本發(fā)明涉及一種改造的木質(zhì)纖維素酶及其應(yīng)用，特別涉及包含編碼所述改造纖維素酶的核酸序列的基因構(gòu)建體，從宿主菌株中生產(chǎn)所述改造纖維素酶的方法和用所述改造的纖維素酶在木質(zhì)素存在的條件下對(duì)纖維素水解的方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
纖維素是陸地上最主要的光和作用產(chǎn)物，因其具有儲(chǔ)藏量大、生產(chǎn)周期短、綠色無污染等特點(diǎn)，降解纖維素獲得生物燃料替換日益枯竭的化石原料備受人們的青睞。木質(zhì)纖維素的降解分為酸降解和纖維素酶降解：自二戰(zhàn)至今，酸降解法被證明糖得率低，成本高，設(shè)備投資大；而纖維素酶降解法由于潛在成本低，環(huán)境友好，糖得率高，被研究者廣泛關(guān)注。木質(zhì)纖維素干重的90％是以纖維素、半纖維素、木質(zhì)素以及果膠的形式存在的(jensen,etal.,2008；
為了降低木質(zhì)素的抑制作用，往往通過蒸汽爆破、氨處理、酸處理或者有機(jī)溶劑處理木質(zhì)纖維素等方法降低木質(zhì)素含量或者使得纖維素表面暴露以提高木質(zhì)纖維素的水解效率。這些物理或者化學(xué)處理方法能夠很好的提高木質(zhì)素纖維的降解效率，然而由于木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，往往很難將木質(zhì)素清除干凈，預(yù)處理后殘留的木質(zhì)素仍然對(duì)木質(zhì)纖維素的降解產(chǎn)生一定影響。
纖維素酶屬于糖苷水解酶，糖苷水解酶往往采取不同模塊的組合形式來提高對(duì)這些大物質(zhì)分子的降解能力。一般來說，糖苷水解酶包含一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域、一個(gè)或者幾個(gè)串聯(lián)的碳水化合物結(jié)合區(qū)以及將二者相連的連接區(qū)。碳水化合物結(jié)合區(qū)是獨(dú)立存在于酶蛋白的區(qū)域，他們能夠使其所在的蛋白質(zhì)接近、結(jié)合并富集于作用的底物，對(duì)促進(jìn)碳水化合物降解酶的降解活性具有重要作用。真菌纖維素酶的碳水化合物結(jié)合區(qū)氨基酸序列相似度非常高，有些位點(diǎn)的氨基酸高度保守，例如形成平滑面的三個(gè)芳香族氨基酸、29位的天冬酰胺及34位的谷氨酰胺等(linderetal.,1995)。碳水化合物結(jié)合區(qū)中的芳香類氨基酸(酪氨酸和色氨酸)形成光滑的疏水面與碳水化合物中的吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)通過疏水作用相互結(jié)合(simpsonetal.,2000)。研究表明，除了三個(gè)芳香族氨基酸外，極性氨基酸，例如q7、n29和q34等同樣參與了疏水面的形成(fukudaetal.,2006；beckhametal.,2010)。同時(shí)，極性氨基酸產(chǎn)生的氫鍵作用同樣在結(jié)合中發(fā)揮作用(hildenandjohansson,2004)，并且這些極性氨基酸位點(diǎn)的突變可能會(huì)影響疏水面的形成，降低纖維素酶與纖維素的結(jié)合活性，從而降低了纖維素酶活性。strobel(2015)等利用研究表明，當(dāng)碳水化合物結(jié)合區(qū)平滑面中的芳香族氨基酸或者極性氨基酸突變?yōu)楸彼岷?，里氏木霉cbhi對(duì)纖維素和木質(zhì)素的親和力同時(shí)降低；同時(shí)他們指出，除個(gè)別氨基酸外，碳水化合物結(jié)合區(qū)點(diǎn)突變對(duì)纖維素及木質(zhì)素的吸附能力變化高度的一致。
