本發(fā)明涉及一種化合物及其制備方法，尤其是具有抗炎、抗腫瘤、降糖降脂、抗菌等作用的化合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：當(dāng)今，隨著現(xiàn)代藥理學(xué)、分子生物學(xué)等理論及相關(guān)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，天然藥物的開(kāi)發(fā)途徑和手段也在不斷創(chuàng)新。目前，開(kāi)發(fā)新藥的途徑大致有三條，即民間藥途徑、經(jīng)驗(yàn)藥途徑和分子途徑。其中隨著分子生物學(xué)、遺傳學(xué)及信息處理技術(shù)等的發(fā)展，分子途徑已逐漸成為開(kāi)發(fā)新藥的主要途徑。但是基于我國(guó)目前國(guó)情，且由于技術(shù)設(shè)備的局限性，目前民間藥途徑、經(jīng)驗(yàn)藥途徑是我國(guó)開(kāi)發(fā)新藥的主要途徑，而這兩種途徑又是以藥用植物為主體。以藥用植物為主體發(fā)展起來(lái)的藥物，在歷史上對(duì)人類的防病治病、康復(fù)保健和生育繁衍起到了巨大的作用。天然藥物來(lái)源途徑甚多，大多來(lái)源于植物；據(jù)估計(jì)，全球約有40～50萬(wàn)種植物，但僅有極少部分進(jìn)行過(guò)化學(xué)成分及其活性測(cè)試研究，我國(guó)也是植物資源最豐富的國(guó)家之一，因此充分挖掘和利用自然界結(jié)構(gòu)多樣性的化合物開(kāi)發(fā)新的天然藥物，促進(jìn)我國(guó)醫(yī)藥科技高速前進(jìn)，開(kāi)拓新的市場(chǎng)，推動(dòng)我國(guó)天然藥物的發(fā)展，迎接醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)全球化挑戰(zhàn)具有重要的意義。藥用植物是開(kāi)發(fā)新藥的重要來(lái)源，目前，全球批準(zhǔn)的新藥中，接近半數(shù)是天然藥物，藥物來(lái)自天然產(chǎn)物?，F(xiàn)今，世界上還有近60％的人口還完全依靠植物藥來(lái)防治疾病。但隨著疾病的衍變，病毒抗藥性、機(jī)體耐藥性等問(wèn)題，單純的依靠某種藥用植物，或藥用植物中所含成分為前體來(lái)研發(fā)的新藥，已遠(yuǎn)不能滿足人們對(duì)藥物的需要。針對(duì)某種特定的疾病，人們往往是要將兩種或兩種以上的，甚至更多的藥物同時(shí)服用才能起到一定的治療作用。中藥厚樸為木蘭科植物尖葉厚樸凹葉厚樸干燥的枝皮根皮，主要活性成分為厚樸酚與和厚樸酚，在抑制增殖、抗焦慮、抗過(guò)敏、抗炎、抗腫瘤等多方面具有藥理作用。二甲雙胍是西藥經(jīng)典的降糖藥，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍除了具有良好的降糖效果外，在抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂、抗菌方面也有很好的療效，但是二甲雙胍在體內(nèi)半衰期短，代謝迅速，腎功能不全患者易發(fā)生乳酸性酸中毒，基于以上因素，將二者分子母核拼接在一起，能否增加二甲雙胍的生物利用度。降低腎病患者乳酸性酸中毒的風(fēng)險(xiǎn)，將二者采用化學(xué)合成的方法，有目的的拼接起來(lái)，看其某些藥理作用能否增強(qiáng)，是否能達(dá)到1+1≥2，增效減毒的作用，能否突出二者抗抗炎、降糖降酯的藥理作用等，這些都是未知不可預(yù)料的，也是現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有任何公開(kāi)或報(bào)道的，基于此，本申請(qǐng)發(fā)明人通過(guò)大量探索研究，得到了以下的本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于基于上述技術(shù)背景而提供一種新的化合物，所述化合物的比厚樸酚的毒性小，而且具有更好的抗炎、抗腫瘤抗癌、降糖降脂、抗菌等作用。同時(shí)，本發(fā)明還提供所述化合物的制備方法及用途。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種新的化合物，所述化合物的結(jié)構(gòu)式為：本發(fā)明的化合物由厚樸酚和二甲雙胍通過(guò)特定的反應(yīng)合成所得，本發(fā)明的化合物能夠顯著降低厚樸酚的毒性，而且能夠達(dá)到1+1≥2，起到增效減毒的作用，在抗炎、抗腫瘤抗癌、降糖降脂和抗菌等方面具有更好的效果。另外，本發(fā)明還提供一種如上所述化合物的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：(1)將式(1)的化合物在堿催化劑a作用下與溴代劑在溶劑a中進(jìn)行溴代反應(yīng)，得到式(2)的化合物；(2)將步驟(1)得到的式(2)的化合物在堿催化劑b作用下，與式(3)的化合物在溶劑b中發(fā)生環(huán)合反應(yīng)，即得到本發(fā)明所述式(4)化合物；本發(fā)明所述化合物的制備方法，通過(guò)特定的方式將厚樸酚和二甲雙胍的母核環(huán)合在一起，但是這種環(huán)合并不是盲目的，而是在中醫(yī)藥臨床用藥經(jīng)驗(yàn)的指導(dǎo)下以及有機(jī)化學(xué)的基礎(chǔ)上，有目的、有選擇的將二者結(jié)合一起，發(fā)現(xiàn)二者結(jié)合后能夠起到增效減毒的效果，而且本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單，能夠快速高效得到本發(fā)明的化合物。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(1)中，溴代劑為溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丁酯、氯乙酸甲酯、氯乙酸乙酯、氯乙酸丁酯、碘乙酸甲酯中的至少一種；堿催化劑a為碳酸鈉、碳酸鉀中的至少一種；溶劑a為乙腈、dmf、甲醇、丙酮、乙醇、二甲基亞砜、四氫呋喃、二氯甲烷、二甲基亞砜、二氧六環(huán)中的至少一種。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的更優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(1)中的溴代劑為溴乙酸甲酯。當(dāng)所述溴代劑選擇溴乙酸甲酯時(shí)，所述溴乙酸甲酯分子中的兩個(gè)碳既可以克服分子間的阻力，保證親核取代反應(yīng)的發(fā)生，又保持了所合成化合物的穩(wěn)定性，避免其在體內(nèi)不穩(wěn)定而分解。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的更優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(1)中的溶劑a為甲醇。當(dāng)所述步驟(1)中的溶劑a選擇甲醇時(shí)，甲醇對(duì)該步反應(yīng)的反應(yīng)物溶解性較好，且黏度小，沸點(diǎn)低，極性適中，在既保證了產(chǎn)物收率的前提下，又易于后處理，回收溶劑。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(2)中的堿催化劑b為甲醇鈉、乙醇鈉、金屬鈉中的至少一種；溶劑b為乙腈、dmf、乙酸乙酯、甲醇、丙酮、吡啶、喹啉、二甲基亞砜、四氫呋喃、二氯甲烷、二甲基亞砜、二氧六環(huán)中的至少一種。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的更優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(2)中的堿催化劑b為甲醇鈉，而且本申請(qǐng)發(fā)明人通過(guò)大量研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)所述堿催化劑b選擇甲醇鈉時(shí)，產(chǎn)物的收率明顯高于其他堿催化劑。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的更優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(2)中的溶劑b為甲醇。當(dāng)所述步驟(2)中的溶劑b選擇甲醇時(shí)，甲醇對(duì)該步反應(yīng)的反應(yīng)物溶解性較好，且黏度小，沸點(diǎn)低，極性適中，在既保證了產(chǎn)物收率的前提下，又易于后處理，回收溶劑。