本發(fā)明涉及抗氧化肽，具體涉及一種利用定點(diǎn)突變和分子修飾技術(shù)改造的珍珠貝肉抗氧化肽，本發(fā)明還涉及該抗氧化肽構(gòu)建方法以及制備方法。
背景技術(shù)：
：海洋物種豐富，海洋生物體內(nèi)具有許多天然的蛋白質(zhì)類(lèi)抗氧化活性物質(zhì)，從海洋天然產(chǎn)物中獲得高效、專(zhuān)一的大分子或小分子抗氧化活性物質(zhì)，來(lái)改善人民膳食營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)、提高人民的健康生活水平具有重要的意義。海水珍珠貝肉是一種優(yōu)質(zhì)蛋白，含有許多功能活性物質(zhì)，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所近10年來(lái)一直致力于合浦珠母貝肉的高值化開(kāi)發(fā)利用，積累了一系列的成果。其中從合浦珠母貝肉中通過(guò)酶解技術(shù)制備得到的珍珠貝肉抗氧化肽，其結(jié)構(gòu)序列為gly-ala-gly-leu-pro-gly-lys-arg-glu-arg，但在實(shí)現(xiàn)大規(guī)模制備生產(chǎn)該抗氧化肽時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)需要大量的貝肉原料，制備速度慢，成本較高，而且該多肽的抗氧化活性的dpph清除能力的ic50僅有0.132mg/ml,僅為化妝品中常用抗氧化劑bht(dpph清除能力的ic50僅有0.025mg/ml)的dpph清除能力的六分之一。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的之一是提供一種利用定點(diǎn)突變和分子修飾技術(shù)改造的珍珠貝肉抗氧化肽。本發(fā)明目的之二是提供上述珍珠貝肉抗氧化肽的構(gòu)建方法。本發(fā)明目的之三是提供上述珍珠貝肉抗氧化肽的制備方法，該方法滿足抗氧化肽在工業(yè)上的應(yīng)用，縮短制備時(shí)間，降低成本，提高抗氧化肽的活性。本發(fā)明所述的利用定點(diǎn)突變和分子修飾技術(shù)改造的珍珠貝肉抗氧化肽，其氨基酸序列如下：gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg-asn-gly-gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg-glu-arg-asn-gly-gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg-asn-gly-gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg-glu-arg-asn-gly-gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg。該抗氧化肽在本發(fā)明命名為mp。本發(fā)明所述的利用定點(diǎn)突變和分子修飾技術(shù)改造的珍珠貝肉抗氧化肽的構(gòu)建方法，將從海水珍珠貝肉中酶法制備的抗氧化肽gly-ala-gly-leu-pro-gly-lys-arg-glu-arg的4號(hào)位位置的leu經(jīng)定點(diǎn)突變?yōu)閕le，突變后多肽氨基酸序列轉(zhuǎn)變?yōu)椋篻ly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg，然后進(jìn)行分子修飾，對(duì)其序列作進(jìn)一步改造，使之序列串聯(lián)延長(zhǎng)從而具有卷曲結(jié)構(gòu)。由于獲得的珍珠貝肉抗氧化肽序列較長(zhǎng)并具有一些簡(jiǎn)單的卷曲結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其抗氧化活性由于空間結(jié)構(gòu)的改變而活性提高，經(jīng)驗(yàn)證構(gòu)建所得的抗氧化肽的活性高，是現(xiàn)有的同類(lèi)肽的4倍。本發(fā)明所述的利用定點(diǎn)突變和分子修飾技術(shù)改造的珍珠貝肉抗氧化肽的制備方法，該方法是在上述構(gòu)建方法基礎(chǔ)上，進(jìn)一步作密碼子優(yōu)化、重組工程菌株構(gòu)建和純化獲得目的蛋白抗氧化肽。