然而，碳水化合物結(jié)合區(qū)除了能夠識(shí)別、吸附纖維素鏈之外，還能夠與木質(zhì)素非特異性的吸附，并且木質(zhì)素與碳水化合物結(jié)合區(qū)的吸附性非常強(qiáng)。因此如何降低纖維素酶與木質(zhì)素的非特性吸附對(duì)提高纖維素酶降解活性、降低燃料乙醇生產(chǎn)成本具有重要意義。通常來說，木質(zhì)素表面攜帶有大量的負(fù)電荷。lan(2013)等的研究表明，ph對(duì)纖維素酶水解木質(zhì)纖維素產(chǎn)生影響，較高的ph(5.2-6.2)條件下木質(zhì)纖維素的水解效率高于ph在4.8或者5.0時(shí)。高ph時(shí)的水解效率，木質(zhì)素表面攜帶的負(fù)電荷增加，同時(shí)親水性提高，這降低了纖維素酶與木質(zhì)素的非特異性的吸附作用。提高反應(yīng)體系的ph值時(shí)，由于纖維素酶的pi較低，其表面所攜帶的負(fù)電荷增加，因此纖維素酶與木質(zhì)素之間的電荷相斥作用增強(qiáng)，同樣使得纖維素酶與木質(zhì)素非特異性吸附降低(louetal.,2013)。同時(shí)有報(bào)道表明(strobeletal.,2016)，增加碳水化合物結(jié)合區(qū)區(qū)負(fù)電荷突變時(shí)，碳水化合物結(jié)合區(qū)對(duì)木質(zhì)素的吸附降低。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種改造的木質(zhì)纖維素酶及其應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
一種改造的木質(zhì)纖維素酶，在碳水化合物結(jié)合區(qū)進(jìn)行如下改造：
碳水化合物結(jié)合區(qū)第14位的絲氨酸替換為天冬氨酸；或者，碳水化合物結(jié)合區(qū)第21位的絲氨酸替換為天冬氨酸；或者碳水化合物結(jié)合區(qū)第24位的蘇氨酸替換為天冬氨酸；或者碳水化合物結(jié)合區(qū)第14位的絲氨酸以及第21位的絲氨酸同時(shí)替換為天冬氨酸；或者碳水化合物結(jié)合區(qū)第14位的絲氨酸、第21位的絲氨酸以及第24位的蘇氨酸同時(shí)替換為天冬氨酸；
所述的碳水化合物結(jié)合區(qū)屬于糖水化合物結(jié)合區(qū)第一家族，與來自木霉屬(trichodermasp.)、曲霉屬(aspergillussp.)、青霉屬(penicilliumsp.)、肉座菌屬(hypocreasp.)、腐質(zhì)霉屬(humicolasp.)、支頂孢屬(acremoniumsp.)、裸節(jié)菌屬(talaromycessp.)或者脈孢菌屬(neurosporasp.)的cel5a、cel6a、cel7a、cel7b纖維素酶、碳水化合物酯酶或者木聚糖酶的碳水化合物結(jié)合區(qū)具有高于70％的同源性。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述碳水化合物結(jié)合區(qū)的氨基酸序列如seqidno.1所示。所述碳水化合物結(jié)合區(qū)的表達(dá)基因核苷酸序列如seqidno.13所示。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述碳水化合物結(jié)合區(qū)第14位的絲氨酸替換為天冬氨酸，氨基酸序列如seqidno.2所示。
進(jìn)一步優(yōu)選的，所述改造的木質(zhì)纖維素酶氨基酸序列如seqidno.8所示。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述碳水化合物結(jié)合區(qū)第21位的絲氨酸替換為天冬氨酸，氨基酸序列如seqidno.3所示。
進(jìn)一步優(yōu)選的，所述改造的木質(zhì)纖維素酶氨基酸序列如seqidno.9所示。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述碳水化合物結(jié)合區(qū)第24位的蘇氨酸替換為天冬氨酸，氨基酸序列如seqidno.4所示。
進(jìn)一步優(yōu)選的，所述改造的木質(zhì)纖維素酶氨基酸序列如seqidno.10。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述碳水化合物結(jié)合區(qū)第14位的絲氨酸以及第21位的絲氨酸同時(shí)替換為天冬氨酸，氨基酸序列如seqidno.5所示。
進(jìn)一步優(yōu)選的，所述改造的木質(zhì)纖維素酶氨基酸序列如seqidno.11所示。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述碳水化合物結(jié)合區(qū)第14位的絲氨酸、第21位的絲氨酸以及第24位的蘇氨酸同時(shí)替換為天冬氨酸，氨基酸序列如seqidno.6所示。
進(jìn)一步優(yōu)選的，所述改造的木質(zhì)纖維素酶氨基酸序列如12所示。
