特異性檢測(cè)

采用多引物+公共引物+單模板的pcr方法，擴(kuò)增各種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆的基因組或靶標(biāo)基因，dna模板均采用提取的相對(duì)應(yīng)的10種轉(zhuǎn)基因大豆基因組dna，濃度約為25ng/μl。多重pcr采用的25μl反應(yīng)體系包括：10μm的公共引物4μl，不同終濃度（seqidno.2/3:80nm，seqidno.4/5:60nm，seqidno.6/7:64nm，seqidno.8/9:8nm，seqidno.10:32nm，seqidno.11:48nm，seqidno.12:16nm，seqidno.13/14:24nm，seqidno.15/16:8nm，seqidno.17:16nm,seqidno.18:32nm）的嵌合引物混合物2μl，2×dreamtaqgreenmix12.5μl，dna模板1μl，滅菌ddh2o5.5μl；pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，共10個(gè)循環(huán)；72℃延伸2min；95℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min。圖3為多重體系的特異性檢測(cè)的電泳結(jié)果圖，其中0為空白對(duì)照，n為陰性對(duì)照，1-10泳道是pcr產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，依次為mon87701、dp356043、dp305423、cv127、mon87769、a2704、gts40-3-2、mon87708、mon89788、a5547，n為陰性對(duì)照，m為dna標(biāo)準(zhǔn)分子量（從下到上目的帶大小依次為100、200、300、400、500、600、700、800、900和1000bp），pm為產(chǎn)物marker，條帶大小見圖3上標(biāo)示；結(jié)果顯示，運(yùn)用本發(fā)明的多重體系檢測(cè)靶標(biāo)dna，可以從相應(yīng)模板中擴(kuò)增出預(yù)期大小的特異性pcr產(chǎn)物，且條帶清晰。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)進(jìn)一步測(cè)序，證明為相對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)序列（圖4）。本部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的多重體系具有高特異性。

4.多重檢測(cè)體系的敏感性檢測(cè)

體系敏感性檢測(cè)采用10種轉(zhuǎn)基因大豆a2704-12、mon89788、cv127、mon87701、a5547-127、mon87708、mon87769、dp356043、dp305423、gts40-3-2基因組dna溶液等體積混合（其中dp356043、dp305423和gts40-3-2初始濃度為2.5ng/μl，其余7種初始濃度為25ng/μl），然后將此混合基因組dna溶液采用te緩沖液進(jìn)行10倍梯度稀釋，依次獲得10、100、1000及10000倍基因組dna稀釋混合液，每種稀釋液取4μl作為模板（每種轉(zhuǎn)基因大豆基因組dna模板濃度分別為10ng、1ng、0.1ng、0.01ng，而dp356043、dp305423、gts40-3-2這3種相對(duì)應(yīng)濃度分別為1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng），分別對(duì)10個(gè)靶標(biāo)基因進(jìn)行模板梯度pcr反應(yīng)，ddh2o為模板作為陰性對(duì)照。多重pcr采用25μl反應(yīng)體系包括：10μm的公共引物4μl，1μm針對(duì)相應(yīng)品種轉(zhuǎn)基因大豆的嵌合引物對(duì)混合物2μl，2×dreamtaqgreenmix12.5μl，dna模板4μl，滅菌ddh2o2.5μl；pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，共10個(gè)循環(huán)；72℃延伸2min；95℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min。pcr反應(yīng)產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果如圖5，泳道m(xù)為100bpdnaladder，泳道0為去離子水為模板的空白陰性對(duì)照，1～4分別為基因組dna模板分別為稀釋10000、1000、100及10倍10種轉(zhuǎn)基因大豆基因組dna稀釋混合液。結(jié)果顯示，本發(fā)明建立的公共引物介導(dǎo)的多重pcr的敏感性可檢測(cè)稀釋1000倍10種轉(zhuǎn)基因大豆基因組dna稀釋混合液，體系敏感性超過0.1%，優(yōu)于國家對(duì)于轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)要求。

sequencelisting

<110>蘇州大學(xué)

<120>一種轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)用多重pcr試劑盒及檢測(cè)方法

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<212>dna

<213>人工合成

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<213>人工合成

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