本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一個棉花產(chǎn)量性狀關(guān)聯(lián)的乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因。

技術(shù)背景

棉花作為天然纖維的主要來源，是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。棉花生產(chǎn)不僅對我國農(nóng)業(yè)乃至國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展有著重要的影響，而且在世界棉花貿(mào)易市場上也起著舉足輕重的作用。隨著紡織工業(yè)的發(fā)展和社會需求的提高，選育種植產(chǎn)量高、纖維品質(zhì)優(yōu)良的棉花品種尤為重要，因此深入挖掘和利用棉花產(chǎn)量的遺傳變異就顯得格外重要。由于棉花基因組的復(fù)雜性，先前對棉花產(chǎn)量性狀的研究還處于qtl(quantitativetraitlocus)定位水平。

全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wideassociationstudy；gwas)是以基因組中數(shù)以百萬計的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotideploymorphism，snp)為分子遺傳標(biāo)記，進(jìn)行全基因組水平上的相關(guān)性分析，通過比較發(fā)現(xiàn)影響復(fù)雜性狀的基因變異的一種新策略。利用全基因組關(guān)聯(lián)分析挖掘和克隆農(nóng)藝性狀相關(guān)基因，無需事先假定候選基因，其檢測能力強(qiáng)，精度高，已成為分子育種研究的熱點(diǎn)。aranzana等(2005)采用gwas分析方法進(jìn)行擬南芥開花和抗逆性方面的研究，成功的獲得了擬南芥開花期(fri)和抗病性相關(guān)基因(rpm和rps)。belo等(2008)對553份優(yōu)良自交系的8,950的snp進(jìn)行了gwas分析，鑒定出于油酸含量相關(guān)的位點(diǎn)，這也是玉米首次真正意義上的全基因組關(guān)聯(lián)分析。huang等(2011)利用第二代測序技術(shù)對517份水稻地方種進(jìn)行了重測序并獲得上百萬的snp，然后對水稻的14個農(nóng)藝性狀進(jìn)行g(shù)was分析，并成功鑒定出80個性狀關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)。此外，他們還對多達(dá)950份水稻群體進(jìn)行重測序，對開花期和10個產(chǎn)量相關(guān)性狀進(jìn)行g(shù)was分析，鑒定出了很多已知功能基因(huangetal.2012)。lin等(2014)對世界各地的360份番茄種質(zhì)進(jìn)行全基因組重測序，通過群體分化分析，首次發(fā)現(xiàn)決定粉果果皮顏色的關(guān)鍵變異位點(diǎn)，即slmyb12基因啟動子區(qū)域的603bp缺失，進(jìn)而抑制該基因的表達(dá)，從而使得成熟的粉果番茄果皮中不能積累類黃酮，導(dǎo)致鮮食番茄和加工番茄的差異。zhou等(2015)對302份大豆野生、地方品種以及改良品種進(jìn)行重測序，結(jié)合gwas分析技術(shù)，發(fā)現(xiàn)96個gwas關(guān)聯(lián)位點(diǎn)與之前報道的qtl有關(guān)聯(lián)，并鑒別出含油量、株高和茸毛生成相關(guān)的新的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。wang等(2016)利用全球不同地區(qū)的玉米自交系的自然變異群體進(jìn)行g(shù)was分析，找到83個遺傳變異位點(diǎn)與玉米苗期抗旱性顯著相關(guān)。并進(jìn)一步證明抗旱性關(guān)聯(lián)基因zmvpp1可以提高干旱敏感材料的抗旱性。以上充分說明，全基因組關(guān)聯(lián)分析具有很高的定位精度，甚至可以達(dá)到單基因的水平，利用獲得的與目標(biāo)性狀相關(guān)的功能標(biāo)記，進(jìn)行目標(biāo)性狀的篩選，加快育種進(jìn)程和效率。