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(1)中，溴代劑與式(1)化合物的摩爾比為2:1～8:1；堿催化劑a與式(1)化合物的摩爾比為2:1～6:1；溶劑a與式(1)化合物的摩爾比為5:1～20:1。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(2)中，式(3)化合物與式(2)化合物的摩爾比為2:1～10:1；堿催化劑b與式(2)化合物的摩爾比為0.04:1～5:1；溶劑b與式(2)化合物的摩爾比為5:1～20:1。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(1)中溴代反應(yīng)溫度為30～70℃，反應(yīng)時(shí)間為3～12小時(shí)；所述步驟(2)中環(huán)合反應(yīng)的溫度為40～70℃，反應(yīng)時(shí)間為1～15小時(shí)。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的更優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(1)中溴代反應(yīng)溫度為30～70℃，反應(yīng)時(shí)間為8～10小時(shí)；所述步驟(2)中環(huán)合反應(yīng)的溫度為60～70℃，反應(yīng)時(shí)間為0-15小時(shí)。本申請(qǐng)發(fā)明人經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)所述步驟(1)中的溴代反應(yīng)溫度為65℃，反應(yīng)時(shí)間為12h，步驟(2)中的環(huán)合反應(yīng)的溫度為65℃、反應(yīng)時(shí)間為12小時(shí)，既能保證收率，又具有較好的經(jīng)濟(jì)性。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(1)為：將式(1)的化合物加入干凈的三口燒瓶中，加入溶劑a，加入堿催化劑a，緩慢加入溴代劑，待溫度至67℃時(shí)，回流反應(yīng)，hplc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，原料基本反應(yīng)完全或產(chǎn)物不再增加時(shí)停止反應(yīng)，趁熱抽濾，旋蒸干溶劑即得式(2)的化合物。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(2)為：將化合物(3)加入干凈的三口燒瓶中，加入溶劑b和堿催化劑b，攪拌30分鐘，然后加入步驟(1)得到的式(2)的化合物，在溫度為60-70℃下反應(yīng)0～12小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行冷卻，抽濾，洗滌，然后干燥，用甲醇回流一遍，抽濾，沉淀用二氯甲烷回流一遍，抽濾，二氯濾液旋干，得化合物(4)，純度99％。最后，本發(fā)明還提供了上述所述化合物在用于制備治療腫瘤、癌癥、高血糖、高血脂、心腦血管疾病的藥物中的用途，本發(fā)明所述化合物可用于制備治療腫瘤、癌癥、高血糖、高血脂、心腦血管疾病的藥物。本發(fā)明化合物是發(fā)明人在中醫(yī)藥臨床用藥經(jīng)驗(yàn)以及有機(jī)化學(xué)的指導(dǎo)下，有目的、有選擇的將厚樸酚和二甲雙胍通過(guò)特定的合成方法結(jié)合在一起，所得化合物具有增效減毒的效果，在抗炎、抗腫瘤、抗癌、降糖降脂、抗菌、抗心腦血管疾病等方面具有更好的效果。本發(fā)明所述化合物的制備方法，操作簡(jiǎn)單，能夠快速高效的得到本發(fā)明的化合物。本發(fā)明所述化合物在用于制備治療腫瘤、癌癥、高血糖、高血脂、心腦血管疾病等的藥物中的用途，為制備治療瘤、癌癥、高血糖、高血脂、心腦血管疾病等的藥物提供了新的化合物選擇。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明所述式(4)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式；圖2為本發(fā)明所述式(4)化合物的高分辨質(zhì)譜圖；圖3為本發(fā)明所述式(4)化合物的紅外光譜圖；圖4為本發(fā)明所述式(4)化合物的紫外光譜圖；圖5為本發(fā)明所述式(4)化合物的核磁共振氫譜碳譜圖；圖6為本發(fā)明所述式(4)化合物的核磁共振h-h相關(guān)譜、c-h相關(guān)譜圖。具體實(shí)施方式為更好的說(shuō)明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。以下實(shí)施例所用式(1)～(4)的化合物的結(jié)構(gòu)式分別如下所示：實(shí)施例1本發(fā)明化合物的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如附圖1所示，本實(shí)施例所述化合物采用以下制備方法制備而成：(1)將式(1)的化合物加入干燥潔凈的三口燒瓶中，加入碳酸鈉，加入甲醇，所述碳酸鈉與式(1)化合物的摩爾比為2:1，所述甲醇與式(1)化合物的摩爾比為5:1，緩慢加入溴乙酸甲酯，所述溴乙酸甲酯與式(1)化合物的摩爾比為2:1，溫度升至65℃左右，回流反應(yīng)12小時(shí)，hplc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，原料基本反應(yīng)完全或產(chǎn)物不再增加時(shí)停止反應(yīng)，趁熱抽濾，濾液減壓蒸餾完全，得化合物(2)。(2)將化合物(3)加入干凈的三口燒瓶中，所述式(3)化合物與式(2)化合物的摩爾比為2:1，加入甲醇和甲醇鈉-甲醇溶液，所加入的甲醇與式(2)化合物的摩爾比為20:1，所加入的甲醇鈉與式(1)化合物的摩爾比為0.04:1，攪拌30分鐘，緩慢加入步驟(1)得到的式(2)的化合物，在溫度為65℃下反應(yīng)16小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后冷卻、抽濾、干燥，進(jìn)一步純化，得到式(4)的化合物，即得本發(fā)明化合物。實(shí)施例2本發(fā)明化合物的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如附圖1所示，本實(shí)施例所述化合物采用以下制備方法制備而成：(1)將式(1)的化合物加入干燥潔凈的三口燒瓶中，加入甲醇和碳酸鈉，加熱，所述碳酸鈉與式(1)化合物的摩爾比為6:1，所述甲醇與式(1)化合物的摩爾比為20:1，，緩慢加入氯乙酸甲酯，所述氯乙酸甲酯與式(1)化合物的摩爾比為3:1，溫度升至65℃左右，回流反應(yīng)12小時(shí)，hplc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，原料基本反應(yīng)完全或產(chǎn)物不再增加時(shí)停止反應(yīng)，趁熱抽濾，濾液減壓蒸餾干燥，即得式(2)的化合物；本步驟中，所得式(2)化合物的收率為80％；(2)將化合物(3)加入干凈的三口燒瓶中，，所述式(3)化合物與式(2)化合物的摩爾比為2:1，加入甲醇和乙醇鈉-乙醇溶液，所加入的乙醇與式(2)化合物的摩爾比為20:1，所加入的乙醇鈉與式(2)化合物的摩爾比為0.04:1，攪拌30分鐘，緩慢加入步驟(1)得到的式(2)的化合物，在溫度為65℃下反應(yīng)12小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后冷卻、抽濾、干燥，進(jìn)一步純化，得到式(4)的化合物，即得本發(fā)明化合物。實(shí)施例3本發(fā)明化合物的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如附圖1所示，本實(shí)施例所述化合物采用以下制備方法制備而成：(1)將式(1)的化合物加入干燥潔凈的三口燒瓶中，加入甲醇和碳酸鈉，加熱，所述碳酸鈉與式(1)化合物的摩爾比為2.5:1，所述甲醇與式(1)化合物的摩爾比為20:1，緩慢加入氯乙酸甲酯，所述氯乙酸甲酯與式(1)化合物的摩爾比為5:1，溫度升至65℃左右，回流反應(yīng)12小時(shí)，hplc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，原料基本反應(yīng)完全或產(chǎn)物不再增加時(shí)停止反應(yīng)，趁熱抽濾，濾液減壓蒸餾干燥，即得式(2)的化合物；本步驟中，所得式(2)化合物的收率為80％；(2)將金屬鈉用錫紙包好，用針扎孔，投入甲醇溶液中，待金屬鈉全部溶解，將錫紙取出，溶液備用，將化合物(3)加入干凈的三口燒瓶中，所述式(3)化合物與式(2)化合物的摩爾比為2:1，與金屬鈉反應(yīng)后的甲醇溶液，所加入的甲醇溶液與式(2)化合物的摩爾比為20:1，所加入的金屬鈉與式(2)化合物的摩爾比為0.04:1，攪拌30分鐘，緩慢加入步驟(1)得到的式(2)的化合物，在溫度為65℃下反應(yīng)16小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后冷卻、抽濾、干燥，進(jìn)一步純化，得到式(4)的化合物，即得本發(fā)明化合物。