具體地，該制備方法包括以下步驟：(1)對(duì)上述構(gòu)建的抗氧化肽進(jìn)行密碼子優(yōu)化得到利于在宿主菌de3表達(dá)的基因密碼子序列，該mp目的基因序列如下：5’-aatggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgttaactcgag-3’；(2)所述mp目的基因與載體pgex-his構(gòu)建重組載體pgex-his-mp，而后將該重組載體轉(zhuǎn)化原核表達(dá)宿主菌大腸桿菌菌株de3，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，獲得重組工程菌株de3-pgex-his-mp；(3)對(duì)重組工程菌株de3-pgex-his-mp進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，然后收集經(jīng)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出的含有目的蛋白的沉淀；(4)所述的含有目的蛋白的沉淀經(jīng)純化，獲得含有目的蛋白mp。本發(fā)明具有以下技術(shù)效果：（1）抗氧化肽活性高：本發(fā)明提供的抗氧化肽是在海水珍珠貝抗氧化肽的基礎(chǔ)上進(jìn)行定點(diǎn)突變后進(jìn)行分子修飾使其序列串聯(lián)延長(zhǎng)而得，由于序列較長(zhǎng)并具有簡(jiǎn)單的卷曲結(jié)構(gòu)，使得其抗氧化活性由于空間結(jié)構(gòu)的改變而提高抗氧化活性，而且該抗氧化肽的抗氧化活性與改造之前的海水珍珠貝抗氧化肽相比，提高了4倍，這為后期珍珠貝抗氧化肽在化妝品、保健食品領(lǐng)域中的應(yīng)用打下良好基礎(chǔ)。（2）抗氧化肽純度高：采用該方法制備的抗氧化肽mp(相對(duì)于傳統(tǒng)的酶解方法得到的純度高，經(jīng)分離純化后，蛋白純度高達(dá)95%以上，且操作簡(jiǎn)單。而傳統(tǒng)方法獲取的酶解液的酶解程度控制在不同批次會(huì)受到原料、操作人員、環(huán)境的影響而導(dǎo)致酶解程度的不一樣，從而使得海水珍珠貝貝肉酶解的小分子抗氧化肽純度低。（3）制備抗氧化肽的速度快：由于本發(fā)明所用重組工程菌的宿主菌為大腸桿菌，平均繁殖一代的周期為20min，因此誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間短，大大節(jié)約時(shí)間。然而傳統(tǒng)酶解方法由于受到原料成本、加工處理方式等條件的限制，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，相對(duì)于大腸桿菌系統(tǒng)來(lái)講有著工藝單位時(shí)間產(chǎn)量上等諸多限制。（4）制備成本低：本發(fā)明采用大腸桿菌為宿主菌，由于大腸桿菌生長(zhǎng)用培養(yǎng)基原料價(jià)格低廉，其培養(yǎng)基組成的95%以上均為水，易于大規(guī)模生產(chǎn)獲得大量的抗氧化活性肽物質(zhì)，在成本上相對(duì)于傳統(tǒng)的酶解方法有著經(jīng)濟(jì)節(jié)約。（5）本發(fā)明提供構(gòu)建方法和制備方法自動(dòng)化程度高，可以實(shí)現(xiàn)全程自動(dòng)化無(wú)人管理，大大節(jié)約了人力成本。附圖說(shuō)明圖1是ni-nta親和層析純化sds-page分析圖；m：proteinmarker；1：上樣；2：流出；3：bindingbuffer沖洗組分；4：洗脫。圖2是本發(fā)明提供的抗氧化肽mp的質(zhì)譜分析圖譜。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。本實(shí)施案例在以本發(fā)明技術(shù)為前提下進(jìn)行實(shí)施，現(xiàn)給出詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于以下的實(shí)施例。1.利用定點(diǎn)突變技術(shù)，將從海水珍珠貝肉中酶法制備的抗氧化肽：gly-ala-gly-leu-pro-gly-lys-arg-glu-arg的4號(hào)位位置的leu突變?yōu)閕le，突變后多肽氨基酸序列轉(zhuǎn)變?yōu)椋篻ly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg，然后通過(guò)分子修飾技術(shù)，對(duì)其序列進(jìn)行進(jìn)一步的設(shè)計(jì)，使得改造過(guò)的多肽由于序列的串聯(lián)延長(zhǎng)而具有一些簡(jiǎn)單的卷曲結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)致其抗氧化活性由于空間結(jié)構(gòu)的改變而改變。