上述改造的木質(zhì)纖維素酶在木質(zhì)素存在的條件下水解纖維素的應(yīng)用。
改造原理
本發(fā)明所述改造后的碳水化合物結(jié)合區(qū)能夠使得木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的抑制作用降低，從而增加了在木質(zhì)素存在條件下的纖維素水解活性。具體地，本發(fā)明涉及包含碳水化合物結(jié)合區(qū)的纖維素酶，所述改造碳水化合物結(jié)合區(qū)能夠與催化結(jié)構(gòu)域通過連接區(qū)進(jìn)行可操作地連接，所述改造的碳水化合物結(jié)合區(qū)的長度約為40個(gè)氨基酸，包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替換。所述氨基酸的替換導(dǎo)致相對(duì)于衍生出所述改造碳水化合物結(jié)合區(qū)的親本碳水化合物，具有使碳水化合物結(jié)合區(qū)的理論等電點(diǎn)下降，并且/或者使所述碳水化合物結(jié)合區(qū)的表面負(fù)電荷增加，并且/或者使所述碳水化合物中的天冬氨酸含量增加；所述氨基酸的替換是通過用酸性氨基酸天冬氨酸替換衍生出所述改造碳水化合物結(jié)合區(qū)的親本碳水化合物結(jié)合區(qū)的絲氨酸和/或蘇氨酸。所述氨基酸替換導(dǎo)致所述碳水化合物結(jié)合區(qū)的理論等電點(diǎn)下降至少1.3單位并且/或者使所述碳水化合物結(jié)合區(qū)中的天冬氨酸比例提高了至少27％。
有益效果
1、本發(fā)明所述改造的碳水化合物結(jié)合區(qū)使得與包含親本碳水化合物結(jié)合區(qū)的親本纖維素酶相比，水解活性提高，親本碳水化合物結(jié)合區(qū)可操作地通過連接區(qū)與所述纖維素酶中存在的相同的纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域相連；
2、本發(fā)明所所述改造的碳水化合物結(jié)合區(qū)可使得與親本纖維素酶相比，在木質(zhì)素存在的條件下纖維素水解活性提高至少約14％，這種在木質(zhì)素存在條件下的纖維素酶活性升高對(duì)從木質(zhì)纖維素底物生產(chǎn)可發(fā)酵糖、醇或糖醇例如從纖維素生產(chǎn)乙醇的工業(yè)具有潛在價(jià)值。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。
菌種來源
里氏木霉(trichodermareesei)qm6a或其變異菌種為原始菌，來源于美國模式培養(yǎng)物集存庫(atcc)，菌種保藏號(hào)atcc13631。
e.colistraingb05-dir，克隆載體pug6和psilent-1均購自山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。
β-葡萄糖苷酶根據(jù)wang等,2015,aweibullstatistics‐basedlignocellulosesaccharificationmodelandabuilt‐inparameteraccuratelypredictlignocellulosehydrolysisperformance.biotechnologyjournal,10(9):1424-1433的方法獲得。
大腸桿菌trans5α和transbl21(de3)以及表達(dá)載體pet-22b均購自北京全式金公司；
實(shí)施例1描述了在以下實(shí)施例中所用到的菌種及載體，實(shí)施例2～6詳細(xì)的描述了本發(fā)明中改造的里氏木霉cel7a突變體及其純化的過程，實(shí)施例7、8詳細(xì)的描述了在實(shí)施過程中使用的β-葡萄糖苷酶的表達(dá)與純化，實(shí)施例9描述了酸不溶性木質(zhì)素的制備過程，實(shí)施例10描述了經(jīng)過本發(fā)明改造后的cel7a突變體水解活性的提高。
實(shí)施例1里氏木霉纖維二糖水解酶i(cel7a)編碼基因在載體pug6中的克隆
cel7a編碼基因及其上下游片段經(jīng)pcr的方法在里氏木霉qm6a中克隆獲得；引物序列如下：
f1:gcaaatggtacgtacggacagttcaggccgcggatctgccggtctcccta
r1:tgcggttgtgcgaccttcagctctggcgttctatagtgtcacctaaatcg
