本發(fā)明涉及一種馬立克氏病毒的懸浮培養(yǎng)方法，屬于獸用生物制品
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：馬立克氏病(marek’sdisease，md)是由皰疹病毒科、細(xì)胞結(jié)合性馬立克氏病病毒(marek’sdiseasevirus，mdv)引起的一種高度接觸傳染性、淋巴組織增生性腫瘤疾病。1907年，匈牙利病理學(xué)家josephmarek首先報道此病。1970年隨著疫苗的使用，該病首次得以控制。直到目前，疫苗接種仍是預(yù)防m(xù)d最有效的方式之一，而使用疫苗近50年來，傳統(tǒng)疫苗的生產(chǎn)方式一直都是以原代雞胚成纖維細(xì)胞作為制苗材料，采用轉(zhuǎn)瓶的方式培養(yǎng)。但是傳統(tǒng)的馬立克氏病毒培養(yǎng)方法存在諸多缺陷：原代細(xì)胞制備費時費力、操作程序繁瑣、易污染外源病毒、十分依賴spf種胚的供應(yīng)、且疫苗產(chǎn)量及質(zhì)量不穩(wěn)定。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種馬立克氏病毒的懸浮培養(yǎng)方法，該方法用微載體結(jié)合懸浮的方式對馬立克氏病毒進(jìn)行培養(yǎng)，操作簡便，穩(wěn)定性強(qiáng)的特點，同時克服了傳統(tǒng)疫苗生產(chǎn)受制于雞胚的供應(yīng)的缺點，避免了感染外源病毒的風(fēng)險。實現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到：一種馬立克氏病毒的懸浮培養(yǎng)方法，包括以下步驟：1)雞胚源df-1細(xì)胞系的傳代與培養(yǎng)：以雞胚源df-1細(xì)胞系作為制備病毒用細(xì)胞；將雞胚源df-1細(xì)胞經(jīng)胰酶-edta細(xì)胞分散液消化成單個均勻細(xì)胞，然后置于細(xì)胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長成單層時，用于繼續(xù)傳代或接種病毒；2)細(xì)胞毒種的繁殖：用稀釋液將馬立克氏病毒種稀釋，將病毒和經(jīng)步驟1)處理的df-1細(xì)胞一起接入含細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞病變時收獲細(xì)胞毒作為毒種；3)制苗用病毒的吸附培養(yǎng)：將從步驟2)得到的毒種稀釋為病毒液，將病毒和新的雞胚源df-1細(xì)胞一起接入含有微載體和懸浮培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，進(jìn)行懸浮吸附培養(yǎng)；4)病毒的增殖培養(yǎng)及收獲：棄去懸浮培養(yǎng)液，加入病毒增殖培養(yǎng)液進(jìn)行懸浮增殖培養(yǎng)；當(dāng)接入的細(xì)胞病變率達(dá)80％以上時，收獲病毒液并保存。作為優(yōu)選，馬立克氏病毒為馬立克氏病血清ⅰ型cvi988/rispens株、814株、血清ⅱ型sb-1株、血清ⅲ型火雞皰疹病毒fc-126株中的至少一種。作為優(yōu)選，步驟2)中，接種病毒的感染復(fù)數(shù)為0.001-1。作為優(yōu)選，步驟3)中，懸浮培養(yǎng)液為含體積百分比5-10％新生牛血清的dmem/f12培養(yǎng)基。作為優(yōu)選，步驟3)中，培養(yǎng)瓶中的微載體和細(xì)胞的個數(shù)之比為1:50～250。作為優(yōu)選，步驟3)中，微載體的濃度為1-5g/l。作為優(yōu)選，步驟3)中，懸浮吸附培養(yǎng)的時間為12-48h；培養(yǎng)溫度為36～38℃。作為優(yōu)選，步驟4)中，病毒增殖培養(yǎng)液為含體積百分比2％新生牛血清的dmem/f12培養(yǎng)基。作為優(yōu)選，步驟4)中，懸浮增殖培養(yǎng)的時間為24-72h；培養(yǎng)溫度為36～38℃。作為優(yōu)選，步驟3)和步驟4)中，在培養(yǎng)的過程中對培養(yǎng)液進(jìn)行攪拌；攪拌的方式為間歇攪拌或連續(xù)攪拌；攪拌速度為20-50rpm。