實(shí)施例4本發(fā)明化合物的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如附圖1所示，本實(shí)施例所述化合物采用以下制備方法制備而成：(1)將式(1)的化合物加入干燥潔凈的三口燒瓶中，加入乙醇，加熱，所述碳酸鈉與式(1)化合物的摩爾比為3:1，所述乙醇與式(1)化合物的摩爾比為10:1，緩慢加入溴乙酸乙酯，所述溴乙酸乙酯與式(1)化合物的摩爾比為2:1，溫度升至65℃左右，回流反應(yīng)8小時(shí)，hplc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，原料基本反應(yīng)完全或產(chǎn)物不再增加時(shí)停止反應(yīng)，濾液減壓蒸餾干燥；即得式(2)的化合物；本步驟中，所得式(2)化合物的收率為80％；(2)將化合物(3)加入干凈的三口燒瓶中，所述式(3)化合物與式(2)化合物的摩爾比為5:1，加入甲醇乙醇混合溶液和甲醇鈉-甲醇溶液，所加入的甲醇乙醇混合溶液與式(2)化合物的摩爾比為5:1，所加入的甲醇鈉與式(2)化合物的摩爾比為0.05:1，攪拌30分鐘，緩慢加入步驟(1)得到的式(2)的化合物，在溫度為65℃下反應(yīng)16小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后冷卻、抽濾、干燥，進(jìn)一步純化，得到式(4)的化合物，即得本發(fā)明化合物。實(shí)施例5本發(fā)明化合物的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如附圖1所示，本實(shí)施例所述化合物采用以下制備方法制備而成：(1)將式(1)的化合物加入干燥潔凈的三口燒瓶中，加入四氫呋喃，加熱，所述四氫呋喃與式(1)化合物的摩爾比為20:1，緩慢加入溴乙酸乙酯，所述溴乙酸乙酯與式(1)化合物的摩爾比為5:1，溫度升至70℃左右，回流反應(yīng)6小時(shí)，hplc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，原料基本反應(yīng)完全或產(chǎn)物不再增加時(shí)停止反應(yīng)，濾液減壓蒸餾干燥，即得式(2)的化合物；本步驟中，所得式(2)化合物的收率為80％。(2)將化合物(3)加入干凈的三口燒瓶中，所述式(3)化合物與式(2)化合物的摩爾比為8:1，加入四氫呋喃和甲醇鈉-甲醇溶液，所加入的四氫呋喃與式(2)化合物的摩爾比為10:1，所加入的甲醇鈉與式(2)化合物的摩爾比為0.1:1，攪拌30分鐘，緩慢加入步驟(1)得到的式(2)的化合物，在溫度為65℃下反應(yīng)16小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后冷卻、抽濾、干燥，進(jìn)一步純化，得到式(4))的化合物，即得本發(fā)明化合物。實(shí)施例6本發(fā)明化合物的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如附圖1所示，本實(shí)施例所述化合物采用以下制備方法制備而成：(1)從市場(chǎng)直接購(gòu)買(mǎi)式(1)的化合物，其純度為90％；(2)將式(1)的化合物加入干燥潔凈的三口燒瓶中，加入乙腈和甲醇的混合物，所述乙腈和甲醇的混合物中，所述乙腈和甲醇的體積比為1:4，加熱，所述乙腈和甲醇的混合物與式(1)化合物的摩爾比為15:1，緩慢加入溴乙酸乙酯，所述溴乙酸乙酯與式(1)化合物的摩爾比為8:1，在溫度為67℃下回流反應(yīng)12小時(shí)，hplc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，原料基本反應(yīng)完全或產(chǎn)物不再增加時(shí)停止反應(yīng)，趁熱抽濾，濾液旋干即得式(2)的化合物；本步驟中，所得式(2)化合物的收率為70％，進(jìn)一步純化；(3)將化合物(3)加入干凈的三口燒瓶中，所述式(3)化合物與式(2)化合物的摩爾比為10:1，甲醇乙醇混合體積比1:1，所述甲醇和乙醇的混合物與式(2)化合物的摩爾比為5:1，加入甲醇鈉，所加入的甲醇鈉與式(2)化合物的摩爾比為5:1，攪拌30分鐘，緩慢加入步驟(1)得到的式(2)的化合物，在溫度為65℃下反應(yīng)15小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后冷卻、抽濾、干燥，進(jìn)一步純化，得到式(4)的化合物，即得本發(fā)明化合物。實(shí)施例7本發(fā)明所述化合物圖譜由附圖2～6可看出，本發(fā)明的式(4)化合物，m.p.961.69℃，esi-msm/z:569.312[m+1]+；本發(fā)明的式(4)化合物，ir(kbr)νmax:3478.95,3298.64,3148.22,2923.56,1639.2,1571.7,1524.45,1497.45,1402.96,1216.86,1136.83,1068.37,997.98,912.165,808.028(cm-1)；本發(fā)明的式(4)化合物由于化合物完全對(duì)稱，所以只標(biāo)示一半結(jié)構(gòu)的特征，1hnmr(500mhz,dmso),δ(ppm)7.11(d,1h,c9-h),7.01(dd,1h,c6-h),6.9(d,1h,c5-h),6.8(s,2h,nh2),5.9(d,1h,c2-h),5.03(td,2h,c3-h),4.72(s,2h,-o-ch2-),3.28(d,2h,c1-h),2.99(s,6h,ch3-n)；13cnmr(500mhz,dmso),δ(ppm):172.9(c＝n),166.55(nh2-c＝n),165.07(n-c＝n),154.48(c2),138.00(c4),127.94(c9),127.30(c8),115.36(c6),112.98(c3),70.53(c5),38.68(ch2-o),35.64(c1),35.48((ch3)2-n)。實(shí)施例8本發(fā)明化合物的細(xì)胞毒理試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器細(xì)胞：raw264.7巨噬細(xì)胞(來(lái)源于廣東藥科大學(xué)生科院黃澤波課題組)。實(shí)驗(yàn)試劑：胎牛血清(fbs，gibco)，高糖培養(yǎng)基(dmem，gibco)，0.25％胰蛋白酶(gibco)，青霉素鏈霉素雙抗(gibco)，磷酸鹽緩沖液ph＝7.4(pbs，gibco)，噻唑藍(lán)(mtt，齊云生物科技有限公司)，lps(escherichia055:b55，sigma)，dmso(sigma)，布洛芬(sigma)，lps(sigma)，蒸餾水(屈臣氏)，鹽酸小檗堿(杭州瑞樹(shù)生化有限公司)，鹽酸二甲雙胍(廣州億邦醫(yī)藥科技有限公司)，厚樸酚(廣州合誠(chéng)企業(yè))，bm471、hm475、hm568(第二部分實(shí)驗(yàn)制得)，75％乙醇(實(shí)驗(yàn)室自配)，95％乙醇(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)，磺胺(阿拉丁)，濃磷酸、鹽酸萘乙二胺(阿拉丁)，環(huán)氧合酶-2試劑盒(南京建成生物工程研究所)，前列腺素e2(南京建成生物工程研究所)。主要儀器：hhs型電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)，hf90co2培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司)，sw-cj-1fd超凈臺(tái)(蘇凈安泰)，kdc-220hr高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司)，tdl80-2b低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，顯微鏡，spectramaxplus384酶標(biāo)儀(moleculardevices)，vs60-4微孔板恒溫振蕩器(無(wú)錫沃欣儀器有限公司)，bp210d分析天平(sartorius)，ldzx-50kbs立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)。