植物轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量和種類繁多，它們參與各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及生長發(fā)育的過程，是真核生物中最大的一個功能類別，大約占了全基因組的8％(weirauchandhughes,2011)。常見的植物轉(zhuǎn)錄因子有：myb、ap2/erebp、nac、bzip、homeobox、zincfinger、mads、wrky、yabby、arf、dof等。其中，乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子家族ap2/erebp(apetala2/ethyleneresponsiveelementbandingprotein)是最大的三個基因家族之一(riechmann,2000)，其家族成員廣泛且保守地存在于植物中。其ap2保守結(jié)構(gòu)域是包含約60個氨基酸殘基的dna序列。β-轉(zhuǎn)角中有兩個保守的氨基酸殘基，14位的丙氨酸(ala)和19位的天冬氨酸(asp)是識別ap2/erebp的重要特征(sakumaetal.,2002)。sakuma等(2002)根據(jù)結(jié)構(gòu)域的數(shù)目和相似性把a(bǔ)p2/erebp轉(zhuǎn)錄因子分成了5個亞家族ap2(apetala2)、rav、dreb(dehydration-responsiveelementbindingprotein)、erf(ethyleneresponsivefactor)和其它。ap2/erebp轉(zhuǎn)錄因子一種植物調(diào)節(jié)蛋白，其生物學(xué)功能涉及植物初級代謝和次級代謝過程、植物生產(chǎn)發(fā)育調(diào)節(jié)(種子、花、果實(shí)等)和多種生物和非生物脅迫響應(yīng)過程(francescoetal,2013)。

技術(shù)方案

本發(fā)明的目的是提供一個乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因。全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明該基因與棉花鈴數(shù)、衣分和籽指這三個重要產(chǎn)量性狀密切關(guān)聯(lián)。

本發(fā)明的另一目的是提供該基因的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因ghail6，在所述的乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因ghail6在四倍體陸地棉tm-1中的cdna序列為：seqidno.1，基因組序列為：seqidno.2；所述的乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因ghail6含有兩個非同義突變的snp位點(diǎn)，分別在基因組序列的672bp和703bp位置上，這兩個snp基因型緊密連鎖；第一個snp位點(diǎn)堿基從a變?yōu)間，對應(yīng)的氨基酸從asn變?yōu)閍sp；第二個snp位點(diǎn)堿基從g變?yōu)閍，對應(yīng)的氨基酸從gly變?yōu)閍sp；突變后的基因型衣分和產(chǎn)量顯著高于野生型。

本發(fā)明所述的乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因ghail6在鑒定高產(chǎn)量陸地棉品種中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因ghail6在改良棉花產(chǎn)量性狀中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因ghail6在通過基因工程手段培育棉花高產(chǎn)新品種中的應(yīng)用。

一種用于檢測所述的snp位點(diǎn)的引物對，上游引物為：seqidno.3，下游引物為：seqidno.4。

所述的引物對在篩選高產(chǎn)棉花品種中的應(yīng)用。

一種篩選高產(chǎn)棉花品種的方法，檢測所述的兩個snp位點(diǎn)，選擇基因組序列的672bp和703bp位置上的堿基分別為g和a的棉花即為高產(chǎn)棉花品種。

有益效果

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在：

本發(fā)明通過棉花品種群體重測序和全基因組關(guān)聯(lián)分析挖掘了一個與棉花產(chǎn)量性狀鈴數(shù)、衣分和籽指同時關(guān)聯(lián)的基因ghail6，屬于ap2類乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因(ap2/erebp)。本發(fā)明的乙烯響應(yīng)因子家族基因ghail6在全基因組關(guān)聯(lián)分析中與棉花產(chǎn)量性狀密切相關(guān)。本發(fā)明提供的ghail6cdna和基因組序列由pcr技術(shù)獲得，該技術(shù)具有起始模板量小，試驗(yàn)步驟簡單易行而且靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。

ghail6在棉花不同組織和發(fā)育時期的表達(dá)水平分析由轉(zhuǎn)錄組測序所得。該基因在棉花開花后20、25和35天的胚珠種子種優(yōu)勢表達(dá)，表明該基因與產(chǎn)量性狀構(gòu)成因子相關(guān)。

ghail6在相對高產(chǎn)和低產(chǎn)品種群體中的snp基因型通過pcr技術(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證，較易操作、靈敏度高和準(zhǔn)確性好。

根據(jù)ghail6的不同snp基因型可以將品種群體分為兩大類，統(tǒng)計學(xué)分析方法發(fā)現(xiàn)，這兩類群體之間的鈴數(shù)、衣分和籽指性狀存在顯著性差異(表1)，進(jìn)一步證明該基因與棉花產(chǎn)量性狀之間的相關(guān)性。

