本發(fā)明涉及液體活檢領域，具體地說是一種基于液體活檢的乳腺癌檢測的試劑盒。

背景技術：

乳腺癌是一種嚴重威脅女性健康的疾病，其發(fā)病率占所有腫瘤的23％，在女性中位居首位，致死率在所有癌癥中也位居第二。據統(tǒng)計，在我國，每年平均每十萬人口就有30～40名被診斷為乳腺癌患者，而且診斷為乳腺癌的平均年齡為45～55歲，比西方女性更加年輕。因而，對于乳腺癌的早期篩查以及疾病發(fā)展過程中的檢測就顯得尤為重要。

目前，針對乳腺癌的早期篩查，基于液體活檢檢測循環(huán)腫瘤細胞(CTC)的方法具有眾多傳統(tǒng)檢測方法所沒有的優(yōu)勢，包括無創(chuàng)、快捷、準確率高等優(yōu)點。CTC是一種自發(fā)或因診療操作由實體瘤原發(fā)灶或轉移灶釋放進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞。由于轉移是癌癥相關死亡的主要原因，而CTC被視為轉移的種子，因此對CTC的檢測在新的腫瘤生物標志物的發(fā)現、腫瘤預后判斷及個體化治療方面存在很大的應用潛力，是國內外腫瘤研究的熱點之一。到目前為止，大多數乳腺癌CTC相關的研究主要集中于轉移性乳腺癌(MBC)患者，而一些研究表明，在早期乳腺癌(EBC)患者中也同樣存在CTC，其陽性率為9.4～48.6％。而血液中CTC的陽性率也與乳腺癌早期復發(fā)和低的生存期相關。其實，研究表明腫瘤在1mm時，血液中即可檢出CTC，通過檢測外周血循環(huán)中CTC的存在，可以在癌癥的早期發(fā)現癌癥。為此，有效的CTC捕獲、富集分析方法對于基于CTC的早篩很重要。

雖然到目前為止，基于EpCAM的CTC捕獲富集分析平臺仍然被作為MBC中CTC檢測的金標準，但是該方法是否適合用于EBC的檢測仍存在爭議，而且以EpCAM為生物標志物對于發(fā)生EMT的CTC的檢測存在很高的假陰性，這一廣譜的上皮生物標志物也不具有組織特異性，無法追溯CTC的具體組織來源，而這一點對于后續(xù)的腫瘤治療具有重要意義。因此，發(fā)現并應用一些乳腺癌組織特異性的生物標志物進行CTC的檢測分析顯得尤為重要。

公告日為2014年1月15日，公告號為CN102313813B的中國專利中公開了一種通過免疫熒光染色對稀有細胞進行檢測的方法，該方法對白細胞、稀有細胞和細胞核進行三色染色，再通過熒光檢測。但是該方法僅能通過一種單抗來特異性識別該稀有細胞，容易造成漏檢。同時，由于細胞的異質性，每個細胞表達的抗原量不一，導致有時熒光強度非常微弱，在熒光顯微鏡下難以分辨。

技術實現要素：

本發(fā)明的主要目的是針對現有技術存在的不足提供一種基于液體活檢的乳腺癌檢測的試劑盒，利用該試劑盒可以檢測外周血中CTC的數量，對該CTC進行溯源分析、腫瘤分型及早期篩查，同時熒光顯示細胞膜邊界清晰、檢測結果靈敏度高。

本發(fā)明是通過如下技術方案實現的：

一種基于液體活檢的乳腺癌檢測的試劑盒，所述試劑盒包括：用于增強染色效果的染色增強液和帶熒光染色標記的特異性抗體；

其中所述特異性抗體包括：ERα抗體、VIM抗體、CD45抗體和HER2抗體；

所述染色增強液包括濃度為0.001～1mg/mL的表面活性劑。

所述染色增強液的溶劑為生物緩沖液。

優(yōu)選的，所述表面活性劑可以為Triton X-100、二甲基亞砜、NP-40、十二烷基硫酸鈉(SDS)中的任一種。更優(yōu)選的，所述表面活性劑為Triton X-100或SDS。最優(yōu)選的，所述染色增強液包括濃度為0.01～1mg/mL的SDS，染色增強液的溶劑為常用的生物緩沖液，如PBS緩沖液等。