二、溶液的配制細(xì)胞培養(yǎng)基的配制：dmem：fbs：雙抗＝98:10:1。細(xì)胞凍存液的配制：fbs：dmso＝9:1。mtt溶液的配制方法:稱取mtt500mg，溶于100ml的pbs中，配置的mtt濃度為5mg/ml，用0.22μm濾膜過(guò)濾以除去溶液里的細(xì)菌，放-20℃避光保存。細(xì)胞完全培養(yǎng)液的配制：高糖培養(yǎng)基(dmem)：胎牛血清(fbs)：雙抗＝45:5:0.5。細(xì)胞凍存液的配制：fbs：dmso＝9:1。mtt溶液的配制：現(xiàn)用現(xiàn)配，精密稱取mtt粉末適量，加入pbs，震搖使其完全溶解，制成濃度為5mg/ml的溶液，過(guò)0.22um微孔濾膜，分裝成若干小管，4℃保存?zhèn)溆?，整個(gè)配制過(guò)程注意避光。lps的配制：精密移取1mlpbs加入裝有1mg的lps棕色玻璃瓶中，超聲溶解混勻，完全轉(zhuǎn)移至50ml無(wú)菌離心管中，加入39mlpbs，搖勻，分裝成一系列小管中，-20℃保存?zhèn)溆?，所得lps濃度為25ug/ml。鹽酸二甲雙胍溶液的配制：精密稱取鹽酸二甲雙胍適量，加入空白培養(yǎng)基dmem，配置成3200umol/l的含藥培養(yǎng)基母液，依次用空白培養(yǎng)基稀釋為5、10、25、50、100、200、400、800、1600umol/l的含藥培養(yǎng)基。厚樸酚溶液的配制：精密稱取厚樸酚適量，加入少量的dmso溶解，再加入空白培養(yǎng)基dmem，配置成3200umol/l的含藥培養(yǎng)基母液，依次用空白培養(yǎng)基稀釋為5、10、25、50、100、200、400、800、1600umol/l的含藥培養(yǎng)基(dmso總量不超過(guò)藥物培養(yǎng)基總體積的0.1％)。布洛芬溶液的配制：精密稱取布洛芬適量，加入少量的dmso溶解，再加入空白培養(yǎng)基dmem，配置成1mg/ml的布洛芬母液，用空白培養(yǎng)基稀釋為100ug/ml的含藥培養(yǎng)基(dmso總量不超過(guò)藥物培養(yǎng)基總體積的0.1％)。厚樸酚、鹽酸二甲雙胍混合溶液(h+m、h+2m)溶液的配制：精密稱取厚樸酚與鹽酸二甲雙胍適量，分別按摩爾比1:1、1:2混合，加入少量的dmso溶解，再加入空白培養(yǎng)基dmem，配置成3200umol/l的厚樸酚二甲雙胍混合培養(yǎng)基母液，分別標(biāo)記為h+m、h+2m母液，依次用空白培養(yǎng)基稀釋為5、10、25、50、100、200、400、800、1600umol/l的厚樸酚二甲雙胍混合培養(yǎng)基(dmso總量不超過(guò)藥物培養(yǎng)基總體積的0.1％)。三、實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞復(fù)蘇：15ml無(wú)菌離心管，加入9ml完全培養(yǎng)液，待用；從液氮罐中取出凍存的細(xì)胞株，迅速置于37℃恒溫水浴鍋中，不斷振搖凍存管至完全融化，在1-2min內(nèi)完成操作；75％酒精擦拭消毒外管，迅速轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)，將細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)移至含有9ml完全培養(yǎng)液的離心管中，1000r/min離心5min，棄去上清液，加入適量的完全培養(yǎng)基，接種于6cm培養(yǎng)皿，置于37℃、5％co2以及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每?jī)商旄鼡Q培養(yǎng)基。細(xì)胞傳代：觀察培養(yǎng)皿，待細(xì)胞長(zhǎng)至滿皿的70％-80％，棄去舊培養(yǎng)基，pbs清洗3次，吸棄加入1ml0.25％胰酶消化1min，吸棄胰酶，迅速加入已配好的完全培養(yǎng)基，反復(fù)吹打皿底，使貼壁細(xì)胞完全吹落，吹打均勻，以1:3的比例進(jìn)行傳代。細(xì)胞凍存：觀察培養(yǎng)皿，待細(xì)胞長(zhǎng)至滿皿的80％-90％，棄去舊培養(yǎng)基，pbs清洗3次，吸棄加入1ml0.25％胰酶消化1min，吸棄胰酶，迅速加入已配好的完全培養(yǎng)基，反復(fù)吹打皿底，使貼壁細(xì)胞完全吹落，吹打均勻，將吹打均勻的細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，1000r/min，離心5min，棄去上清液，加入適量已配好的凍存液，吹打均勻，轉(zhuǎn)移至凍存管，每個(gè)凍存管加液1ml，凍存管用封口膜封口，做好標(biāo)記，放入程序降溫盒中，并將程序降溫盒置于-86℃冰箱過(guò)夜，取出凍存好的細(xì)胞，置于液氮罐中長(zhǎng)期保存。細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)：取出計(jì)數(shù)板和蓋玻片，用75％酒精消毒，待完全干燥后，將蓋玻片覆蓋在計(jì)數(shù)板上，使蓋玻片置于計(jì)數(shù)格正中；細(xì)胞混懸液吹打均勻，取細(xì)胞混懸液20ul用完全培養(yǎng)液稀釋至1ml，吹打均勻，用量程10ul的移液器取細(xì)胞混懸液，加在蓋玻片的一側(cè)，確保不要溢出蓋玻片或者玻璃槽內(nèi)，在20×物鏡下觀察，調(diào)整焦距，計(jì)算四角大方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，壓線則按照上數(shù)下不數(shù)，左數(shù)右不數(shù)的原則計(jì)算總個(gè)數(shù)，成團(tuán)細(xì)胞按照單個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞密度計(jì)算公司如下：(細(xì)胞混懸液的細(xì)胞數(shù))/ml＝(四個(gè)大方格總個(gè)數(shù)/4)×50×104。mtt法測(cè)定細(xì)胞活性：mtt化學(xué)名為3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，是一種黃顏色的染料，能與活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)，生成水不溶性的藍(lán)紫顏色甲臜結(jié)晶，可溶于dmso，在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度(od值)，在一定范圍內(nèi)，od值越大，表明細(xì)胞活性越強(qiáng)，藥物毒性越小。取穩(wěn)定培養(yǎng)的細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度104個(gè)/ml，接種于96孔板中，每孔100ul，培養(yǎng)24h，棄去上清液，pbs清洗三遍，每孔加入100ul含mtt的培養(yǎng)基(5mg/ml的mtt母液20ul+80ul空白培養(yǎng)基)，37℃培養(yǎng)4h。小心吸棄上清(避免吸到晶體)，每孔加入150uldmso，震搖混勻，490nm測(cè)定吸光度。各藥物對(duì)正常raw264.7細(xì)胞的毒性研究：取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度105個(gè)/ml，接種于96孔板，每孔200ul，于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中穩(wěn)定培養(yǎng)的24h，小心吸棄上清，分組給藥，給藥48h后吸棄上清，mtt法測(cè)定細(xì)胞活性，計(jì)算存活率。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果各藥物對(duì)raw264.7細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示：濃度(μm)二甲雙胍厚樸酚化合物40μm95.97±1.979n＝6100.0±6.031n＝699.13±1.258n＝61.25μm92.33±2.557n＝694.92±2.529n＝693.50±3.375n＝62.5μm91.21±3.059n＝686.19±2.379n＝690.38±2.688n＝65μm87.04±1.365n＝677.21±3.456n＝689.73±1.165n＝610μm89.31±1.488n＝640.20±1.365n＝690.13±2.075n＝620μm81.38±0.9040n＝62.768±0.1016n＝688.02±2.134n＝640μm78.50±1.083n＝61.877±0.1939n＝687.29±1.185n＝680μm47.01±2.060n＝61.340±0.2756n＝682.74±1.641n＝6由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，化合物4的毒性降低明顯，特別是對(duì)原料藥中厚樸酚的毒性降低效果十分顯著。