pcr反應(yīng)在50μl體系中進(jìn)行：
2×pcrbuffer25μl，2mmdntps10μl，引物f11.5μl，引物r11.5μl，模板dna1μl，kodfx聚合酶1μl，加純水補(bǔ)足到50μl。
pcr反應(yīng)程序如下：
94℃預(yù)變性2min；98℃變性10s，69℃退火30s，68℃延伸90s，30個(gè)循環(huán)；68℃延伸10min。
潮霉素抗性基因，引物序列如下：
f2:cgatttaggtgacactatagaacgccagagctgaaggtcgcacaaccgca
r2:atcgatccggtcggcatctactctattacaggcactgagagtagtaaggg
pcr反應(yīng)在50μl體系中進(jìn)行：
2×pcrbuffer25μl，2mmdntps10μl，引物f21.5μl，引物r21.5μl，模板dna1μl，kodfx聚合酶1μl，加純水補(bǔ)足到50μl。
pcr反應(yīng)程序如下：
94℃預(yù)變性2min；98℃變性10s，67℃退火30s，68℃延伸90s，30個(gè)循環(huán)；68℃延伸10min。
pgpd/tter經(jīng)pcr的方法從載體psilent中克隆獲得，引物序列如下：
f3:cccttactactctcagtgcctgtaatagagtagatgccgaccggatcgat
r3:tagggagaccggcagatccgcggcctgaactgtccgtacgtaccatttgc
pcr反應(yīng)在50μl體系中進(jìn)行：2×pcrbuffer25μl，2mmdntps10μl，引物f31.5μl，引物r31.5μl，模板dna1μl，kodfx聚合酶1μl，加純水補(bǔ)足到50μl。
pcr反應(yīng)程序如下：
94℃預(yù)變性2min；98℃變性10s，69℃退火30s，68℃延伸90s，30個(gè)循環(huán)；68℃延伸10min。
獲得上述片段后，在gb05-dir菌中用linear-linearhomologousrecombinationmediatedbyfulllengthrecet方法(fu等,2012,full-lengthreceenhanceslinear-linearhomologousrecombinationandfacilitatesdirectcloningforbioprospecting.naturebiotechnology30(5):440-446.)構(gòu)建獲得cel7a克隆質(zhì)粒ptci，經(jīng)檢測(cè)，cel7a編碼基因的核苷酸序列如seqidno.14所示。
實(shí)施例2：碳水化合物結(jié)合區(qū)的點(diǎn)突變
使用點(diǎn)突變?cè)噭┖衚od-plus-mutagensiskit(購自日本東洋紡績(jī)株式會(huì)社)對(duì)構(gòu)建的質(zhì)粒ptci中cel7a的碳水化合物結(jié)合區(qū)進(jìn)行點(diǎn)突變，突變方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，突變后的質(zhì)粒在大腸桿菌trans5α中進(jìn)行擴(kuò)增。點(diǎn)突變引物序列如下：
s14d-f:gtattggctacgatggccccacgg
s14d-r:cgccgcactggccgtagtgagact
s21d-f:ggtctgcgccgatggcacaacttg
s21d-r:gtggggccgctgtagccaataccg
t24d-f:ccagcggcacagattgccaggtcct
t24d-r:cgcagaccgtggggccgctgtagc
經(jīng)過此步驟共獲得五個(gè)含有碳水化合物結(jié)合區(qū)不同位點(diǎn)突變的質(zhì)粒：s14d、s21d、t24d或者s14d/s21d或者s14d/s21d/t24d。
經(jīng)測(cè)序，s14d質(zhì)粒的碳水化合物結(jié)合區(qū)表達(dá)后第14位的絲氨酸替換為天冬氨酸，木質(zhì)纖維素酶的氨基酸序列如seqidno.2所示。
經(jīng)測(cè)序，s21d質(zhì)粒的碳水化合物結(jié)合區(qū)表達(dá)后第21位的絲氨酸替換為天冬氨酸，木質(zhì)纖維素酶的氨基酸序列如seqidno.3所示。