相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明結(jié)合了馬立克氏病毒和df-1細(xì)胞的生物學(xué)特性，利用微載體懸浮培養(yǎng)馬立克氏病毒，培養(yǎng)密度高，不影響細(xì)胞質(zhì)量；不僅能夠解決傳統(tǒng)馬立克氏病毒培養(yǎng)依賴spf種胚的供應(yīng)、原代細(xì)胞制備費時費力、操作程序繁瑣、易污染外源病毒的問題，同時也能對病毒培養(yǎng)實時監(jiān)控，節(jié)省人力，生產(chǎn)用地少，成本低，并且與商品疫苗相比，用此方法培養(yǎng)的馬立克氏病毒疫苗對馬立克氏病強(qiáng)毒株、超強(qiáng)毒株的攻擊具有同等效力的免疫保護(hù)作用。具體實施方式下面，結(jié)合具體實施方式，對本發(fā)明做進(jìn)一步描述：一種馬立克氏病毒的懸浮培養(yǎng)方法，包括以下步驟：1)雞胚源df-1細(xì)胞系的傳代與培養(yǎng)：以雞胚源df-1細(xì)胞系作為制備病毒用細(xì)胞；將雞胚源df-1細(xì)胞經(jīng)胰酶-edta細(xì)胞分散液消化成單個均勻細(xì)胞，然后置于細(xì)胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長成單層時，用于繼續(xù)傳代或接種病毒；2)細(xì)胞毒種的繁殖：用稀釋液將馬立克氏病毒種稀釋，以感染復(fù)數(shù)為0.001-1將病毒和經(jīng)步驟1)處理的df-1細(xì)胞一起接入含細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞病變時收獲細(xì)胞毒作為毒種；在此感染復(fù)數(shù)范圍內(nèi)，既能保證病毒復(fù)制的滴度，同時不至于因為病毒接種量太高而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生病變的時間提前，造成細(xì)胞過快的產(chǎn)生病變導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；3)制苗用病毒的吸附培養(yǎng)：將從步驟2)得到的毒種稀釋為病毒液，將病毒和新的雞胚源df-1細(xì)胞一起接入含有微載體和懸浮培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，進(jìn)行懸浮吸附培養(yǎng)；微載體優(yōu)選采用cytodex系列微載體；該系列微載體相比現(xiàn)有的其他微載體，能夠提供更大的細(xì)胞培養(yǎng)面積，保證細(xì)胞的密度及病毒收獲的蝕斑數(shù)，從而節(jié)約成本，提高病毒滴度；cytodex系列微載體以交聯(lián)葡聚糖作為基質(zhì)，具有細(xì)胞貼壁快，生長快等特點，同時能提供較大的細(xì)胞貼壁面積；尤其是cytodex1微載體，每克干重能夠提供4400cm2的細(xì)胞貼壁面積，相對于以聚酯材料和聚苯乙烯為基質(zhì)的紙片載體(每克干重提供1600cm2細(xì)胞貼壁面積)及bionoc-ii聚酯纖維載體(每克干重提供2400cm2細(xì)胞貼壁面積)具有明顯的優(yōu)勢。同時，cytodex系列微載體因體積小，在攪拌式培養(yǎng)瓶中能夠充分懸浮于培養(yǎng)液中，使細(xì)胞充分和培養(yǎng)液接觸，最大程度地提高了培養(yǎng)液的利用率，而且方便隨時取樣進(jìn)行觀察，以便于對培養(yǎng)過程進(jìn)行實時監(jiān)控，掌握培養(yǎng)進(jìn)程。4)病毒的增殖培養(yǎng)及收獲：棄去懸浮培養(yǎng)液，加入病毒增殖培養(yǎng)液進(jìn)行懸浮增殖培養(yǎng)；當(dāng)接入的細(xì)胞病變率達(dá)80％以上時，收獲病毒液并保存。其中，馬立克氏病毒為馬立克氏病血清ⅰ型cvi988/rispens株、814株、血清ⅱ型sb-1株、血清ⅲ型火雞皰疹病毒fc-126株中的至少一種。