二甲雙胍原料藥物自身毒性偏低，但是新化合物的毒性較二甲雙胍相比在高濃度下亦具有明顯的優(yōu)勢(shì)，在40和80μm濃度下，化合物4毒性明顯低于二甲雙胍，在高濃度區(qū)間(20-80um)化合物4的毒性更低，且毒性隨濃度增大毒性增強(qiáng)較弱，側(cè)面反映化合物4的細(xì)胞毒性較弱。實(shí)施例9本發(fā)明化合物的抗菌效果試驗(yàn)(一)實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)儀器、試劑1、實(shí)驗(yàn)材料菌株：臨床分離耐藥白色念珠球菌103、100、953和j28由長(zhǎng)海醫(yī)院菌種保存中心贈(zèng)送，所有實(shí)驗(yàn)用菌株均于沙堡葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(sda)劃板活化，于30℃培養(yǎng)2周后，分別挑取單克隆再次劃板活化，取第二次所得單克隆置sda斜面，用上述方法培養(yǎng)后于4℃保存以備用。培養(yǎng)液：rpmi1640液體培養(yǎng)液的配制：rpmi1640(gibcobrl)10g，nahco32.0g，嗎啡啉丙磺酸(mops)(sigma)34.5g(0.165m)，加三蒸水900ml溶解，1nnaoh調(diào)ph至7.0(25℃)，三蒸水定容至000ml，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝后于4℃保存?zhèn)溆?。沙堡葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基(sda)：蛋白胨10g，葡萄糖40g，瓊脂18g，加三蒸水900ml溶解，調(diào)整ph至7.0，以三蒸水定容至1000ml，高壓滅菌(121℃，15min)后于4℃保存?zhèn)溆?。yepd培養(yǎng)液：酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解，三蒸水定容至1000ml，高壓滅菌(121℃，15min)后于4℃保存?zhèn)溆谩?、試劑氟康唑(fluconazole，fcz)注射液由大連輝瑞藥業(yè)有限公司提供，鹽酸厚樸酚(berberinechloride，bbr)由上海長(zhǎng)海醫(yī)院提供，二甲基亞砜(dimethylsulphoxide，dmso)中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司出品。3、實(shí)驗(yàn)儀器multiskanmk3型酶標(biāo)檢測(cè)儀(芬蘭labsystems產(chǎn)品)，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，mjx型智能霉菌培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)thz-082a臺(tái)式恒溫振蕩器(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；sw-ct-if型超凈化工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；倒置顯微鏡(amershampharmacia產(chǎn)品)；微量加樣器(芬蘭finnpette產(chǎn)品)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(丹麥nunclon公司產(chǎn)品)(二)實(shí)驗(yàn)方法1、真菌懸液的配制實(shí)驗(yàn)前，用接種圈從4℃保存的sda培養(yǎng)基上挑取各種白念珠菌少量，接種至1mlyepd培養(yǎng)液，于30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)，活化16h使真菌處于指數(shù)生長(zhǎng)期后期。取該菌液至1mlyepd培養(yǎng)液中，用上述方法再次活化16h后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以rpmi1640培養(yǎng)液調(diào)整菌液濃度至1×103-5×103cfu/ml。2、藥敏反應(yīng)板的制備取無(wú)菌96孔板，于每排1號(hào)孔加rpmi1640液體培養(yǎng)基100μl作空白對(duì)照；3-12號(hào)孔各加新鮮配制的菌液100μl；2號(hào)孔分別加菌液160μl和受試化合物溶液40μl；12號(hào)孔不含藥物，只加菌液100μl作陽(yáng)性生長(zhǎng)對(duì)照。2-11號(hào)孔進(jìn)行倍比稀釋，使各孔的最終藥物濃度分別為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125μg/ml，各孔中dmso含量均低于1％。每次配制藥敏板的同時(shí)均制備一質(zhì)控菌藥敏板，各藥敏板于30℃恒溫箱培養(yǎng)。3、最低抑菌濃度(mic)的判定在30℃恒溫箱中，念珠菌培養(yǎng)24h后用酶標(biāo)分析儀于620nm測(cè)各孔o(hù)d值。陽(yáng)性對(duì)照孔的od值控制在0.2左右，與陽(yáng)性對(duì)照孔比，以od值下降80％以上的最低濃度孔中的藥物濃度為mic80(真菌生長(zhǎng)80％被抑制時(shí)的藥物濃度)。當(dāng)藥物的mic80值超過(guò)測(cè)定濃度范圍時(shí)，按以下方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)：mic80值高于最高濃度64μg/ml時(shí)，計(jì)為“>64μg/ml”；mic80值為最低濃度或在最低濃度以下時(shí)，不作區(qū)別，均計(jì)為“≤0.125μg/ml”。上述實(shí)驗(yàn)均平行操作2到3次，當(dāng)mic80值能準(zhǔn)確重復(fù)或只差一個(gè)濃度時(shí)才被接受，并以較高濃度作為mic80值；當(dāng)mic80值相差兩個(gè)濃度以上時(shí)，則需重新實(shí)驗(yàn)，直到符合要求為止。二甲雙胍厚樸酚化合物4青霉素mic80(μg/ml)10.6±0.616.28±0.8312.54±1.381.16±0.61從mic80值可以看出，本發(fā)明化合物4對(duì)該菌的抗菌效果不及單用的厚樸酚，但遠(yuǎn)好于單用的二甲雙胍。實(shí)施例10本發(fā)明化合物的抗腫瘤抗癌效果試驗(yàn)以肝癌細(xì)胞株hepg2和白血病細(xì)胞株k562為例，通過(guò)探討本發(fā)明化合物對(duì)肝癌細(xì)胞株hepg2和白血病細(xì)胞株k562增殖的抑制作用中，來(lái)研究該化合物對(duì)的抗腫瘤抗癌作用。本實(shí)驗(yàn)采用sulforhodamineb(srb)染色、臺(tái)盼藍(lán)排染法、彗星電泳技術(shù)和ao/eb雙染法檢測(cè)本發(fā)明化合物對(duì)肝癌細(xì)胞株hepg2和白血病細(xì)胞株k562的毒性、抑制癌細(xì)胞增殖作用、對(duì)k562細(xì)胞dna的損傷和誘導(dǎo)k562細(xì)胞的凋亡作用。(一)材料、儀器與試劑1、材料與試劑本發(fā)明化合物(dmso配制原液，臨用前稀釋，保證dmso濃度在反應(yīng)體系中至少稀釋為1×10-2)，人肝癌細(xì)胞株hepg2和人白血病細(xì)胞株k562引自蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，培養(yǎng)基rpmi1640(美國(guó)gibcobrl)，黃酰羅丹明b(sulforhodamineb，srb，美國(guó)sigma)，臺(tái)盼藍(lán)(sigma公司)，小牛血清(杭州四季青)，其它化學(xué)試劑均為分析純。2、儀器美國(guó)precisionscientificco2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、光學(xué)顯微鏡、酶標(biāo)儀(bio-radmodel550和bio-radmodel680)、熒光顯微鏡、水平電泳槽、高速低溫離心機(jī)、costar細(xì)胞培養(yǎng)板。