經(jīng)測(cè)序，t24d質(zhì)粒的碳水化合物結(jié)合區(qū)表達(dá)后第24位的蘇氨酸替換為天冬氨酸，木質(zhì)纖維素酶的氨基酸序列如seqidno.4所示。
經(jīng)測(cè)序，s14d/s21d質(zhì)粒的碳水化合物結(jié)合區(qū)表達(dá)后第14位的絲氨酸以及第21位的絲氨酸同時(shí)替換為天冬氨酸，木質(zhì)纖維素酶的氨基酸序列如seqidno.5所示。
經(jīng)測(cè)序，s14d/s21d/t24d質(zhì)粒的碳水化合物結(jié)合區(qū)表達(dá)后第14位的絲氨酸、第21位的絲氨酸以及第24位的蘇氨酸同時(shí)替換為天冬氨酸，木質(zhì)纖維素酶的氨基酸序列如seqidno.6所示。
實(shí)施例3：里氏木霉cel7a中碳水化合物結(jié)合區(qū)的改造
在實(shí)施例2中構(gòu)建獲得的碳水化合物結(jié)合區(qū)突變后的質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后，在大腸桿菌trans5α中進(jìn)行大量克隆擴(kuò)增，獲得的質(zhì)粒通過同源重組的方法轉(zhuǎn)化里氏木霉qm6a的原生質(zhì)體，構(gòu)建獲得含有碳水化合物結(jié)合區(qū)目的位點(diǎn)突變的cel7a表達(dá)菌株。原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化方法參照絲狀真菌轉(zhuǎn)化方法(liu等,2016,regulationofcellulaseexpression,sporulation,andmorphogenesisbyvelvetfamilyproteinsintrichodermareesei.appliedmicrobiologyandbiotechnology100(2):769-779.)。構(gòu)建獲得的轉(zhuǎn)化子用引物對(duì)f4/r4進(jìn)行驗(yàn)證，野生型基因組中擴(kuò)增獲得的片段大小為2121bp，轉(zhuǎn)化子基因組中擴(kuò)增獲得的片段大小為3660bp。獲得的轉(zhuǎn)化子cel7a中碳水化合物結(jié)合區(qū)送交基因公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。f4/r4引物序列如下：
f4:cctcatgctctccccatctactca
r4:gtggtactgggatacacgaagagc
經(jīng)過此步驟共獲得五個(gè)含有碳水化合物結(jié)合區(qū)不同位點(diǎn)突變cel7a突變體的qm6a株，碳水化合物結(jié)合區(qū)突變位點(diǎn)包括s14d、s21d、t24d或者s14d/s21d或者s14d/s21d/t24d。
實(shí)施例4：cel7a及其突變體在里氏木霉中的表達(dá)
上述構(gòu)建獲得含有碳水化合物結(jié)合區(qū)突變位點(diǎn)的cel7a及野生型cel7a在里氏木霉qm6a中進(jìn)行培養(yǎng)表達(dá)。首先將各菌株在麩皮培養(yǎng)基中培養(yǎng)5～7天，待其生孢后，接種至種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；3天后，按照1:10(v/v)的比例將經(jīng)過種子培養(yǎng)階段的菌液接種至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；產(chǎn)酶培養(yǎng)7天后即可收集酶液。
麩皮培養(yǎng)基的配制(100ml)：稱取麩皮1g、玉米芯1g、葡萄糖1g、蛋白胨1g、硫酸銨0.2g、磷酸二氫鉀0.3g、七水硫酸鎂0.09g和碳酸鈣0.5g于300ml三角瓶中，并添加適量微量元素，加入100ml純凈水后滅菌備用。
產(chǎn)酶培養(yǎng)基的配制(200ml)：稱取麩皮6g、玉米芯6g、微晶纖維素1.2g、蛋白胨1g、尿素0.2g、硫酸銨0.8g、磷酸二氫鉀0.6g、七水硫酸鎂0.18g、硝酸鈉0.4g和碳酸鈣1g于1l三角瓶中，并添加適量微量元素，加入200ml純凈水后，吸取0.6ml吐溫-80并沿培養(yǎng)基液面緩緩加入，滅菌備用。
實(shí)施例5：cel7a及其突變體的純化