至此，經(jīng)定點(diǎn)突變和分子修飾兩步改造所形成的新的抗氧化活性多肽構(gòu)建完成，命名為mp，對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為：gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg-asn-gly-gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg-glu-arg-asn-gly-gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg-asn-gly-gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg-glu-arg-asn-gly-gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg。定點(diǎn)突變和分子修飾是一起做的。定點(diǎn)突變依據(jù)：由酶解分離純化出的抗氧化多肽（序列為gly-ala-gly-leu-pro-gly-lys-arg-glu-arg）直接做定點(diǎn)突變和分子修飾做不了，因此在基因水平對(duì)其進(jìn)行改造修飾，即利用生物信息學(xué)分析軟件將多肽對(duì)應(yīng)dna序列翻譯出，然后將dna序列中對(duì)應(yīng)的4號(hào)位亮氨酸的三個(gè)堿基突變?yōu)楫惲涟彼釋?duì)應(yīng)的三個(gè)堿基。具體步驟為突變前由酶解分離純化出的抗氧化多肽（序列為gly-ala-gly-leu-pro-gly-lys-arg-glu-arg）對(duì)應(yīng)的dna序列為5’-ggtgcgggtctgccgggcaaacgcgaacgt-3’，其中，序列中ctg密碼子對(duì)應(yīng)的就是亮氨酸，因此在基因序列上將ctg密碼子替換為異亮氨酸對(duì)應(yīng)的密碼子atc，就達(dá)到了定點(diǎn)突變改造肽鏈的結(jié)果，且突變后肽鏈序列轉(zhuǎn)變?yōu)間ly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg，對(duì)應(yīng)的dna序列為5’-ggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgt-3’。分子修飾技術(shù)改造方法：依據(jù)，由本實(shí)驗(yàn)室首次提出并驗(yàn)證關(guān)于肽鏈高級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)其抗氧化功能活性的影響理論。分子修飾方法步驟，首先通過(guò)生物信息學(xué)軟件設(shè)計(jì)出具有高級(jí)結(jié)構(gòu)的抗氧化肽，即將突變后的合浦珠母貝抗氧化肽（序列為gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg）設(shè)計(jì)出具有一定高級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽，序列為gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg-asn-gly-gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg-glu-arg-asn-gly-gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg-asn-gly-gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg-glu-arg-asn-gly-gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg；然后通過(guò)免費(fèi)在線蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析工具數(shù)據(jù)庫(kù)http://web.expasy.org/protscale/和http://web.expasy.org/protparam/和http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/中分析得到抗氧化肽一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)特征，并進(jìn)一步利用swiss-modelworkspace數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)肽鏈序列進(jìn)行同源建模分析得到其三級(jí)結(jié)構(gòu)特征。