(二)實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)：hepg2和k562細(xì)胞分別接種于含10％小牛血清rpmi1640培養(yǎng)基中，置37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。1、srb法檢測(cè)本發(fā)明化合物對(duì)hepg2細(xì)胞的毒性作用原理：sulforhodamineb(srb)是一種蛋白質(zhì)結(jié)合染料，粉紅色，可溶于水。srb可以與生物大分子中的堿性氨基酸結(jié)合，其在511nm的od讀數(shù)與細(xì)胞數(shù)呈良好的線性關(guān)系。故可用作細(xì)胞數(shù)的定量。方法：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hepg2細(xì)胞以10×104ml-1的濃度接種于96孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24h后，向相應(yīng)孔中分別加入不同稀釋濃度的本發(fā)明化合物新鮮培養(yǎng)液100μl，繼續(xù)培養(yǎng)24、48h后，棄去培養(yǎng)液，加入10％的三氯乙酸(tca)100μl，靜置5min后，將孔板移置4℃固定1h，倒掉固定液，用去離子水洗5遍，晾干。之后每孔加入100μl0.4％的srb染色10min，用1％的醋酸洗5次，自然晾干。然后每孔加入150μl10mmol·l-1的非緩沖tris堿液(unbufferedtris-basesolution，ph10.5)溶解與蛋白質(zhì)結(jié)合的srb，用振蕩器震蕩5min使其充分溶解后，用酶標(biāo)儀在515nm處測(cè)定每孔的od值。求其細(xì)胞增值率(％)＝(t-t0)/(c-t0)×100，其中c表示對(duì)照組的細(xì)胞od值；t表示加藥組的細(xì)胞od值；t0表示對(duì)照平板測(cè)定加藥時(shí)的細(xì)胞od值。在加藥前即刻將平板中接種的細(xì)胞用tca固定。如果加藥組最終的od值大于t0；說(shuō)明細(xì)胞在加藥后仍然生長(zhǎng)。如果加藥組最終的od值小于t0，說(shuō)明加藥后細(xì)胞被殺死。利用回歸方程求出50％增值抑制率的藥物濃度(50％inhibitionconcentration,ic50)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，加藥組最終的細(xì)胞數(shù)小于t0，繼而說(shuō)明藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，加藥后細(xì)胞被殺死。以本發(fā)明化合物組和對(duì)照組處理hepg2細(xì)胞24h后的ic50值為例來(lái)比較各化合物對(duì)該細(xì)胞的毒性作用，ic50值如下表所示：二甲雙胍厚樸酚化合物4順鉑ic50(μmol/l)20.54±0.6240.53±1.8519.38±3.859.54±0.62實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明化合物4的ic50值小于合成前單體化合物，即對(duì)hepg2細(xì)胞抑制作用增強(qiáng)，但仍然弱于陽(yáng)性對(duì)照藥。2、臺(tái)盼藍(lán)排染法檢測(cè)本發(fā)明化合物對(duì)k562細(xì)胞的毒性作用原理：活細(xì)胞具有排斥臺(tái)盼藍(lán)的能力，細(xì)胞死亡后由于膜完全性的破壞，細(xì)胞即被著色。將含有臺(tái)盼藍(lán)的細(xì)胞懸液滴入白細(xì)胞計(jì)數(shù)板小室中，在光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)活細(xì)胞(未被染成藍(lán)色的細(xì)胞)。方法：濃度為10×104·ml-1的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的k562細(xì)胞懸液，以0.5ml·孔-1接種于24孔培養(yǎng)板中。置于37℃、％co2飽和濕度培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24h后加藥。繼續(xù)培養(yǎng)24、48h后，取0.4％臺(tái)盼藍(lán)溶液0.15ml加入0.6ml細(xì)胞懸液中，充分混勻，染色5min后吸取少量混合液，注入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板小室，光學(xué)顯微鏡下數(shù)活細(xì)胞，重復(fù)3次，取其平均數(shù)。求其細(xì)胞增值率(％)＝(t-t0)/(c-t0)×100，其中c表示對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)；t表示加藥組的細(xì)胞數(shù)；t0表示對(duì)照平板測(cè)定加藥時(shí)的細(xì)胞數(shù)。如果加藥組最終的細(xì)胞數(shù)大于t0，說(shuō)明細(xì)胞在加藥后仍然生長(zhǎng)。如果加藥組最終的細(xì)胞數(shù)小于t0，說(shuō)明加藥后細(xì)胞被殺死。利用回歸方程求出ic50。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，加藥組最終的細(xì)胞數(shù)小于t0，繼而說(shuō)明藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，加藥后細(xì)胞被殺死。ic50值如下表所示：順鉑二甲雙胍厚樸酚化合物4ic50(μmol/l)20.54±5.6360.18±7.9153.25±5.4441.47±4.78實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明化合物4的ic50值小于合成前單體化合物，即對(duì)hepg2細(xì)胞抑制作用增強(qiáng)，但仍然弱于陽(yáng)性對(duì)照藥。實(shí)施例11本發(fā)明化合物的降糖作用效果試驗(yàn)以阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照藥，先通過(guò)體外酶抑制試驗(yàn)，測(cè)定本發(fā)明化合物對(duì)葡萄糖苷酶的抑制作用，計(jì)算其ic50值，若該值較小，則可以考慮進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)降糖試驗(yàn)。(此處體外酶抑制試驗(yàn)方案與上述抗炎方案相似，此處不作詳細(xì)說(shuō)明)，體內(nèi)降糖試驗(yàn)方法，以高血糖大鼠為受試對(duì)象，來(lái)考察本發(fā)明化合物的體內(nèi)降糖作用。高血糖大鼠建模與分組：選取清潔級(jí)sd大鼠(200±209)70只，雌雄各半，平衡飼養(yǎng)3d，建模前用血糖儀檢測(cè)全血血糖，無(wú)血糖異常情況。隨機(jī)將大鼠分為對(duì)照組10只，建模組60只，分籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間給予基礎(chǔ)飼料和滅菌自來(lái)水。建模前12h禁食不禁水，于尾部靜脈注射四氧嘧啶(6omg.kg-1體重)，對(duì)照組注射同劑量的生理鹽水。連續(xù)觀察5天后側(cè)血糖，選擇空腹血糖在13～20mmol.l-1之間實(shí)驗(yàn)用。選取建模成功糖尿病大鼠40只，隨機(jī)分為4組，每組10只，分別設(shè)立高血糖模型組、厚樸酚組、本發(fā)明化合物組與陽(yáng)性對(duì)照(二甲雙胍)組，分別用0.5％苦味酸溶液標(biāo)一記，按組別分籠飼養(yǎng)，雌雄分開(kāi)。給藥：2％吐溫-80溶液配制給藥用厚樸酚、本發(fā)明化合物及二甲雙胍溶液，濃度均為10mg.ml-1。給藥組大鼠按100mg.kg-1體重劑量灌胃對(duì)應(yīng)藥液10ml.kg-1，體重，對(duì)照組與模型組大鼠灌胃2％吐溫-80溶液10ml.kg-1體重，每天灌胃給藥1次，連續(xù)灌胃15天。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，室溫23±2℃，濕度50～60％，室內(nèi)照明和黑暗交替12h/d，每天換水1次，兩天換墊料1次，各組自由攝取飲水。