其中，步驟3)中，懸浮培養(yǎng)液為含體積百分比5-10％新生牛血清的dmem/f12培養(yǎng)基；培養(yǎng)瓶中的微載體和細(xì)胞的個數(shù)之比為1:50～250，微載體的濃度為1-5g/l；懸浮吸附培養(yǎng)的時間為12-48h；培養(yǎng)溫度為36～38℃；在懸浮吸附培養(yǎng)的時間中，細(xì)胞能夠充分吸附于微載體，并且避免了培養(yǎng)時間過長而使得新生牛血清對細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響；微載體和細(xì)胞的個數(shù)之比1:50～250能夠保證細(xì)胞能在微載體表面形成致密的細(xì)胞單層，從而有利于馬立克氏病毒的復(fù)制；微載體的濃度為1-5g/l是本發(fā)明中馬立克氏病毒培養(yǎng)的最佳條件，微載體濃度過高會增加細(xì)胞間的剪切力，造成細(xì)胞損傷，不利于病毒培養(yǎng)。其中，步驟4)中，步驟4)中，病毒增殖培養(yǎng)液為含體積百分比2％新生牛血清的dmem/f12培養(yǎng)基；懸浮增殖培養(yǎng)的時間為24-72h；培養(yǎng)溫度為36～38℃；病毒增殖培養(yǎng)時間的控制能夠提高病毒的滴度。其中，步驟3)和4)中所用的培養(yǎng)瓶采用瑞士integra公司生產(chǎn)的spinnerflask，瓶中設(shè)有帶有兩個磁力攪拌槳，并且對磁力攪拌槳的大小，形狀及高度進(jìn)行了優(yōu)化，獨特的設(shè)計可按要求提供平穩(wěn)、均勻的轉(zhuǎn)動，可提高氧氣供應(yīng)及最小化的剪切力以確保理想的細(xì)胞生長條件。通過攪拌槳來攪動培養(yǎng)液，以增加質(zhì)傳效果，確保培養(yǎng)液的養(yǎng)分和溶氧濃度的均勻分布，到達(dá)細(xì)胞良好培養(yǎng)的目的；優(yōu)選的方式為設(shè)定攪拌速度20-50rpm，在此速度下，能保證細(xì)胞在最低剪切力下充分均勻的懸浮；剪切力太大，容易造成細(xì)胞損傷，不利于病毒增殖；轉(zhuǎn)速太低則細(xì)胞容易沉底，無法充分均勻懸浮，導(dǎo)致培養(yǎng)液利用率下降，同時會造成細(xì)胞聚集，不利于病毒復(fù)制。實施例1-2：不使用微載體的懸浮培養(yǎng)過程實施例1：常規(guī)接毒組1)雞胚源df-1細(xì)胞系的傳代與培養(yǎng)：以雞胚源df-1細(xì)胞系作為制備病毒用細(xì)胞；將雞胚源df-1細(xì)胞經(jīng)0.25％胰酶-edta細(xì)胞分散液消化成單個均勻細(xì)胞，以1:3-6的比例進(jìn)行傳代，然后置于含體積百分?jǐn)?shù)10％新生牛血清的dmem/f12細(xì)胞生長液中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃；當(dāng)細(xì)胞長成單層時，用于繼續(xù)傳代或接種病毒；2)馬立克氏病毒的繁殖：用稀釋液將cvi988/rispens病毒種稀釋，接種至步驟1)中長至單層的df-1細(xì)胞上，接種量為7×104pfu/t25細(xì)胞培養(yǎng)瓶；加入含體積百分?jǐn)?shù)2％新生牛血清的dmem/f12細(xì)胞維持液后，在溫度為37℃的條件下培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變；3)病毒的收獲：當(dāng)接入的細(xì)胞病變率達(dá)80％以上時，棄去細(xì)胞維持液，加入0.25％胰酶-edta消化液，使其與細(xì)胞充分接觸后棄去，然后加入血清終止消化，并用培養(yǎng)基吹打使細(xì)胞分散均勻，經(jīng)800rpm離心10min，收集沉淀細(xì)胞，得到病毒；4)保存：將病毒分別用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，加入等體積凍存液分裝凍存管，置于程序降溫盒中，達(dá)到-70℃后，放入液氮中保存。實施例2：同步接毒組實施例2的特點在于，步驟2)馬立克氏病毒的繁殖：將步驟1)中的df-1單層細(xì)胞消化成單個均勻細(xì)胞，并且同時和稀釋后的cvi988/rispens病毒接種至t25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，接種量為7×104pfu/培養(yǎng)瓶；用含體積百分比10％新生牛血清的dmem/f12培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，換成含體積百分比2％新生牛血清的dmem/f12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，其余步驟和參數(shù)與實施例1相同。