附圖說明

圖1棉花不同產(chǎn)量性狀gwas關(guān)聯(lián)分析結(jié)果。

lp、bn和si分別代表產(chǎn)量性狀衣分、鈴數(shù)和籽指。紅色箭頭表示性狀關(guān)聯(lián)基因ghail6上的snp位點(diǎn)。橫坐標(biāo)表示染色體上的位置(mb)，縱坐標(biāo)表示snp位點(diǎn)關(guān)聯(lián)的顯著性，用-log10(pvalue)表示。

圖2ghail6在棉花不同組織和發(fā)育時期的表達(dá)水平。

橫坐標(biāo)代表不同組織，包括根(r)、莖(s)、葉(l)、胚珠(ovule)和纖維(fiber)。胚珠組織包括了開花前3和1天、開花當(dāng)天、開花后1到35天。纖維組織包括開花后5到25天。

圖3ghail6的序列信息和不同單倍型的鑒定。

在品種群體中檢測到ghail6序列存在兩個非同義突變的snp位點(diǎn)，分別在基因組序列的672bp和703bp位置上，并且這兩個snp基因型緊密連鎖。第一個snp位點(diǎn)堿基從a變?yōu)間，對應(yīng)的氨基酸從asn變?yōu)閍sp。第二個snp位點(diǎn)堿基從g變?yōu)閍，對應(yīng)的氨基酸從gly變?yōu)閍sp。根據(jù)兩個snp位點(diǎn)堿基信息，將品種群體分為不同單倍型，標(biāo)記為ghail6^llb和ghail6^hlb。llb表示低衣分和低鈴數(shù)。hlb代表高衣分和高產(chǎn)量。

圖4ghail6的不同單倍型之間產(chǎn)量性狀的比較分析。

箱圖代表品種群體的產(chǎn)量性狀的分布情況。含有g(shù)hail6^llb和ghail6^hlb兩種單倍型的品種分別是69和186個。藍(lán)色代表單倍型ghail6^llb的產(chǎn)量性狀分布，橙色代表ghail6^hlb的產(chǎn)量性狀分布。方框內(nèi)的橫線代表性狀分布的中值。**表示在0.05和0.01水平有差異。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1棉花產(chǎn)量性狀關(guān)聯(lián)的乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因ghail6的挖掘：

針對258份現(xiàn)代品種或者品系，從2007到2009年，我們分別在河南安陽、江蘇南京和新疆庫車進(jìn)行了產(chǎn)量性狀(鈴數(shù)、衣分和籽指)詳細(xì)調(diào)查。同時，對這258份棉花品種進(jìn)行了全基因組重測序，獲得2.54tb測序數(shù)據(jù)，平均測序深度2.5×。我們將這些序列比對到棉花陸地棉基因組序列，利用samtools軟件進(jìn)行全基因組snp的鑒定，共挖掘了1,871,401個高質(zhì)量的snp(最小基因頻率>0.05)用于后續(xù)分析。利用emmax軟件，我們進(jìn)一步進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，再根據(jù)p<1×10^-6篩選snp關(guān)聯(lián)信號位點(diǎn)，并最終獲得71個棉花產(chǎn)量性狀關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。在這些關(guān)聯(lián)位點(diǎn)中，我們發(fā)現(xiàn)了a02染色體上的一個snp信號關(guān)聯(lián)位點(diǎn)(a02:79153947)可以同時關(guān)聯(lián)鈴數(shù)、衣分和籽指三個性狀(圖1)。這個snp位點(diǎn)正好處于基因外顯子區(qū)，并造成了氨基酸序列的突變。該基因?yàn)橐蚁╉憫?yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因aintegumenta-like6,ghail6(gh_a02g1392)，屬于ap2類基因。

實(shí)施例2乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因ghail6的獲得：

從陸地棉基因組序列中獲取了ghail6(gh_a02g1392)的cdna序列和基因組序列，見seqidno.1和seqidno.2。根據(jù)cdna兩端設(shè)計基因全長引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，引物序列為f1：seqidno.3和r1：seqidno.4。pcr反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，60℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環(huán)；最后72℃延伸7min。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，與cdna進(jìn)一步比對確定序列的準(zhǔn)確性。