實(shí)驗(yàn)大鼠血糖測(cè)定及降血糖功能評(píng)價(jià)：于各給藥組灌胃給藥當(dāng)天及給藥后第5、10、15天尾靜脈空腹取血，用血糖儀測(cè)定各組大鼠空腹血糖值，比較各組大鼠空腹血糖值及血糖下降百分率，血糖下降百分率＝(實(shí)驗(yàn)前血糖值-實(shí)驗(yàn)后血糖值)/實(shí)驗(yàn)前血糖值×100％。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有計(jì)量數(shù)據(jù)以“均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)偏差(x±s)”表示，標(biāo)準(zhǔn)偏差按“n-1”方法計(jì)算，多組樣本均數(shù)的比較，采用單因素方差分析，p<0.05判斷差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.01判斷差別具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果如下表所示：通過(guò)計(jì)算分析，本發(fā)明化合物與厚樸酚及二甲雙胍相比，p<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有差異，說(shuō)明本發(fā)明化合物的降糖效果優(yōu)于單用厚樸酚及二甲雙胍。實(shí)施例12本發(fā)明化合物的降脂作用效果試驗(yàn)以高脂飼料誘導(dǎo)的肥胖金黃地鼠為受試對(duì)象，給予本發(fā)明化合物后，檢測(cè)體重，肝重，脂體比和血脂等指標(biāo)，通過(guò)觀察其減肥效果，進(jìn)而探討其降脂作用。(一)材料儀器：高速離心機(jī)，標(biāo)準(zhǔn)大鼠試驗(yàn)籠，電子秤；藥品與試劑：本發(fā)明化合物，奧里司他，甘油三酯試劑盒，hdl-c試劑盒，ldl-c試劑盒；動(dòng)物：雄性金黃地鼠60只。(二)實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物造模與分組：60只雄性金黃地鼠給予基礎(chǔ)飼料適應(yīng)喂養(yǎng)3天后，隨機(jī)選取10只作為正常對(duì)照組，剩余的讓其自由采食高脂飼料(組成：10％豬油，10％蛋黃粉，1％膽固醇，79％基礎(chǔ)飼料)。喂養(yǎng)四周后，空腹禁食不禁水12h，眼眶后取靜脈血，測(cè)定其體重、tc、tg、ldl-c和hdl-c。將造模成功的金黃地鼠隨機(jī)分為5組(n＝10)：模型組、奧利司他組，本發(fā)明化合物低、中、高劑量組，藥物干預(yù)4周，正常對(duì)照組和模型組每天灌胃等體積生理鹽水，奧里斯他組每天給藥42mg/kg，本發(fā)明化合物低、中、高劑量分別按每天23.35、46.70、70.05mg/kg給藥，金黃地鼠自由攝食、飲水；光照節(jié)律12l、12d(7:00-19:00)，室溫(24±2)℃，濕度：(55±10)％。(三)指標(biāo)測(cè)定1、體重、體長(zhǎng)和剩食量測(cè)定：在試驗(yàn)期間，各組動(dòng)物均采取單籠飼養(yǎng)并自由攝食、飲水。每3天測(cè)定一次體重(灌胃給藥前稱重)和剩食量，并記錄結(jié)果。處死前麻醉狀態(tài)下測(cè)定其體長(zhǎng)(鼻至肛門(mén)的長(zhǎng)度)、腰圍，按公式[lee，s＝(體重)-(1/3)x103/體長(zhǎng)(cm)]計(jì)算lee’s指數(shù)。2、血清tc、tg、ldl-c、hdl-c測(cè)定：取血前，空腹禁食不禁水12h,用玻璃毛細(xì)管于眼眶后靜脈取血，禁食2h后，5000r/min離心10min，取上清液，-20℃保存，采用生化試劑盒測(cè)定血清中tc、tg、ldl-c、hdl-c。3、肝重、睪丸及腎周脂肪測(cè)定：剖取肝臟、腎周圍脂肪和睪丸周圍的全部脂肪并稱重，計(jì)算脂肪/體重的比值(脂體比)。(四)數(shù)據(jù)處理以spss17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算數(shù)據(jù)以“均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，進(jìn)行單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以用藥四周后本發(fā)明化合物組及陽(yáng)性對(duì)照物使高脂血組小鼠tc、tg、ldl-c、hdl-c下降的百分率為例來(lái)初步探究該藥物的降脂作用。本發(fā)明化合物與厚樸酚及二甲雙胍相比(p<0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而四者與陽(yáng)性對(duì)照藥奧里司他相比(p<0.01)，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即本發(fā)明化合物的降脂作用優(yōu)于單用的厚樸酚或二甲雙胍，但不及陽(yáng)性對(duì)照藥奧利司他。實(shí)施例13本發(fā)明化合物對(duì)心腦血管疾病的作用效果試驗(yàn)通過(guò)探討本發(fā)明化合物對(duì)apoe(-/-)小鼠早期動(dòng)脈粥樣硬化的作用(主要通過(guò)觀察對(duì)該鼠右頸總動(dòng)脈外膜炎癥、硬化血管膠原及彈力板的影響)，來(lái)研究本發(fā)明化合物在心腦血管疾病方面的作用。(一)材料與方法1、儀器與器材：tissue-tekii旋轉(zhuǎn)式自動(dòng)脫水機(jī):日本櫻花公司，tissue-tek、tecs組織包埋機(jī):日本櫻花公司，冰凍切片機(jī):德國(guó)leica公，超低溫冰箱:日本三洋公司，普通光學(xué)顯微鏡:日本nikon公司，偏振光顯微鏡:日本olympus公司，熒光顯微鏡:日本nikon公司，imagepro-plus6.0圖像分析軟件:美國(guó)macromedia公司，數(shù)據(jù)采集及分析系統(tǒng)spss17.0:美國(guó)powerlab公司，7600自動(dòng)分析儀:日本日立公司。2、藥物與試劑本發(fā)明化合物(自制)，阿托伐他?。汉贾菽硸|制藥有限公司，生理鹽水注射液：北京雙鶴藥業(yè)有限公司，異戊巴比妥鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，蘇木素-伊紅生物染色劑：北京化工廠，羅丹明標(biāo)記的羊抗兔igg：北京中杉金橋生物技術(shù)公司，熒光防淬滅劑：北京中杉金橋生物技術(shù)公司。磷酸鹽緩沖液(phosphate-bufferedsaline，pbs，0.01m，ph7.4)：稱取8gnacl、0.2gkcl、1.44gna2hpo4和0.24gkh2po4，溶于800ml蒸餾水中，用hci調(diào)節(jié)溶液ph值至7.4，最后加蒸餾水定溶至il。4％多聚甲醛液：稱取409多聚甲醛，置于燒瓶中，加入800ml0.lmol/l磷酸緩沖液，加熱至60℃，磁力攪拌使粉末完全溶解，最后補(bǔ)足0.lmol/l的pb至1000ml，充分混勻。苦味酸天狼猩紅染色液：0.1g天狼猩紅溶解于100ml苦味酸飽和液中。維多利亞藍(lán)染色液：維多利亞藍(lán)2g、糊精0.50g、間苯二酚4g、蒸餾水200ml，將上述混合煮沸5min，再將已煮沸的30％三氯化鐵液加入上液中，繼續(xù)煮沸2min，此時(shí)不斷攪拌呈膠體狀，去火冷卻過(guò)濾后，把紙上的殘?jiān)旁?0℃恒溫箱中烤干，最后把干殘?jiān)苡?00ml的75％酒精中，再加入濃鹽酸5ml和苯酚5g,置室溫備用。(二)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組以c57bl/6為遺傳背景的6周齡雄性apoe(-/-)小鼠20只，購(gòu)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部。飼養(yǎng)于符合二級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)的中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物室。室內(nèi)凈化空氣流動(dòng)換氣，保持室溫22℃～25℃，濕度50％左右，明暗周期12小時(shí)(7am-7pm)。小鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)鼠籠中，鼠籠、飲水瓶、墊料均經(jīng)高壓消毒。