對實施例1和2進(jìn)行檢測：1、病毒蝕斑檢測：按常規(guī)方法制備次代的雞胚成纖維細(xì)胞，接種于96孔板繼續(xù)培養(yǎng)24h備用。將凍存于液氮中的病毒進(jìn)行復(fù)蘇，37℃水浴速融后倍比稀釋接種至96孔板，每孔0.1ml，設(shè)置8個平行重復(fù)。觀察細(xì)胞病變率，計算出病毒蝕斑數(shù)。2、抽樣檢驗：按《中華人民共和國獸藥典(三部)》(2015年版)中“雞馬立克氏病活疫苗(cvi988/rispens株)”的檢驗標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗。3、結(jié)果：按《中華人民共和國獸藥典(三部)》(2015年版)中“雞馬立克氏病活疫苗(cvi988/rispens株)”的檢驗標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗，兩組凍存的馬立克氏病毒均無細(xì)菌、支原體、雞貧血病毒及其他外源病毒污染，安全性和免疫原性均符合要求。分別復(fù)蘇兩組凍存的病毒液，對其蝕斑量進(jìn)行測定，結(jié)果如表格1所示：表格1實施例1和2的病毒收獲量測定結(jié)果組別病毒接種量病毒收獲量實施例17×104pfu/瓶12.8×105pfu/瓶實施例27×104pfu/瓶20.48×105pfu/瓶從表中可以看出，兩種接毒方式，接種等量的病毒，培養(yǎng)相同時間后收獲，進(jìn)行蝕斑定量，發(fā)現(xiàn)馬立克氏病毒均能在雞胚源df-1細(xì)胞系中復(fù)制增殖，形成細(xì)胞病變，且同步接毒的方式比常規(guī)接毒的方法所收獲的病毒量更多，因此選用雞胚源df-1細(xì)胞系作為馬立克氏病病毒制苗細(xì)胞是具有可行性的。實施例3-4：不同接毒方式對微載體懸浮培養(yǎng)馬立克氏病毒的研究實施例3-4中采用的培養(yǎng)瓶為spinnerflask，瑞士integra公司生產(chǎn)，工作體積250ml，帶有兩個磁力攪拌槳。采用的微載體為ge公司生產(chǎn)的cytodex1微載體，1g微載體(干重)含4.26×106個微載體并且能夠提供4400cm2的細(xì)胞生長面積。微載體的預(yù)處理：分別稱量100mgcytodex1微載體，放入上述spinnerflask中，加入無ca2+、mg2+的pbs緩沖液浸泡過夜，洗滌三次后，121℃高壓滅菌30min，使用前棄去pbs，并加入含體積百分?jǐn)?shù)10％新生牛血清的dmem/f12細(xì)胞生長液進(jìn)行孵育。實施例3：常規(guī)接毒組1)雞胚源df-1細(xì)胞系的傳代與培養(yǎng)：以雞胚源df-1細(xì)胞系作為制備病毒用細(xì)胞；將雞胚源df-1細(xì)胞經(jīng)0.25％胰酶-edta細(xì)胞分散液消化成單個均勻細(xì)胞，接種于spinnerflask中的微載體上繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃；當(dāng)細(xì)胞長成單層時，取樣進(jìn)行計數(shù)；2)馬立克氏病毒的繁殖：將spinnerflask中的細(xì)胞培養(yǎng)液棄去，加入含體積百分?jǐn)?shù)2％新生牛血清的dmem/f12細(xì)胞維持液；將病毒接種至步驟1)處理的單層細(xì)胞上；加入后，在條件為5％co2、37℃的條件下懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)時進(jìn)行攪拌：12h內(nèi)攪拌速度為20rpm，之后調(diào)成30rpm，每天觀察病變情況；4)病毒的收獲：當(dāng)接入的細(xì)胞病變率達(dá)80％以上時，收獲病毒并保存。