優(yōu)選的，所述試劑盒中還包括淋巴細胞分離液和用于去除白細胞的免疫磁珠。淋巴細胞分離液和免疫磁珠能夠用于去除紅細胞和白細胞的干擾，便于更好的富集CTC。

更優(yōu)選的，所述用于去除白細胞的免疫磁珠為表面偶聯有抗體CD45、CD14和CD15的免疫磁珠中的一種或多種，最優(yōu)選包括全部的上述免疫磁珠。

優(yōu)選的，所述特異性抗體ERα抗體、VIM抗體和HER2抗體帶有至少兩種不同發(fā)射波長的熒光染色標記，并且CD45抗體帶有的熒光染色標記與上述所有熒光染色標記均不相同。根據本領域技術人員公知的，為了區(qū)分不同的特異性抗體，本發(fā)明應當采用不同的熒光染色標記。但是由于熒光顯微鏡通道的數量限制，通常使ERα抗體、VIM抗體和HER2抗體中的其中兩種抗體帶有同一種熒光染色標記。本發(fā)明優(yōu)選為ERα抗體和HER2抗體帶有同一種熒光染色標記。熒光染色標記染料可以采用本領域任何常用的熒光染料，只要通過調節(jié)激發(fā)光波長可區(qū)分即可。由于熒光染色標記的發(fā)射波長各自不同，因此通過熒光顯微鏡在不同的濾光片下可以完全區(qū)分開。其中，本發(fā)明優(yōu)選采用的熒光染色標記為Alexa Fluor系列分子、花青染料。更優(yōu)選為Alexa594、CY5和Alexa488，其中Alexa594發(fā)射波長為618nm，CY5發(fā)射波長為670nm，Alexa488發(fā)射波長為519nm。帶熒光染色標記的CD45抗體優(yōu)選為CD45-Alexa594(紅色)、帶熒光染色標記的ERα抗體為ERα-Alexa488(綠色)、帶熒光染色標記的HER2抗體為HER2-Alexa488(綠色)、帶熒光染色標記的VIM抗體為VIM-CY5(肉眼不可見，顯微鏡掃描賦以紫色)。

優(yōu)選的，所述用于熒光原位雜交的熒光探針可以為用于染色體熒光原位雜交的探針，如CEP8熒光探針。

優(yōu)選的，所述染色增強液中還包括占染色增強液質量百分含量0.1～3％的聚乙二醇。聚乙二醇與表面活性劑配合可以進一步加強染色液的染色效果。

作為本領域技術人員公知的，將帶熒光染色標記的特異性抗體與細胞進行孵育從而進行熒光染色的過程可以為液體染色或固體染色。如果進行液體染色則先將需要進行細胞染色的細胞重懸成細胞懸液，然后依次進行染色預處理、細胞染色，再將細胞轉移到載玻片上進行細胞固定、載玻片封片。而如果在載玻片上進行固體染色，則先將細胞在載玻片上進行細胞固定，然后依次進行染色預處理、細胞染色后，再對載玻片封片。

上述細胞固定是通過細胞固定液進行的，所述細胞固定液可以為本領域常用的細胞固定液，例如多聚甲醛、戊二醛、福爾馬林、乙醇、丙酮中的一種或幾種的組合。

利用上述基于液體活檢的乳腺癌檢測的試劑盒進行CTC檢測的方法包括以下步驟：

富集外周血中的目標細胞；

利用染色增強液對目標細胞進行增強染色預處理；

利用帶熒光染色標記的特異性抗體對目標細胞進行熒光染色；

目標細胞固定；

用熒光探針進行熒光原位雜交；

DAPI封片及鏡檢。

經過增強染色預處理之后的目標細胞，特異性抗體與目標細胞的結合更好，熒光染色更明顯，細胞膜邊界清晰。

作為本領域技術人員公知的，當腫瘤細胞特異性抗原存在于細胞內時，應當對細胞膜表面染色并固定目標細胞后，再將細胞膜破膜并利用帶熒光染色標記的特異性抗體對目標細胞進行細胞內熒光染色。