實(shí)施例4中培養(yǎng)的酶液經(jīng)離心后去除雜質(zhì)，收集上清液(酶液)。
(1)收集后的酶液用濃縮管濃縮，于4℃條件下5000g離心，直至將酶液濃縮至約3ml；
(2)吸取濃縮后的酶液于1.5ml離心管中，12000rpm離心10min去除不溶物，吸取上清酶液于1.5ml離心管中，至于冰上備用；
(3)提前用50mm的tris-hcl緩沖液沖洗分子篩s-400，系統(tǒng)流速設(shè)為0.5ml/min，柱前壓設(shè)為0.5mpa，delta壓設(shè)置為0.3mpa，沖洗大于2倍柱體積(240ml)的緩沖液；
(4)用2.5ml注射器取2ml濃縮酶液上樣；
(5)收集洗脫峰蛋白，sds-page電泳檢測(cè)蛋白；
(6)取電泳檢測(cè)條帶大小合適，純度高的蛋白使用除鹽柱更換蛋白buffer，使用檸檬酸緩沖液(ph4.8)進(jìn)行洗脫；
(7)收集獲得的蛋白質(zhì)濃度使用bradfordkit蛋白濃度試劑盒(購自生工生物工程(上海)股份有限公司)進(jìn)行測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線及測(cè)定方法參照試劑盒說明書。
實(shí)施例6：酸不溶性玉米秸稈木質(zhì)素的制備
取50g玉米秸稈經(jīng)球磨后加入丙酮(玉米秸稈：丙酮的質(zhì)量比為1:10)浸泡24h，用水沖洗10次，烘干后加入37％以上的濃鹽酸(料：鹽酸的質(zhì)量比為1:10)，冰浴處理24h，用水沖洗10次。烘干后加入足量的纖維素酶酶液(蔚藍(lán)生物科技有限公司提供)于45℃處理7天。處理結(jié)束之后加入1％(w/v)sds，37℃處理1h使纖維素酶變性，121℃處理1h，用熱水反復(fù)沖洗10次，烘干后即獲得酸不溶性玉米秸稈木質(zhì)素(acidinsolublecornstoverlignin，aics-lignin)。獲得的木質(zhì)素用兩步酸法分析木質(zhì)素中纖維素和半纖維素的含量，結(jié)果表明制備的木質(zhì)素纖維素含量非常低(0.7％)、半纖維素沒有檢測(cè)到，滿足木質(zhì)素使用要求。
實(shí)施例7：cel7a及其突變體的水解活性檢測(cè)
將實(shí)施例5中純化獲得的cel7a及其突變體、微晶纖維素(購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)以及實(shí)施例6中制備的木質(zhì)素在檸檬酸緩沖液(ph4.8，45℃)并添加少量的葡萄糖苷酶中進(jìn)行旋轉(zhuǎn)孵育48小時(shí)。每一個(gè)反應(yīng)體系中含有60μgcel7a或者其突變體、15μg的β-葡萄糖苷酶、30mg微晶纖維素以及15mgaics-lignin(見實(shí)施例6)，使用檸檬酸緩沖液補(bǔ)足至1ml；每個(gè)反應(yīng)體系重復(fù)兩次。反應(yīng)體系經(jīng)48小時(shí)反應(yīng)后，離心收集上清液，經(jīng)hplc分析上清液中葡萄糖的含量。
結(jié)果表明，cel7a野生型反應(yīng)體系中葡萄糖的濃度為6.2mg/ml，碳水化合物結(jié)合區(qū)s14d突變后的cel7a反應(yīng)體系中葡萄糖的濃度為6.4mg/ml，碳水化合物結(jié)合區(qū)s21d突變后的cel7a反應(yīng)體系中葡萄糖的濃度為7.3mg/ml，碳水化合物結(jié)合區(qū)t24d突變后的cel7a反應(yīng)體系中葡萄糖的濃度為7.8mg/ml，碳水化合物結(jié)合區(qū)s14d/s21d突變后的cel7a反應(yīng)體系中葡萄糖的濃度為8.3mg/ml，碳水化合物結(jié)合區(qū)s14d/s21d/t24d突變后的cel7a反應(yīng)體系中葡萄糖的濃度為8.8mg/ml。以野生型cel7a獲得的葡萄濃度為100％進(jìn)行比較，其他突變體水解活性提高效率見表1。由表1可以看出，碳水化合物結(jié)合區(qū)中s21d突變后，cel7a水解活性提高了18％，t24d突變后提高了26％，雙位點(diǎn)突變s14d/s21d突變后cel7a水解活性提高了34％，而三位點(diǎn)突變s14d/s21d/t24d突變后cel7a水解活性提高了42％，結(jié)果如表1所示。
表1改造前后cel7a水解纖維素活性的比較
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