實施例4：同步接毒組實施例4的特點在于，雞胚源df-1細(xì)胞經(jīng)消化成單個均勻細(xì)胞后，按實施例3細(xì)胞長滿單層時的細(xì)胞數(shù)接種雞胚源df-1細(xì)胞于spinnerflask中的微載體上，同時接入病毒，并加入含體積百分?jǐn)?shù)10％新生牛血清的dmem/f12細(xì)胞生長液至100ml，在5％co2、37℃的條件下懸浮培養(yǎng)24h；培養(yǎng)時進(jìn)行攪拌：12h內(nèi)攪拌速度為20rpm，之后調(diào)成30rpm；然后棄去細(xì)胞生長液，加入含體積百分?jǐn)?shù)2％新生牛血清的dmem/f12細(xì)胞維持液在5％co2、37℃的條件下進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，攪拌速度為30rpm，每天觀察病變情況。其余步驟和參數(shù)與實施例1相同。對實施例3-4進(jìn)行檢測，結(jié)果如表格2所示：表格2實施例3和4的病毒收獲量測定結(jié)果組別病毒接種量病毒收獲量實施例32.0×106pfu/瓶20.48×106pfu/瓶實施例42.0×106pfu/瓶25.6×106pfu/瓶從表中可以看出，利用微載體懸浮系統(tǒng)培養(yǎng)馬立克氏病毒，馬立克氏病毒同樣能在雞胚源性df-1細(xì)胞系中復(fù)制增殖，形成細(xì)胞病變。其中，同步接毒的方式比常規(guī)接毒的方法所收獲的病毒量更多，因此采用同步接毒的方式懸浮培養(yǎng)馬立克氏病毒比常規(guī)的接毒方式效果要好。實施例5：不同細(xì)胞接種量對微載體懸浮培養(yǎng)馬立克氏病毒的研究實施例5中的spinnerflask，微載體及其處理、雞胚源df-1細(xì)胞系的傳代與培養(yǎng)同實施例3-4。1)馬立克氏病毒的繁殖：微載體濃度為1g/l，將spinnerflask中的pbs棄去，備4個spinnerflask，分別編號為1-4，分別按微載體和細(xì)胞的個數(shù)之比1:100/1:150/1:200/1:250進(jìn)行接種，同時接入cvi988/rispens病毒液2.0×106pfu/瓶，并加入含體積百分?jǐn)?shù)10％新生牛血清的dmem/f12細(xì)胞生長液至100ml，在5％co2、37℃的條件下懸浮培養(yǎng)24h；培養(yǎng)時進(jìn)行攪拌：12h內(nèi)攪拌速度為20rpm，之后調(diào)成30rpm；然后棄去細(xì)胞生長液，加入含體積百分?jǐn)?shù)2％新生牛血清的dmem/f12細(xì)胞維持液在5％co2、37℃的條件下進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，攪拌速度為30rpm，每天觀察病變情況。2)病毒的收獲：當(dāng)接入的細(xì)胞病變率達(dá)80％以上時，收獲病毒液并保存。對實施例5進(jìn)行檢測，結(jié)果如表格3所示：表格3實施例5的病毒收獲量測定結(jié)果從表中可以看出，不同的細(xì)胞接種量會影響病毒滴度，當(dāng)按每個微載體100個df-1細(xì)胞接種時，病毒收獲量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于按150、200、250個df-1細(xì)胞接種的組別，而按150、200、250個df-1細(xì)胞接種的組別收獲的病毒量差別不大，實驗時發(fā)現(xiàn)當(dāng)按每個微載體250個df-1細(xì)胞接種時，會有大量的細(xì)胞處于游離狀態(tài)，沒有更多的表面積供其貼附，因此實際操作中應(yīng)該按每個微載體150-200個df-1細(xì)胞接種為宜。實施例6：不同微載體濃度對微載體懸浮培養(yǎng)馬立克氏病毒的研究備3個spinnerflask，分別編號為5-7，分別稱量100、250、500mgcytodex1微載體，放入spinnerflask5-7中，加入無ca2+、mg2+的pbs緩沖液浸泡過夜，洗滌三次后，121℃高壓滅菌30min，待用。1)馬立克氏病毒的繁殖：將spinnerflask中的pbs棄去，分別按微載體和細(xì)胞的個數(shù)之比1:200進(jìn)行接種，同時按表格4的接種量接入cvi988/rispens病毒液，并加入含體積百分?jǐn)?shù)10％新生牛血清的dmem/f12細(xì)胞生長液至100ml，在5％co2、37℃的條件下懸浮培養(yǎng)24h；培養(yǎng)時進(jìn)行攪拌：12h內(nèi)攪拌速度為20rpm，之后調(diào)成30rpm；然后棄去細(xì)胞生長液，加入含體積百分?jǐn)?shù)2％新生牛血清的dmem/f12細(xì)胞維持液在5％co2、37℃的條件下進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，攪拌速度為30rpm，每天觀察病變情況。