優(yōu)選的，所述富集外周血中的目標細胞包括以下步驟：

(1)將外周血離心分離血漿和血細胞，并去除血漿；

(2)向步驟(1)中加入細胞緩沖液和淋巴細胞分離液離心分層，去除紅細胞層；

(3)向步驟(2)中加入用于去除白細胞的免疫磁珠并孵育得到懸濁液；

(4)將步驟(3)中的懸濁液磁分離去除白細胞以及剩余的紅細胞，再洗滌后得到富集后的目標細胞。

所述的淋巴細胞分離液可以為本領域常用的淋巴細胞分離液，用于根據密度分離紅細胞即可，本發(fā)明優(yōu)選的采用Ficoll分離液。

本發(fā)明對目標細胞的富集包括兩次去除紅細胞，可以對紅細胞去除更加干凈，而且通過免疫磁珠，可以一次性去除白細胞和剩余紅細胞，富集效率更高。經過上述富集處理后能夠排除其他細胞對于熒光染色的干擾，有利于通過熒光顯微鏡進行更好的觀察。

優(yōu)選的，所述利用染色增強液對目標細胞進行增強染色預處理的處理時間為5～20分鐘。染色增強液加入后表面活性劑的終濃度為0.2μg/mL～1mg/mL。其中，染色增強液優(yōu)選的加入量為1～20μL。當染色增強液的加入量越多時，加強熒光的強度越高，但是可能會對細胞膜造成損傷，加入量過少時加強效果又不是太明顯。

優(yōu)選的，所述利用帶熒光染色標記的特異性抗體對目標細胞進行熒光染色時，先將帶熒光染色標記的特異性抗體按照1:(100～200)的體積比用緩沖液稀釋，再將稀釋后的特異性抗體與目標細胞混合孵育。

優(yōu)選的，所述帶熒光染色標記的特異性抗體加入后特異性抗體的終濃度為2～10μg/mL。其中，帶熒光染色標記的特異性抗體按照1:200的體積比用緩沖液稀釋。加入的特異性抗體濃度越高，越容易造成非特異性染色，影響結果的準確性。

上述緩沖液可以為一般的生物細胞緩沖液，例如PBS緩沖液。更優(yōu)選的，PBS緩沖液為0.01M的磷酸鹽緩沖液，其中Na₂HPO₄、NaCl、KH₂PO₄和KCl的濃度分別為8mM、136mM、2mM和2.6mM，pH值為7.2-7.4。

發(fā)明原理

在原發(fā)性乳腺癌中，大約75～80％表現為雌激素受體α陽性(ERα+)，ERα的狀態(tài)對于乳腺癌的分級和指導用藥都具有重要作用。ERα的狀態(tài)決定了乳腺癌患者是否適合激素治療，而這種治療方法目前仍然是ERα+乳腺癌患者主要的輔助治療方法。所以基于ERα的CTC檢測不僅具有組織特異性定位的能力，而且其表達狀態(tài)對于乳腺癌的治療也具有一定的指導意義。此外，人表皮生長因子受體2(HER2)也是一種重要的乳腺癌預測標志物，在原發(fā)性乳腺癌中大約有10～30％表現為HER2+，并且與差的預后和較高的浸潤性相關。此外，約11％乳腺癌表現為ERα-/HER2+，這樣聯合ERα+和HER2+的檢測靈敏度可以達到約80％，而且部分HER2-的原發(fā)性乳腺癌患者，其在發(fā)展的過程中也可能會產生HER2+的CTC。

除上述ERα+或HER2+的乳腺癌外，基底型乳腺癌往往表現為三陰性(TNBC)(ERα-/PR-/HER2-)，此類乳腺癌CTC則無法用上述標志物檢測。雖然TNBC僅占乳腺癌的15％左右，但因其具有較高的轉移能力和較差的預后，所以不容忽視。對此，波形蛋白(VIM)廣泛表達于不依賴于激素的乳腺癌組織中，很早就被用于檢測激素受體陰性的基底型乳腺癌，其在該類乳腺癌中的檢測靈敏度可達到約94％，所以可以作為一個很好的TNBC乳腺癌CTC的生物標志物。