至此，分子修飾后多肽構(gòu)建完成，命名為mp。2.密碼子優(yōu)化：根據(jù)抗氧化肽（mp）的氨基酸序列g(shù)agipgkrernggagipgkrernggagipgkrernggagipgkrernggagipgkrer，按照構(gòu)建重組工程菌的原核表達(dá)宿主菌——大腸桿菌菌株de3的密碼子的偏好性，利用免費(fèi)在線密碼子優(yōu)化工具h(yuǎn)ttp://www.jcat.de優(yōu)化設(shè)計(jì)得到利于在宿主菌表達(dá)的基因密碼子序列，即mp對(duì)應(yīng)dna堿基序列：5’-ggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgt-3’，其中at含量為0.4，gc含量為0.6，另外，為了后期將該基因序列導(dǎo)入到表達(dá)載體中和最終誘導(dǎo)表達(dá)能及時(shí)終止翻譯保留肽鏈完整的c端活性，在該抗氧化肽（mp）兩端設(shè)計(jì)并加入的酶切位點(diǎn)分別為限制性內(nèi)切酶bamhi和xhoi，且在3’端插入xhoi酶切位點(diǎn)之前設(shè)計(jì)加入taa終止翻譯密碼子；設(shè)計(jì)完成后的基因全長(zhǎng)序列如下：5’-aatggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgttaactcgag-3’。3.構(gòu)建重組工程菌株：（1）酶切：將上一步mp目的基因亞克隆入改造載體pgex-his，利用限制性內(nèi)切酶bamhi和xhoi雙酶切目的基因mp、改造載體pgex-his：將mp目的基因用限制性內(nèi)切酶bamhi和xhoi按照20μl的酶切體系于37℃水浴酶切5h，酶切完成后取5μl酶切反應(yīng)液加入0.5μl的10×loadingbuffer在2.5%瓊脂糖膠濃度下驗(yàn)證是否酶切完全，若酶切完全，則按照invitrogene膠回收試劑盒回收雙酶切后的mp基因片段和改造載體pgex-his片段。（2）連接：然后將雙酶切后的pgex-his和mp按照20μl的連接體系于金屬浴中16℃連接16h，得連接液。（3）轉(zhuǎn)化：將連接液轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株de3感受態(tài)細(xì)胞中：取100μl大腸桿菌de3感受態(tài)細(xì)胞，冰浴解凍后輕輕震蕩，使細(xì)胞懸浮均勻。將10μl連接液加入感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min。42℃熱激90秒，然后迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中，靜置2分鐘。加入900μllb液體培養(yǎng)基，37℃、150rpm震蕩孵育1h，3000rpm離心1min，棄上清。取少量培養(yǎng)物均勻涂布于la-c（50μg/ml氨芐青霉素和34μg/ml氯霉素）固體培養(yǎng)基平板上。將平板倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)10-16h，觀察單菌落生長(zhǎng)情況。（4）鑒定：挑取培養(yǎng)后長(zhǎng)出的單菌落至裝有l(wèi)a-c液體培養(yǎng)基的2ml的ep管中，37℃、180rpm培養(yǎng)10h，做菌落pcr驗(yàn)證、雙酶切驗(yàn)證或測(cè)序驗(yàn)證，其中以測(cè)序驗(yàn)證為準(zhǔn)，驗(yàn)證結(jié)果表明本發(fā)明成功構(gòu)建了重組載體pgex-his-mp和重組工程菌株de3-pgex-his-mp。（5）誘導(dǎo)表達(dá)挑單菌落于100/500ml含有l(wèi)a-c液體培養(yǎng)基的錐形三角瓶中，于37℃、220rpm條件下培養(yǎng)至od600約0.8時(shí)，添加iptg誘導(dǎo)，使其終濃度為0.5mmol/l，繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)4h，此過(guò)程設(shè)置未添加iptg誘導(dǎo)劑作為陰性對(duì)照；4000rpm離心10min收集菌體，棄上清；菌體用500μlpbs（ph7.4）緩沖液懸浮，超聲破碎6min，超0.5s停1.5s，分別離心收集上清和沉淀，沉淀用500μl包涵體溶解液（8murea，50mmtris-hcl，150mmnacl，ph8.0）溶解，分別取40μl樣品和10μl5×proteinloadingbuffer混勻，沸水浴10min。