實(shí)施例3ghail6在棉花不同組織和發(fā)育時期的表達(dá)水平分析：

本實(shí)驗(yàn)采取了棉花不同組織和不同發(fā)育時期的rna樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。樣本材料包括了根、莖、葉、胚珠和纖維。胚珠組織包括了開花前3和1天、開花當(dāng)天、開花后1到35天。纖維組織包括開花后5到25天。轉(zhuǎn)錄組測序采用illuminahiseq2500平臺，每個樣本平均測序深度達(dá)到6gb?；虮磉_(dá)水平的計算是利用tophat軟件(verson2.0.8)將測序得到的reads與陸地棉基因組進(jìn)行比對，計算出的表達(dá)水平以每百萬測序堿基中每千個轉(zhuǎn)錄子測序堿基中所包含的測序片斷數(shù)(fpkm)表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中基因ghail6在棉花開花后20、25和35天的胚珠種子種優(yōu)勢表達(dá)，表明該基因與產(chǎn)量性狀構(gòu)成因子相關(guān)。

實(shí)施例4乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因ghail6在鑒定高產(chǎn)量棉花品種和改良產(chǎn)量性狀中的應(yīng)用：

基于snp位點(diǎn)(a02:79153947)在染色體a02上的位置，在其兩端設(shè)計基因組擴(kuò)增引物，引物序列為f2：seqidno.5和r2：seqidno.6。利用這對引物，在258個品種的dna中進(jìn)行pcr擴(kuò)增并測序。pcr反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，58℃退火1min，72℃延伸45sec，30個循環(huán)；最后72℃延伸7min。根據(jù)測序結(jié)果分析該snp位點(diǎn)上每個品種群體的基因型。我們證實(shí)了ghail6序列中兩個非同義突變的snp位點(diǎn)，分別在基因組序列的672bp和703bp位置上，并且這兩個snp基因型緊密連鎖(圖3)。第一個snp位點(diǎn)堿基從a變?yōu)間，對應(yīng)的氨基酸從asn變?yōu)閍sp。第二個snp位點(diǎn)堿基從g變?yōu)閍，對應(yīng)的氨基酸從gly變?yōu)閍sp。根據(jù)兩個snp位點(diǎn)堿基信息，將低衣分和低鈴數(shù)品種材料標(biāo)記為ghail6^llb，將高衣分和高產(chǎn)量品種材料標(biāo)記為ghail6^hlb(圖3)。

根據(jù)ghail6基因組序列672bp和703bp位置上snp基因型，我們鑒定出單倍型ghail6^llb材料69個，單倍型ghail6^hlb材料186個(圖3和表1)。利用t-test檢測方法，我們計算了兩組單倍型之間產(chǎn)量性狀的相關(guān)性(圖4)。結(jié)果顯出，相比ghail6^llb，單倍型ghail6^hlb的鈴數(shù)增產(chǎn)了11.33％，與鈴數(shù)性狀呈極顯著正相關(guān)(p＝0.0003)；單倍型ghail6^hlb的衣分增產(chǎn)了4.38％，與衣分性狀呈極顯著正相關(guān)(p＝0.0004)；單倍型ghail6^hlb的籽指減產(chǎn)了6.01％，與籽指性狀呈極顯著負(fù)相關(guān)(p＝0.003)。這與棉花產(chǎn)量性狀衣分和籽指之間呈負(fù)相關(guān)相符合。

通過以上結(jié)果可以看出，基因ghail6在改良棉花產(chǎn)量性狀和培育棉花高產(chǎn)新品種中具有重要的研究價值。一方面可以根據(jù)基因ghail6的兩種單倍型設(shè)計分子標(biāo)記，可以有效的鑒定棉花產(chǎn)量性狀，在高產(chǎn)棉花品種選育研究中有很好的應(yīng)用價值。另一方面，可以通過基因工程的手段將含有高產(chǎn)單倍型ghail6^hlb的基因轉(zhuǎn)入棉花品種中提高棉花產(chǎn)量，也可以將低產(chǎn)單倍型ghail6^llb中的snp位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，改造成高產(chǎn)單倍型從而培育高產(chǎn)棉花新品種。

表1高產(chǎn)和低產(chǎn)單倍型在群體品種材料中的鑒定

<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一個棉花產(chǎn)量性狀關(guān)聯(lián)的乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因

<160>6

<210>1

<211>1509

<212>dna

<213>四倍體陸地棉tm-1

<220>

<223>乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因ghail6cdna序列

<400>1

atggcaccagcaacagtgagtaactggctttcattttcactatccccgatggagatgttg60

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<211>2927

<212>dna

<213>四倍體陸地棉tm-1

<220>

<223>乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因ghail6基因組序列

<400>2

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