8號染色體異常存在于多種實體瘤中，包括前列腺癌、卵巢癌、腎癌、乳腺癌、結直腸癌等，利用熒光原位雜交(FISH)的方法檢測細胞或組織內8號染色體異常的情況已被廣泛的用于臨床診斷中，本發(fā)明在基于腫瘤標志物活檢的同時，輔以8號染色體著絲粒區(qū)域(CEP8)的FISH檢測驗證，在雙瘤標檢測增加腫瘤檢測靈敏度的同時進一步通過CEP8的檢測保證檢測的特異性。其中，CEP8探針為標記有SpectrumOrange的熒光探針，用于挑選全部細胞中8號染色體數目異常的細胞為目標細胞。通過熒光顯微鏡觀察，調節(jié)激發(fā)光波長為559nm時SpectrumOrange發(fā)射光為588nm橙光，可與上述腫瘤標志物和白細胞標志物熒光進行同時檢測，通過特異性橙光探針點數目的檢測確定目標細胞8號染色體的數目。本發(fā)明在基于腫瘤標志物活檢的同時，可以選擇的輔以CEP8的FISH檢測驗證，在三瘤標檢測增加CTC檢測靈敏度的同時進一步通過CEP8的檢測保證檢測的特異性。

據此，聯合ERα、HER2和VIM三個生物標志物檢測乳腺癌CTC具有很高的靈敏度，此外還可以據此對乳腺癌CTC分型：ERα+為管腔型乳腺癌(Luminal)；HER2+/ERα-為HER2陽性乳腺癌(HER2+)；ERα-/HER2-/VIM+為基底型乳腺癌(Basal)。檢測出的CTC可根據ERα和HER2的表達與否判定是否來源于乳腺，并且聯合VIM的表達可以對乳腺癌進行分型，溯源的同時實現對乳腺癌的早期篩查。

本發(fā)明采用帶Alexa594熒光染色標記的CD45抗體對白細胞表面特異性染色，用帶Alexa488熒光染色標記的ERα抗體和HER2抗體，以及帶CY5熒光染色標記的VIM抗體對捕獲的循環(huán)腫瘤細胞進行特異性染色。通過熒光顯微鏡觀察，調節(jié)激發(fā)波長為591nm時Alexa594發(fā)射光為618nm偏橙色紅光；激發(fā)波長為650nm時CY5發(fā)射光為670nm遠紅光(肉眼不可見，顯微鏡掃描賦以紫色)；激發(fā)波長為499nm時Alexa488發(fā)射光為519nm綠光。所以通過調節(jié)不同的激發(fā)波長以及曝光時間，可以觀察到不同細胞上標記的不同熒光，進而可對目標細胞進行區(qū)分：CD45+為白細胞；HER2+或ERα+為腫瘤CTC細胞，其中HER2+/ERα+可確定其來源于乳腺癌的患者，而且根據不同特異性抗原的表達還可以對CTC進行進一步的分型：ERα+或HER2+為管腔型乳腺癌(Luminal)或HER2陽性乳腺癌(HER2+)；而ERα-/HER2-/VIM+為基底型乳腺癌(Basal)。

選擇多種帶熒光染色標記的抗體有利于確認目標細胞的具體類型，然而當抗體種類多于一種時，目標細胞與抗體的結合就容易被干擾，導致熒光染色不佳，影響熒光顯微鏡觀察。而本發(fā)明的染色增強液通過暴露細胞表面的膜蛋白抗原決定簇，使帶熒光染色標記的抗體更容易結合在細胞表面的靶蛋白上，從而增強標記細胞膜的熒光強度，并且使細胞膜邊界清晰。

本發(fā)明的基于液體活檢的乳腺癌檢測的試劑盒，可以有效的富集目標細胞，并且確認富集的目標細胞是否來源于乳腺癌的早期患者，以及進行腫瘤分型。同時，本發(fā)明通過三瘤標檢測增加腫瘤檢測靈敏度并且進一步通過CEP8的檢測保證檢測的準確性。此外本發(fā)明通過染色增強液加強染色效果，使多種帶熒光染色標記的抗體都可以與目標細胞靶蛋白結合，對目標細胞染色，染色效果更好，熒光更強，而且邊界清晰。這樣可以同時增強血源性細胞表面特異性熒光染色和腫瘤細胞特異性標志物的熒光染色效果，使得CTC與血源性細胞更易于區(qū)分，降低檢測的假陽性，提高檢測的特異性。并且，本發(fā)明方法簡單，成本低，具有很強的實用性。