sds-page檢測(cè)：準(zhǔn)備12%的sds-page，tris-gly電泳緩沖液（tris30g，甘氨酸144.0g，sds10g，定容至1l），上樣量10μl，濃縮膠80v20min，分離膠120v60min，凝膠電泳結(jié)束考染20min，脫色，拍照記錄，結(jié)果參見(jiàn)圖1，泳道4的蛋白條帶即為抗氧化肽mp理論分子量附近的目的蛋白條帶。對(duì)4號(hào)泳道中在抗氧化肽mp理論分子量附近的目的蛋白條帶，切膠消化并利用maldi-tof-ms對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果如下圖2所示。由質(zhì)譜結(jié)果其氨基酸序列與理論序列結(jié)果相符。收集經(jīng)驗(yàn)證正確的經(jīng)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出的含有目的蛋白的沉淀，于4℃保存。4.純化利用ni-nta親和層析，對(duì)制備的mp進(jìn)一步分離純化，獲得純品，進(jìn)行目的蛋白的驗(yàn)證，ni-nta親和層析純化步驟：(1)取25mlni-nta柱料，用10倍柱床體積的bindingbuffer清洗平衡柱子，流速5ml/min。(2)上柱，流速為2ml/min，收集穿透液。(3)10倍柱床體積的bindingbuffer清洗柱子，流速5ml/min。(4)elutionbuffer洗脫，流速2ml/min，收集洗脫液。其中，bindingbuffer（20mmtris-hcl,8murea,500mmnacl,5mmimidazole,ph8.0；elutionbuffer（20mmtris-hcl,8murea,500mmnacl,500mmimidazole,ph8.0。將收集到的組分進(jìn)行sds-page檢測(cè)，將驗(yàn)證正確的含有目的蛋白mp的樣品凍干保存?？寡趸芰Ψ治隹寡趸芰y(cè)定包括：dpph清除能力、超氧離子清除能力和羥自由基清除能力的ic50值見(jiàn)表１。清除能力的測(cè)定：將純化出的抗氧化肽純品溶液取0.5ml于干凈ep管中，依次加入0.5ml去離子水和1.0mldpph溶液（2×10-4mol/l，dpph溶于無(wú)水乙醇），渦旋振蕩2~4s混勻后在室溫下避光放置反應(yīng)30min，然后利用酶標(biāo)儀測(cè)定取出適量混合液在517nm處的吸光值，即為樣品組吸光值ai；在其它條件不變的情況下，與樣品組相比，將0.5ml去離子水代替0.5ml抗氧化肽純品溶液測(cè)得的吸光值即為對(duì)照組吸光值a0；同樣，在其它條件不變的情況下，與對(duì)照組相比，將1.0ml95%乙醇代替dpph溶液的1.0ml測(cè)得的吸光值即為空白組吸光值aj；與此同時(shí)，每個(gè)處理步驟設(shè)置三個(gè)平行，最后dpph清除率(%)的公式計(jì)算結(jié)果表示為：抗氧化肽·dpph清除率（%）＝[1－(ai－aj)/a0]×100式中：a0-對(duì)照組吸光值；ai-樣品組吸光值；aj-空白組吸光值。抗氧化肽dpph清除能力的ic50的確定：將上述抗氧化肽樣品用去離子水稀釋6個(gè)濃度梯度，并分別測(cè)其dpph清除率且每個(gè)梯度設(shè)置三個(gè)平行，然后以抗氧化肽濃度為橫坐標(biāo)dpph清除率為縱坐標(biāo)做趨勢(shì)線，最后利用趨勢(shì)線的方程計(jì)算得出清除能力為50%的抗氧化肽純度，即為抗氧化肽dpph清除能力的ic50。超氧陰離子清除能力的測(cè)定：將純化出的抗氧化肽純品溶液取0.2ml于干凈ep管中，加入5.0mltris-hcl溶液（ph8.2），渦旋振蕩2~4s混勻后在25℃水浴中保溫放置10min，然后取出反應(yīng)液并向其中加入0.2ml鄰苯三酚溶液（3×10-3mol/l），最后利用酶標(biāo)儀測(cè)定取出適量混合液在325nm處的吸光值（每30s讀數(shù)一次，5min后結(jié)束），即為樣品組吸光值ai，利用得到的數(shù)據(jù)作圖計(jì)算出樣品組鄰苯三酚自氧化速率(δa/min)為v樣品；在其它條件不變的情況下，與樣品組相比，將0.2ml去離子水代替0.2ml抗氧化肽純品溶液測(cè)得的吸光值即為對(duì)照組吸光值a0，同樣計(jì)算可得對(duì)照組鄰苯三酚自氧化速率(δa/min)為v對(duì)照；與此同時(shí)，每個(gè)處理步驟設(shè)置三個(gè)平行，最后樣品對(duì)超氧陰離子抑制率(%)的公式計(jì)算結(jié)果可以表示為：抗氧化肽超氧陰離子抑制率（%）＝[1－v樣品/v對(duì)照]×100%式中：v對(duì)照-對(duì)照組鄰苯三酚自氧化速率(δa/min)；v樣品-樣品組鄰苯三酚自氧化速率(δa/min)。