小鼠自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)6天后，飼以含豬油21％、膽固醇1.25％和普通混合飼料粉77.75％的高脂飼料(60鉆滅菌照射處理)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作過(guò)程嚴(yán)格遵照北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院及中日友好醫(yī)院倫理委員會(huì)的規(guī)程進(jìn)行，對(duì)動(dòng)物的處理符合動(dòng)物保護(hù)倫理道德。將小鼠隨機(jī)分為4組，空白對(duì)照組、厚樸酚大、中、小劑量組，每組各5只，觀察給藥后不同劑量組對(duì)apoe(-/-)小鼠早期動(dòng)脈粥樣硬化的影響。給藥方法：根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》(徐叔云主編，2002年第三版，人民衛(wèi)生出版社)中的人與小鼠用藥劑量換算公式，按體重對(duì)實(shí)驗(yàn)藥物劑量進(jìn)行換算。根據(jù)成人每日用藥臨床推薦的常用劑量，按成人與小鼠的體重折算系數(shù)9.01折算成小鼠用量,阿托伐他汀組給予阿托伐他汀3mg/kg/d，空白本發(fā)明化合物組給予生理鹽水0.2ml/kg/d，本發(fā)明化合物組給予本發(fā)明化合物大劑量組240mg/kg/d、中劑量組160mg/kg/d、小劑量組80mg/kg/d以灌胃的方式給藥，持續(xù)4周。1、本發(fā)明化合物對(duì)ap0e(-/-)小鼠早期動(dòng)脈粥樣硬化右頸總動(dòng)脈外膜炎癥的影響取材與切片：取材：實(shí)驗(yàn)小鼠禁食12h后,以1％異戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，將其仰臥，頭部及四肢固定于手術(shù)臺(tái)上，酒精消毒后縱形切開(kāi)腹胸及頸部皮膚，逐層分離，剪開(kāi)橫隔，暴露心臟，下腔靜脈取血后，以0.9％的生理鹽水由左心室進(jìn)行灌注，待血液沖洗干凈后，暴露右頸總動(dòng)脈鞘，游離出右頸總動(dòng)脈，長(zhǎng)約1cm，用冰生理鹽水將其沖洗,濾紙吸干后，放在一涂有oct冰凍切片包埋劑的直徑為3cm的小圓形硬紙板上，并將oc丁涂在整個(gè)標(biāo)本上，放在已有液氮預(yù)冷約1min的盛有異戊烷的小燒杯內(nèi)冷凍成固態(tài)，后置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｇ衅簭挠翌i總動(dòng)脈近端下方開(kāi)始以6μm的厚度連續(xù)橫切，每50μm留取1張切片，將其置于載玻片上，每只小鼠取8張切片。病理學(xué)檢驗(yàn)及分析：冰凍切片行蘇木素-伊紅(he)染色，在高倍鏡下觀察血管周圍炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。觀察范圍為小鼠右頸總動(dòng)脈及周圍的間質(zhì)組織，由于所染色的切面、顯露的血管長(zhǎng)度不同，觀察到的面積也各不相同，加之樣本炎細(xì)胞分布疏密程度有很大差別，為統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，我們都選取每一支被觀察血管炎細(xì)胞分布密集的區(qū)域，每張切片在leica全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)上隨機(jī)計(jì)算8個(gè)400倍物鏡視野中陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)作為該樣本的統(tǒng)計(jì)數(shù)值。冰凍切片he染色步驟：①冰凍切片，室溫下恢復(fù)20min；②切片入harris蘇木素15min；③流水沖洗5min；④0.5％鹽酸酒精分化30sec；⑤流水沖洗5min；⑥伊紅染色10min；⑦流水沖洗5min；⑧梯度酒精脫水；⑨二甲苯透明15minx2次，中勝封片。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：使用spssl7.0軟件，劑量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x士s)表示,多組比較采用單因素方差分析(one-wayanova)，組間兩兩比較采用lsd，p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以大劑量組時(shí)，本發(fā)明化合物組及陽(yáng)性對(duì)照藥對(duì)小鼠右頸總動(dòng)脈外膜炎癥細(xì)胞個(gè)數(shù)的影響，來(lái)比較該藥物對(duì)ap0e(-/-)小鼠早期動(dòng)脈粥樣硬化右頸總動(dòng)脈外膜炎癥的影響，進(jìn)而探討其在心腦血管疾病方面的作用。組別阿托伐他汀厚樸酚二甲雙胍化合物4炎癥細(xì)胞數(shù)(個(gè))5±225±329±319±2結(jié)果表明：本發(fā)明化合物與厚樸酚及二甲雙胍相比(p<0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明本發(fā)明化合物對(duì)小鼠右頸總動(dòng)脈外膜炎癥的抑制作用優(yōu)于厚樸酚或二甲雙胍。2、本發(fā)明化合物對(duì)ap0e(-/-)小鼠早期動(dòng)脈粥樣硬化血管膠原及彈力板的影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：喂養(yǎng)分組，取材與切片同對(duì)ap0e(-/-)小鼠早期動(dòng)脈粥樣硬化右頸總動(dòng)脈外膜炎癥實(shí)驗(yàn)相同。病理學(xué)檢驗(yàn)及分析：冰凍切片天狠猩紅套染維多利亞藍(lán)染色，冰凍切片天狼猩紅染色選取切片以0.1％苦味酸天狼猩紅染液染色，以評(píng)估i型和111型膠原。每只小鼠留取8張切片，這8張切片的膠原含量平均值代表每只小鼠的右頸總動(dòng)脈膠原含量值?？辔端崽炖切杉t染色步驟：(1)冰凍切片室溫下恢復(fù)20min；(2)移入二甲苯和純酒精(1:1)混合液中5min左右；(3)入100％、95％、85％、70％酒精,各級(jí)為5min；(4)蒸餾水洗3次；(5)以苦味酸天狼猩紅染液染60min；(6)無(wú)水酒精直接分化與脫水；(7)二甲苯透化，中性樹(shù)膠封片。冰凍切片維多利亞藍(lán)染色：選取切片以維多利亞藍(lán)染液染色，以評(píng)估彈力纖維分級(jí)及內(nèi)中膜厚度，每只小鼠留取8張切片，這8張切片的彈力纖維分級(jí)及其中膜厚度平均值代表每只小鼠的右頸總動(dòng)脈彈力纖維分級(jí)及內(nèi)中膜厚度的值。維多利亞藍(lán)染色步驟：(1)冰凍切片室溫下恢復(fù)20min；(2)切片入75％酒精中洗1min；(3)在維多利亞藍(lán)染色液中30min左右；(4)直接用95％酒精分色數(shù)秒鐘；(5)用蒸餾水洗三次；(6)二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：使用spssl7.0軟件，劑量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組比較采用單因素方差分析(one-wayanova)，組間兩兩比較采用lsd，p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以大劑量組時(shí)，本發(fā)明化合物組及陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)小鼠ⅰ型，ⅲ型膠原含量(％)及彈力纖維ⅰ級(jí)病率(％)的影響來(lái)考察該藥物對(duì)ap0e(-/-)小鼠早期動(dòng)脈粥樣硬化血管膠原及彈力板的影響。結(jié)果表明：以ⅰ型、ⅲ型膠原含量(％)及彈力纖維ⅰ級(jí)病率(％)為對(duì)照參數(shù)，本發(fā)明化合物與二甲雙胍及厚樸酚比較(p<0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而三者與陽(yáng)性對(duì)照組比較(p<0.01)，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，進(jìn)而表明本發(fā)明化合物對(duì)ap0e(-/-)小鼠早期動(dòng)脈粥樣硬化血管膠原及彈力板的影響優(yōu)于單用厚樸酚或二甲雙胍，但不及陽(yáng)性對(duì)照藥。最后所應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12