附圖說明

圖1為MCF7人乳腺癌細胞系的熒光染色檢測Merge圖；

圖2為SK-BR-3人乳腺癌細胞系的熒光染色檢測Merge圖；

圖3為MDA-MB-231人乳腺癌細胞系的熒光染色檢測Merge圖；

圖4為腫瘤細胞捕獲后的熒光染色檢測Merge圖。

具體實施方式

以下通過具體實施例來進一步說明本發(fā)明：下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。

淋巴細胞分離液來自GE healthcare公司的Ficoll-Paque PLUS。

CD45免疫磁珠來自Thermo Fisher Scientific的CD45。

Alexa 594、Alexa 488和CY5熒光染料來自Thermo Fisher Scientific。

CEP8探針來自雅培公司的CEP 8SpectrumOrange DNA Probe Kit。

實施例1富集外周血中的目標細胞

(1)將外周血離心以去除血漿蛋白：將8.5mL外周血在水平離心機中800g，常溫離心7min，棄去上清。

(2)向步驟(1)的血漿中加入5～6mL的PBS緩沖液和3mL的淋巴細胞分離液，在離心機中450g，常溫離心7min。離心后分為三層，紅色的底層為紅細胞層，略帶白色的中間層主要為白細胞和CTC等，黃色的上層為血漿，吸取紅細胞層以上的全部液體，去除底部的紅細胞層。

(3)向步驟(2)中逐滴加入200mL表面偶聯有CD45抗體的免疫磁珠，在水平搖床上孵育得到懸濁液，水平搖床轉速設置在120-150rpm，傾斜20-30°，常溫，水平搖動20min。

(4)將步驟(3)中的懸濁液用大磁力架吸附2min。小心的吸取未附著在管壁上的液體，去除白細胞以及剩余的紅細胞，用PBS緩沖液洗滌并重懸后得到富集后的目標細胞。

實施例2對富集后的目標細胞進行熒光染色

(1)增強染色預處理：向約50μL的富集后的目標細胞中加入2μL染色增強液，常溫靜置10min。所述染色增強液為SDS或Triton X-100的PBS緩沖液溶液，SDS濃度為0.1mg/mL。

(2)細胞表面染色：將CD45-Alexa 5941μL用199μL的PBS緩沖液稀釋后，加入到步驟(1)預處理完成后的細胞懸液中，再避光孵育20min。孵育后加PBS緩沖液清洗細胞液體，950g離心4min，去上清至100μL。

(3)細胞固定：將步驟(2)中的細胞轉移涂抹到載玻片上，然后加入固定液多聚甲醛，固定10min，PBS洗滌玻片2次，每次5min。

(4)細胞破膜：細胞固定后在載玻片上細胞區(qū)域滴加細胞破膜液200μL，孵育10min后加PBS緩沖液清洗玻片2次，每次5min。所述細胞破膜液為Triton X-100的PBS緩沖液溶液，Triton X-100濃度為0.5％。

(5)細胞胞內標志物染色：將ERα-Alexa488、Her2-Alexa 488和VIM-CY5各1μL用198μL的PBS緩沖液稀釋后，加入到上述玻片上細胞區(qū)域，再避光孵育20min，然后加PBS緩沖液清洗玻片2次，每次5min。

(6)熒光原位雜交：向載玻片上滴加10μL的CEP8熒光探針，蓋上蓋玻片，四周加封片膠封片。在76℃下預雜交10min，然后在37℃下雜交4h。

(7)DAPI封片及鏡檢：撕去封片膠，用PBS緩沖液清洗2次(5min/次)，并脫去蓋玻片，在自然干燥后加入10μL封片劑封片并蓋上蓋玻片(其中封片劑的含量為DAPI：甘油＝1:9)，最后用Nikon DS-U3熒光顯微鏡觀察，鏡檢條件為：激發(fā)光波長為591nm時Alexa594發(fā)射光為618nm紅光，曝光時間100ms；激發(fā)光波長為650nm時CY5發(fā)射光為670nm遠紅光(肉眼不可見，顯微鏡掃描賦以紫色)，曝光時間100ms；激發(fā)光波長為499nm時Alexa488發(fā)射光為519nm綠光，曝光時間100ms；激發(fā)光波長為345nm時DAPI發(fā)射光為455nm藍光，曝光時間10～20ms；激發(fā)光波長為559nm時SpectrumOrange發(fā)射光為588nm橙光，曝光時間100ms，結果顯示，正常人外周血分離的白細胞絕大多數呈現CD45陽性染色，瘤標陰性染色，FISH結果為CEP8二倍體，沒有瘤標陽性或CEP8數目異常的細胞。