抗氧化肽超氧陰離子抑制能力的ic50的確定：將上述抗氧化肽樣品用去離子水稀釋6個(gè)濃度梯度，并分別測(cè)其超氧陰離子抑制率且每個(gè)梯度設(shè)置三個(gè)平行，然后以抗氧化肽濃度為橫坐標(biāo)超氧陰離子抑制率為縱坐標(biāo)做趨勢(shì)線，最后利用趨勢(shì)線的方程計(jì)算得出抑制能力為50%的抗氧化肽純度，即為抗氧化肽超氧陰離子抑制能力的ic50值。3.還原力和·oh清除率的測(cè)定：將純化出的抗氧化肽純品溶液取1.5ml于干凈ep管中，依次加入0.5mlfeso4溶液、0.5ml水楊酸-乙醇（3×10-3mol/l，水楊酸溶于無(wú)水乙醇）和0.5mlh2o2溶液（3×10-3mol/l），渦旋振蕩2~4s混勻后在室溫下放置反應(yīng)30min，然后利用酶標(biāo)儀測(cè)定取出適量混合液在510nm處的吸光值，即為樣品組吸光值ai；在其它條件不變的情況下，與樣品組相比，將1.5ml去離子水代替1.5ml抗氧化肽純品溶液測(cè)得的吸光值即為對(duì)照組吸光值a0；同樣，在其它條件不變的情況下，與樣品組相比，將0.5ml去離子水代替水楊酸-乙醇的0.5ml測(cè)得的吸光值即為空白組吸光值aj；與此同時(shí)，每個(gè)處理步驟設(shè)置三個(gè)平行，最后·oh清除率(%)的公式計(jì)算結(jié)果表示為：抗氧化肽·oh清除率（%）＝[1－(ai－aj)/a0]×100式中：a0-對(duì)照組吸光值；ai-樣品組吸光值；aj-空白組吸光值?？寡趸摹h清除能力的ic50的確定：將上述抗氧化肽樣品用去離子水稀釋6個(gè)濃度梯度，并分別測(cè)其·oh清除率且每個(gè)梯度設(shè)置三個(gè)平行，然后以抗氧化肽濃度為橫坐標(biāo)dpph清除率為縱坐標(biāo)做趨勢(shì)線，最后利用趨勢(shì)線的方程計(jì)算得出清除能力為50%的抗氧化肽純度，即為抗氧化肽·oh清除能力的ic50值。表1珍珠貝肉抗氧化肽（序列為gly-ala-gly-leu-pro-gly-lys-arg-glu-arg）和本發(fā)明的抗氧化肽（mp）的抗氧化活性測(cè)定結(jié)果antioxidantdpph清除活性(ic50,mg/ml)超氧自由基清除活性(ic50,mg/ml)羥自由基清除活性(ic50,mg/ml)mp0.056±0.0050.310±0.0080.126±0.006珍珠貝肉抗氧化肽0.132±0.0051.046±0.030.268±0.045本發(fā)明可用其他的不違背本發(fā)明的精神或主要特征的具體形式來(lái)概述。凡是依據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何細(xì)微修改、等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。序列表<110>中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所<120>一種利用定點(diǎn)突變和分子修飾技術(shù)改造的珍珠貝肉抗氧化肽及其構(gòu)建和制備方法<160>3<210>1<211>62<212>prt<213>珍珠貝肉抗氧化肽<400>1glyalaglyileproglylysarggluargasnglyglyalagly151015ileproglylysarggluarggluargasnglyglyalaglyile202530proglylysarggluargasnglyglyalaglyileproglylys354045arggluarggluargasnglyglyalaglyileproglylysarg505560gluarg62<210>2<211>174<212>dna<213>珍珠貝肉抗氧化肽<400>2ggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgc60gaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatc120ccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgt174<210>3<211>189<212>dna<213>密碼子優(yōu)化珍珠貝肉抗氧化肽基因<400>3aatggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggc60aaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcg120ggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgt180taactcgag189當(dāng)前第1頁(yè)12