2)病毒的收獲：當(dāng)接入的細(xì)胞病變率達(dá)80％以上時，收獲病毒液并保存。對實施例6進(jìn)行檢測，結(jié)果如表格4所示：表格4實施例6的病毒收獲量測定結(jié)果從表中可以看出，隨著微載體濃度的增大，病毒的收獲總量增大，但是也沒有按照比例增加，可能是由于隨著微載體濃度的增加，微載體之間碰撞幾率增加，剪切力增加，同時微載體濃度越大，細(xì)胞越多，對于培養(yǎng)條件的要求也更嚴(yán)苛。因此，隨著微載體濃度的增大，病毒收獲的總量比低濃度微載體培養(yǎng)時更多，但并沒有按照比例增加。實施例7：不同培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)馬立克氏病毒的比較將采用雞胚源df-1細(xì)胞懸浮培養(yǎng)馬立克氏病毒(實施例6的7號瓶)和利用cef在t225方瓶中培養(yǎng)馬立克氏病毒進(jìn)行比較。利用cef細(xì)胞在t225細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)馬立克氏病毒的步驟：采用常規(guī)方法制備雞胚成纖維細(xì)胞，按1.8×106cells/ml接種至t225細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入細(xì)胞生長液50ml；置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h至長滿良好單層，棄去舊培養(yǎng)液，按照雞胚源df-1細(xì)胞懸浮培養(yǎng)相同的病毒細(xì)胞比例接種cvi988/rispens病毒，補(bǔ)加細(xì)胞維持液至50ml，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)接入的細(xì)胞病變率達(dá)80％以上時，收獲病毒液并保存。將兩者進(jìn)行比較，結(jié)果如表格5所示：表格5不同培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)馬立克氏病毒的比較本實施例中，spinnerflask的培養(yǎng)體積為100ml，添加微載體500mg，其中1g微載體能提供4400cm2的細(xì)胞貼壁面積，若要達(dá)到和spinnerflask相同的貼壁面積則需要10個t225細(xì)胞培養(yǎng)瓶，而且利用df-1微載體懸浮培養(yǎng)馬立克氏病毒與采用cef細(xì)胞在t225細(xì)胞培養(yǎng)瓶中收獲的量相當(dāng)。采用微載體懸浮培養(yǎng)馬立克氏病毒操作簡便，穩(wěn)定性強(qiáng)，不僅能夠消除常規(guī)疫苗生產(chǎn)中存在的生物安全隱患，同時用傳代細(xì)胞系代替原代雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)馬立克氏病毒，還能克服傳統(tǒng)疫苗生產(chǎn)受制于雞胚的供應(yīng)的缺點，也避免了感染外源病毒的風(fēng)險。當(dāng)然，在規(guī)?；a(chǎn)當(dāng)中，懸浮培養(yǎng)的體積遠(yuǎn)不止100ml，隨著懸浮培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步，現(xiàn)在懸浮培養(yǎng)已經(jīng)達(dá)到了幾十，幾百甚至幾千升的培養(yǎng)規(guī)模，因此本發(fā)明也為大規(guī)模培養(yǎng)馬立克氏病毒的技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各種相應(yīng)的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12