實施例3細胞系的熒光染色檢測

將MCF7(ERα+/HER2-)或SKBr3(ERα-/HER2+)或MDA-MB-231(ERα-/HER2-/VIM+)細胞系(來源中國科學院細胞庫購買)，酶解消化后取10⁵個細胞，大約50μL，按照實施例2的步驟進行細胞熒光染色和熒光顯微鏡鏡檢。鏡檢條件為：激發(fā)光波長為591nm時Alexa594發(fā)射光為618nm紅光，曝光時間100ms；激發(fā)光波長為650nm時CY5發(fā)射光為670nm遠紅光(肉眼不可見，顯微鏡掃描賦以紫色)，曝光時間100ms；激發(fā)光波長為499nm時Alexa488發(fā)射光為519nm綠光，曝光時間100ms；激發(fā)光波長為345nm時DAPI發(fā)射光為455nm藍光，曝光時間10～20ms，結果如圖1-3所示。

從圖1-3可以看出，各細胞系的細胞在358nm激發(fā)光下均顯示藍光的細胞核，說明存在細胞；在591nm激發(fā)光下不顯示紅色，說明CD45呈陰性，不存在白細胞。

在499nm激發(fā)光下，MCF7細胞和SKBr3細胞顯示綠色，說明ERα或HER2呈陽性；MDA-MB-231細胞不顯示綠色，說明ERα和HER2呈陰性。

在650nm激發(fā)光下，MDA-MB-231細胞顯示紫色，說明VIM呈陽性，MCF7細胞和SKBr3細胞不顯示紫色，說明VIM呈陰性。

實施例4腫瘤細胞捕獲效率檢測

采集健康志愿者8.5ml血樣，取MCF7、SK-BR-3和MDA-MB-231人乳腺癌細胞系分別為31、26和26個加入血樣。然后按照實施例1的步驟進行腫瘤細胞富集，再按照實施例2的步驟進行腫瘤細胞的熒光染色和熒光顯微鏡鏡檢。鏡檢條件為：激發(fā)光波長為591nm時Alexa594發(fā)射光為618nm紅光，曝光時間100ms；激發(fā)光波長為650nm時CY5發(fā)射光為670nm遠紅光(肉眼不可見，顯微鏡掃描賦以紫色)，曝光時間100ms；激發(fā)光波長為499nm時Alexa488發(fā)射光為519nm綠光，曝光時間100ms；激發(fā)光波長為345nm時DAPI發(fā)射光為455nm藍光，曝光時間10～20ms；激發(fā)光波長為559nm時SpectrumOrange發(fā)射光為588nm橙光，曝光時間100ms，結果如圖4所示。

結果表明，腫瘤細胞(ERα+或Her2+或VIM+)捕獲數目69個，捕獲率83.13％。ERα或Her2陽性(ERα+或Her2+)細胞數目49個，陽性率59.04％；VIM陽性(VIM+)細胞數目20個，陽性率24.1％；瘤標均為陽性(ERα+或Her2+/VIM+)腫瘤細胞數目0個，陽性率0％；CEP8非二倍體(CEP8≠2)腫瘤細胞數目37個，非二倍體率44.58％。

從上述結果可以看出，利用本發(fā)明的試劑盒進行基于液體活檢的CTC檢測相對于現有的單瘤標檢測而言，捕獲血液中的腫瘤細胞靈敏度更高。同時根據檢測的不同結果，可以進行乳腺癌的分型。并且根據CEP8的檢測，可以增加檢測的特異性，滿足不同的檢測目的。

以上所述的實施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明實施例原理以及權利要求的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發(fā)明實施例的保護范圍。